CN111239314B - 一种几丁寡糖的分离分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种几丁寡糖的分离分析方法。其特征是：几丁寡糖样品经强阳离子交换柱固相萃取，去除可能含有的部分乙酰化壳寡糖和其他杂质；而后用亲水色谱分离分析，结合质谱检测，进而获得结构组成信息。该方法具有操作简单、高选择性、重现性好、高通量的特点，能够有效去除样品中部分乙酰化壳寡糖和其他杂质的干扰，适于几丁寡糖的快速分离分析。

Description

一种几丁寡糖的分离分析方法
技术领域
本发明属于生物化学分析检测领域，涉及一种几丁寡糖的分离分析方法。
技术背景
几丁寡糖(Chitin,GAn)是由N-乙酰葡萄糖胺经β-1,4-糖苷键连接而成的聚合度n为2～7的功能性低聚糖，其分子式为(C8H13NO5)n。作为世界第二大生物质能源几丁质(ColdSpring Harbor Laboratory Press,2009.)的降解产物，几丁寡糖及其衍生物已被广泛应用于生物医药、食品、化妆品、纺织、农业等领域，具有普遍的生物学活性及前景可观的经济效益(Angewandte Chemie International Edition,2014,53(27):6882-6887.)。
目前国内尚未形成几丁寡糖的规模化生产方法，但壳寡糖的生产已经实现规模化，因此有人提出采用壳寡糖乙酰化的方法制备几丁寡糖(CN102993332B)。此外，壳寡糖是由甲壳素先脱乙酰后降解得到，所以几丁寡糖产品中可能会混有部分乙酰化的壳寡糖和其他杂质。因此，为准确判断几丁寡糖样品的组成信息，需要建立一种简单、稳定可靠的几丁寡糖快速分离分析方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种经强阳离子交换固相萃取，联合液相色谱质谱技术分离分析几丁寡糖的方法。
为实现上述目标，本发明采用的技术方案为：
一种几丁寡糖的分离分析方法，其特征在于：几丁寡糖样品经强阳离子交换柱固相萃取，而后用亲水色谱分离分析，结合质谱检测，进而获得结构组成信息。
所述强阳离子交换柱是以硅胶为基质的强阳离子交换萃取柱，键合有苯磺酸官能团。
其中，硅胶为球形或无定形硅胶。
所述强阳离子交换柱固相萃取步骤为：配制一定浓度的几丁寡糖样品溶液作为上样液，此即为萃取前几丁寡糖样品溶液。强阳离子交换柱首先用甲醇活化1-6BV，然后用平衡液平衡1-6BV，接着上样0.01-1BV(固体载样量为0.1-10％)，最后用淋洗液淋洗1-3BV。收集并合并上样流出液和淋洗液，此即为萃取后几丁寡糖样品溶液。
其中，所用淋洗液即为平衡液也即上样液的溶样溶剂，其组成为ACN/H2O/HCOOH＝50/50/0.1(v/v/v)。
所述亲水色谱分离分析条件为：色谱柱：亲水色谱柱，硅胶或极性键合硅胶填料，极性键合基团为酰胺、氨基酸、氨基、羧基、糖基和两性离子等中的一种或几种；柱温：15-60℃；流动相A：水或缓冲盐的水溶液，流动相B：有机溶剂，梯度洗脱，流动相配比为A/B＝5/95～95/5；流速：0.2-2mL/min；样品：萃取前后几丁寡糖样品溶液；检测器：紫外检测器、电喷雾检测器、蒸发光散射检测器或质谱检测器。
其中，硅胶为球形或无定形硅胶。
其中，色谱柱内径为2.1-10mm，柱长为50-250mm，填料粒径1.7-10μm,填料孔径
Figure BDA0001885012330000021
比表面积180-350m2/g。
其中，缓冲盐的种类及其在流动相中的浓度和pH如下：a)甲酸铵缓冲盐，浓度0-200mM，pH 2.0-7.0；b)乙酸铵缓冲盐，浓度0-200mM，pH 2.0-7.0；c)碳酸氢铵缓冲盐，浓度0-200mM，pH 6.0-9.0；
其中，有机溶剂为甲醇、乙腈、乙醇和丙酮中的一种或几种。
其中，紫外检测波长为190-380nm。
其中，质谱检测模式为正离子或负离子模式。
本发明具有如下优点：
1.高选择性。本发明提出的强阳离子交换柱固相萃取的方法只选择性吸附部分乙酰化壳寡糖和其他碱性杂质，对几丁寡糖不产生吸附作用，具有较高的选择性。
2.高重现性。本发明提出先采用强阳离子交换柱固相萃取再进行分离分析的方法，稳定可靠，重现性好，易于实现自动化。
3.高通量。分离分析过程简单、快速，易于实现高通量。
4.适用范围广。针对不同来源的几丁寡糖样品，可以通过优化强阳离子交换柱固相萃取过程以达到最佳的除杂效果。
附图说明
图1为本发明实施例1所述的固相萃取前后几丁寡糖样品的液相对比分析谱图。
图2为本发明实施例1所述的固相萃取前后几丁寡糖样品的液质联用对比分析谱图。
图3为固相萃取前后几丁寡糖样品中部分乙酰化壳寡糖的提取离子对比分析谱图。
具体实施方式
下面结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
实施例1
强阳离子交换柱固相萃取过程：
萃取前几丁寡糖样品溶液(上样液)的配制：称取40mg几丁寡糖固体于离心管中，首先加入1mL水和2μL HCOOH超声溶解，然后加入1mL ACN混匀，最终得20mg/mL萃取前几丁寡糖样品溶液(上样液)约2mL。取1mL用于强阳离子交换柱固相萃取实验，其余经0.22μm滤膜过滤后用于色谱质谱分析。
强阳离子交换柱固相萃取实验：取强阳离子交换固相萃取小柱(1g，苯磺酸键合的球形硅胶，粒径50μm，交换容量0.5meq/g)，首先用6mL甲醇活化，然后用6mL平衡液平衡，接着取1mL上样液上样(固体载样量为2％)，最后用1mL淋洗液ACN/H2O/HCOOH＝50/50/0.1(v/v/v)淋洗。收集并合并上样流出液和淋洗液，此即为萃取后几丁寡糖样品溶液，补加淋洗至总体积约3mL，得约6.7mg/mL萃取后几丁寡糖样品溶液，经0.22μm滤膜过滤后用于色谱质谱分析。
亲水色谱分离分析过程：
在Waters e2695-2489液相色谱系统上，采用华谱新创科技有限公司XAmide(酰胺键合的球形硅胶，键合密度5.4μmol/m2)亲水色谱柱(4.6×150mm,5μm,
Figure BDA0001885012330000031
Figure BDA0001885012330000032
D2014082601,14102302A)为固定相，柱温35℃；梯度洗脱60min，流动相(ACN/H2O,v/v)洗脱强度由80/20增强至56/44，流速1mL/min；萃取前几丁寡糖样品溶液进样5μL，萃取后几丁寡糖样品溶液进样11.5μL，在195nm下检测其紫外吸收，固相萃取前后几丁寡糖样品的液相对比分析谱图如图1所示。
由图1可知，在13-35min的保留时间范围内，萃取前的色谱峰呈凸起状，表明存在一定的杂质；萃取后的色谱峰峰起点和落点都在基线上，表明强阳离子交换固相萃取能对该部分杂质进行有效去除。
质谱检测过程：
在Agilent 1290-6540Q-TOF LC-MS系统上，液相条件同上述亲水色谱分离分析过程，采用正离子模式质谱检测：Q-TOF采用Dual-ESI离子源接口，质量扫描范围m/z 100-1700；脱溶剂气氮气，脱溶剂气温度350℃，流速8L/min；毛细管电压为3500V。Q-TOF系统在正离子模式下采用参比样品进行校正，参比雾化器1psi，参比样品的[M+H]+离子为141.1137,282.2791,922.0117等。整个系统由Agilent Qualitative AnalysisB.04.01software软件进行控制。
通过质谱对几丁寡糖进行了鉴定，不同聚合度的几丁寡糖的分布如图2所示。固相萃取前后几丁寡糖样品中部分乙酰化壳寡糖及其他杂质的提取离子对比分析谱图如图3所示。
由图3可知，部分乙酰化壳寡糖GA3GN1、GA1GN2和与GA4分子量相似的杂质能被有效去除。表明，通过强阳离子交换固相萃取，经亲水色谱分离分析，结合质谱检测的方法，能够有效去除样品中部分乙酰化壳寡糖和其他杂质的干扰，适于几丁寡糖的快速分离分析。
实施例2
与实施例1不同之处在于所使用的强阳离子交换固相萃取小柱为5g。
实施例3
与实施例1不同之处在于亲水色谱分离分析过程采用蒸发光散射检测器检测。其检测条件如下：增益，100；气体压力，30psi；喷雾器：45℃，75％；漂移管，75℃。

Claims (8)

1.一种几丁寡糖的分离分析方法，其特征在于：几丁寡糖样品经强阳离子交换柱固相萃取，去除可能含有的部分乙酰化壳寡糖和其他杂质；而后用亲水色谱分离分析，结合质谱检测，进而获得结构组成信息；
强阳离子交换柱固相萃取步骤为：强阳离子交换柱首先用甲醇活化1-6 倍柱体积，然后用平衡液平衡1-6倍柱体积，接着上样0.01-1倍柱体积，最后用淋洗液淋洗1-3倍柱体积，收集并合并上样流出液和淋洗液；淋洗液、平衡液、上样液的溶样溶剂三者相同；
上样液的溶样溶剂为ACN/H2O/HCOOH=50/50/0.1，添加比例为体积比。
2.按照权利要求1所述分析方法，其特征在于：强阳离子交换柱是以硅胶为基质的强阳离子交换萃取柱，键合有苯磺酸官能团。
3.按照权利要求2所述分析方法，其特征在于：硅胶为球形或无定形硅胶中的一种或二种。
4.按照权利要求1所述分析方法，其特征在于：上样时固体载样量质量浓度为0.1-10%。
5.按照权利要求1或4所述分析方法，其特征在于：上样液即为萃取前几丁寡糖样品溶液；
合并的上样流出液和淋洗液即为萃取后几丁寡糖样品溶液。
6.按照权利要求1所述分析方法，其特征在于：亲水色谱分离分析条件为：色谱柱：亲水色谱柱；柱温：15-60 ℃；流动相A：水或缓冲盐的水溶液，流动相B：有机溶剂；洗脱方式：等度或梯度洗脱；流速：0.2-2 mL/min；样品：萃取前后几丁寡糖样品溶液；检测器：紫外检测器、电喷雾检测器、蒸发光散射检测器或质谱检测器。
7.按照权利要求6所述分析方法，其特征在于：亲水色谱柱为硅胶或极性键合硅胶填料；
硅胶为球形或无定形硅胶中的一种或二种；
极性键合基团为酰胺、氨基酸、氨基、羧基、糖基和两性离子中的一种或几种；
亲水色谱柱柱内径为2.1-10 mm；
亲水色谱柱柱长为50-250 mm；
填料粒径为1.7-10 μm；
填料孔径为60-300 Å；
填料比表面积180-350 m2/g。
8.按照权利要求6所述分析方法，其特征在于：缓冲盐的种类及其在流动相中的浓度和pH如下：
（a）甲酸铵缓冲盐，浓度0-200 mM，pH 2.0-7.0；
（b）乙酸铵缓冲盐，浓度0-200 mM，pH 2.0-7.0；
（c）碳酸氢铵缓冲盐，浓度0-200 mM，pH 6.0-9.0；
有机溶剂为甲醇、乙腈、乙醇和丙酮中的一种或几种；
等度或梯度洗脱时，流动相配比为A/B=5/95~95/5；
紫外检测波长为190-380 nm；
质谱检测模式为正离子或负离子模式。
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