KR101381179B1 - 키토산올리고당 혼합물로부터 올리고당별 분리 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 키토산올리고당 혼합물로부터 올리고당별 분리시 휘발성의 초산암모늄 용리액을 사용함으로써 분리 이후 탈염 과정을 거치지 않고 동결건조 및 감압농축 방법만으로 염을 제거함과 동시에 순도가 높은 개별 키토산올리고당 성분을 분리할 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면 휘발성의 초산암모늄 용리액 사용을 통하여 탈염 공정 없이 키토산올리고당을 당별로 분리할 수 있으므로, 노동력과 생산 비용이 절감되어 저가로 키토산올리고당을 당별로 대량생산하는 것이 가능하고, 이에 따라 분리된 키토산올리고당 각각을 다양한 기능성 활용에 적용시킬 수 있을 뿐만 아니라 키토산올리고당의 부가가치를 높일 수 있다.
본 발명에 따르면 휘발성의 초산암모늄 용리액 사용을 통하여 탈염 공정 없이 키토산올리고당을 당별로 분리할 수 있으므로, 노동력과 생산 비용이 절감되어 저가로 키토산올리고당을 당별로 대량생산하는 것이 가능하고, 이에 따라 분리된 키토산올리고당 각각을 다양한 기능성 활용에 적용시킬 수 있을 뿐만 아니라 키토산올리고당의 부가가치를 높일 수 있다.
Description
본 발명은 키토산올리고당 혼합물을 올리고당별로 분리하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 양이온 교환 수지를 이용하되 휘발성의 용리액을 사용함으로써 올리고당 분리 이후 용리액으로 사용된 염의 전기 투석 등의 탈염 과정을 거치지 않고 동결 건조 및 감압 농축 방법만으로 염을 제거함과 동시에 순도가 높은 개별 키토산 올리고당 성분을 분리할 수 있는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 노동력과 생산 비용이 절감되어 저가로 키토산올리고당을 올리고당별로 대량생산하는 것을 가능하게 하고, 이에 따라 분리된 키토산올리고당 각각을 다양한 기능성 활용에 적용시킬 수 있을 뿐만 아니라 키토산올리고당의 부가가치를 높일 수 있는 올리고당별 분리 방법에 관한 것이다.
키틴은 N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine)이 β-(1-4) 결합으로 중합된 고분자 물질로 게 껍질, 곤충 껍질, 연체동물, 곰팡이의 세포벽 구성 물질이며, 키토산은 보통 키틴을 탈아세틸화하여 얻어진다. 즉, 키토산은 N-아세틸-D-글루코사민 모노머가 β-(1,4) 중합결합된 고분자 다당인 키틴에 알칼리 등을 가하여 N-아세틸-D-글루코사민에서 아세틸기가 떨어져 나가 생성된 D-글루코사민의 비율이 70% 이상일 때 이것을 키토산이라 한다(대한민국 식품의약품 안전청, 식품첨가물공전).
그리고, 다당류 고분자인 키토산을 화학적 분해 또는 효소 분해를 통해 절단한 올리고당을 키토산올리고당이라고 하며 중합된 당의 수에 따라 중합도가 결정된다. 예를 들어, 키토산올리고당의 당의 개수가 2개인 2당인 경우 중합도는 2이고, 키토산올리고당의 당의 개수가 15개인 15당인 경우 중합도는 15가 된다.
키틴 또는 키토산과 달리 키토산올리고당은 물에 가용성 및 체내 흡수성이 상대적으로 우수하고 최근 다양한 생리 기능성이 밝혀지면서 새로운 기능성 물질로 주목받고 있다. 구체적으로, 키토산올리고당 혼합물은 항세균성, 항진균성, 항산화성 및 항돌연변이성 기능이 시험관내(in vitro) 시험에서 알려져 있고, 생체내(in vivo) 시험에서도 항산화성 기능 등이 알려져 있다.
또한, 키토산은 항균성과 더불어 식물의 자기 방어 기능 활성화와 관련한 연구도 활발하게 진행되어 왔다. "카타란투스 로세우스(Catharanthus roseus)의 현탁 세포(Suspension cell) 및 원형질체(protoplast)"에서 키토산 및 키토산올리고당이 칼로오스(callose) 형성을 촉진한다는 것이 보고되었고, 콩에서 키토산 올리고머(chitosan oligomer)가 피사틴(pisatin) 생성을 촉진한다는 것이 보고되었다. 또한, 쌀 세포(rice cell)에서 N-아세틸키토올리고당(N-acetylchitooligosaccharide) 처리가 모밀락톤 A(momilactone A) 유도를 촉진한다고 보고되었으며, 키토산 유도체의 중합도에 따라 피토알렉신(phytoalexin) 유도 함량이 각각 다르게 나타난다는 사실도 보고되었다.
그리고, 밀옆(wheat leave)에서 분자량과 탈아세틸화도가 서로 다른 키토산 유도체를 처리할 경우, 페닐알라닌 암모니아-리아제(phenylalanin ammonia-lyase, peroxidase) 활성 및 리그닌(lignin) 축적 정도를 측정하면 키토산 유도체의 종류에 따라 상이한 결과를 나타나는 것이 보고되었다.
특히, 키토산은 양이온성 고분자 전해질이기 때문에, 그 기능성에 관한 연구가 이루어지면서 의약품, 식품, 화장품, 농업 등의 분야에 대한 다양한 응용이 이루어지고 있다.
이와 관련하여 대한민국 등록특허 제10-0506710호에서는 중합도가 2 ~ 10인 키토산올리고당 아스코르빈산염의 제조방법을 개시하고 있고, 대한민국 등록특허 제10-0518265호에서는 중합도가 2 ~ 15인 키틴올리고당 및 키토산올리고당의 제조방법과 이러한 중합도가 2 ~ 15인 키틴올리고당 및 키토산올리고당이 PPAR 유전자의 발현을 억제한다는 내용을 개시하고 있다.
또한, 대한민국 공개특허 제10-2011-0045284호에서는 키토산 올리고당을 활성성분으로 포함하는 항비만용 조성물이 지방세포 형성과정에서의 주된 전사인자인 PPAR 유전자의 전사를 억제하고 지방세포의 분화를 억제함으로써 항비만활성을 발휘하는 것을 개시하고 있다.
한편, 상기와 같이 키토산 및 키토산올리고당의 기능과 효과에 대한 연구수행 및 연구성과에 따르면 키토산 및 키토산올리고당의 여러 기능과 효능은 화학성, 특히 중합도에 크게 의존하기 때문에, 키토산올리고당의 기능에 대한 연구수행 촉진과 상업적 공급을 위해서는 당별 분리 과정을 통해 혼합물에 함께 존재하는 여러 중합도의 당들을 서로 분리 정제하여 단일 당 제품들을 얻을 수 있어야 한다.
이를 위한 종래 방식의 실험실적 규모로 키토산올리고당을 당별로 분리하는 과정은 도 1에 도시된 바와 같다.
상기 종래 방법은 1) 키토산의 산 및 효소분해, 2) NaCl 용리액으로 농도 구배를 부여하면서 양이온 교환 수지상에서 당별 분리, 3) 당별 분리된 용액에서 투석(dialysis) 등을 통한 탈염 과정을 통해 NaCl 제거, 그리고 4) 마지막으로 동결 건조 및 감압 농축에 의한 수분 제거 후 시료를 얻는 과정으로 되어 있다.
따라서, 이와 같은 종래 방법은 비교적 순수하게 분리된 올리고머 단일 성분을 얻을 수 있는 장점이 있지만 양이온 크로마토그래피 방법에 의해 대량 처리가 제한적인 문제점이 있고 처리 과정에서 일반적으로 사용되는 NaCl 용리액이 투석 과정 등을 통해 제거되어야 하는 과정 등이 필요하므로 공정 규모의 확장을 제약하는 문제점이 있었다.
또한, 키토산올리고당의 기능성과 관련하여 앞서 언급한 선행기술들 역시 키토산올리고당이 PPAR 유전자의 발현을 억제하고 지방세포 분화를 억제하는 기능에 대해 개시하고 있을 뿐, 양이온 크로마토그래피 방법에 의해 키토산올리고당을 당별로 분리할 때 사용되는 NaCl 용리액에 대한 탈염 공정이 필요한 종래 방법의 문제점을 개선하여 간단하고 편리하게 키토산올리고당의 대량 분리 처리가 가능한 새로운 올리고당별 분리 방법에 대해 어떠한 제안이나 암시를 하고 있지 않다.
이에 본 발명자들은 키토산올리고당 혼합물을 올리고당별로 분리하는 종래 방법의 문제점을 감안하여 예의 연구를 거듭한 결과, 키토산올리고당 혼합물로부터 올리고당별 분리시 휘발성의 초산암모늄 용리액을 사용함으로써 분리 이후 탈염 과정을 거치지 않고 동결건조 및 감압농축 방법만으로 염을 제거할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 키토산올리고당 혼합물을 올리고당별로 분리하는 방법으로서, 양이온 교환 수지를 이용하되 휘발성의 용리액을 사용함으로써 올리고당 분리 이후 용리액으로 사용된 염의 전기 투석 등의 탈염 과정을 거치지 않고 동결 건조 및 감압 농축 방법만으로 염을 제거함과 동시에 순도가 높은 개별 키토산올리고당 성분을 분리할 수 있는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
구체적으로, 본 발명에서는 휘발성의 초산암모늄 용리액을 사용하여 키토산올리고당 혼합물로부터 키토산올리고당을 당별로 분리할 수 있는 방법을 제공하고자 하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 노동력과 생산 비용이 절감되어 저가로 키토산올리고당을 올리고당별로 대량생산하는 것을 가능하게 하고, 이에 따라 분리된 키토산올리고당 각각을 다양한 기능성 활용에 적용시킬 수 있을 뿐만 아니라 키토산올리고당의 부가가치를 높일 수 있는 올리고당별 분리 방법을 제공하고자 하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 키토산올리고당 혼합물로부터 올리고당별 분리시 휘발성의 초산암모늄 용리액을 사용함으로써 분리 이후 탈염 과정을 거치지 않고 동결건조 및 감압농축 방법만으로 염을 제거함과 동시에 순도가 높은 개별 키토산올리고당 성분을 분리할 수 있는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 명세서에서 사용되는 키토산올리고당의 중합도는 하기 화학식 1로 정의되는 화합물의 n값으로서 나타낼 수 있다:
화학식 1
예를 들어, 2당의 키토산올리고당은 상기 화학식 1에서 n값이 2이고, 5당의 키토산올리고당은 상기 화학식 1에서 n값이 5가 된다.
본 발명의 키토산올리고당 혼합물로부터 올리고당별 분리 방법은,
(a) 양이온교환수지가 충전된 컬럼을 준비하는 단계와,
(b) 상기 양이온교환수지가 충전된 컬럼에 키토산올리고당 혼합물을 흡착시키는 단계와,
(c) 상기 (b) 단계에서 얻은 컬럼에 대해, 휘발성의 초산암모늄 용리액을 농도구배를 부여하면서 용출시킴으로써 탈염과정없이 키토산올리고당을 당별로 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 키토산올리고당 혼합물로부터 올리고당별 분리 방법에 있어서, 상기 휘발성의 초산암모늄 용리액의 농도구배는 약 0.5N ~ 2.0N의 연속 농도구배일 수 있다. 또한, 상기 휘발성의 초산암모늄 용리액의 용출 속도는 약 1.5ml/분인 것이 바람직하다.
본 발명의 키토산올리고당 혼합물로부터 올리고당별 분리 방법은, 상기 (c) 단계 이후 동결건조 및 감압농축하는 단계를 더 포함한다.
이상과 같이, 본 발명의 일실시예의 키토산올리고당 혼합물로부터 올리고당별 분리 방법에서는 전술한 바와 같은 종래기술의 제한 요인 중 현재까지 키토산올리고당을 당별로 분리하기 위해 개발된 유일한 방법인 양이온 컬럼크로마토그래피 방법은 공정상에 유지하지만, 분리 과정 중 사용되는 NaCl을 휘발성 용리액, 예를 들어 휘발성의 초산암모늄 용리액으로 대체함으로써 키토산올리고당 분리 이후 투석 등의 방법으로 탈염 공정을 추가함이 없이 동결건조 혹은 감압 농축 과정만으로 중합도를 달리하는 키토산올리고당을 분리할 수 있는 방법을 제공하여 공정의 효율성과 공정 규모의 확장성을 높일 수 있다(도 2 참조).
본 발명은 휘발성의 초산암모늄 용리액 사용을 통하여 탈염 공정 없이 키토산올리고당을 당별로 분리할 수 있으므로, 노동력과 생산 비용이 절감되어 저가로 키토산올리고당을 당별로 대량생산하는 것을 가능하게 한다.
이에 따라, 본 발명은 분리된 키토산올리고당 각각을 다양한 기능성 활용에 적용시킬 수 있을 뿐만 아니라 키토산올리고당의 부가가치를 높일 수 있다.
도 1은 종래 방식의 실험실적 규모로 키토산올리고당을 당별로 분리하는 과정을 설명하는 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예의 키토산올리고당 혼합물로부터 키토산올리고당을 당별로 분리하는 과정을 설명하는 개략도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예의 분리방법에 따라 초산암모늄염을 사용하여 단계별 농도 구배(step gradient)를 실시하면 키토산올리고당의 당별 분리가 원활하게 이루어지는 것을 보여주는 HPLC 크로마토그램이다. 도 3에서 초산암모늄 용액의 농도가 0인 경우에서는 올리고머가 검출되지 않았고(녹색선), 1N 농도에서는 2당, 3당의 올리고머가 검출되었고(적색선), 2N 농도에서는 4당, 5당, 6당, 7당의 올리고머가 배타적으로 검출되었다(청색선).
도 4는 본 발명의 일실시예의 분리방법에 따라 0.5N~2N 초산암모늄 용리액을 이용하여 연속 농도 구배 방법(continuous gradient)에 의해 키토산올리고당을 분리하였을 경우 키토산올리고당이 당별로 분리가 잘 이루어지는 것을 보여주는 크로마토그램이다.
도 2는 본 발명의 일실시예의 키토산올리고당 혼합물로부터 키토산올리고당을 당별로 분리하는 과정을 설명하는 개략도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예의 분리방법에 따라 초산암모늄염을 사용하여 단계별 농도 구배(step gradient)를 실시하면 키토산올리고당의 당별 분리가 원활하게 이루어지는 것을 보여주는 HPLC 크로마토그램이다. 도 3에서 초산암모늄 용액의 농도가 0인 경우에서는 올리고머가 검출되지 않았고(녹색선), 1N 농도에서는 2당, 3당의 올리고머가 검출되었고(적색선), 2N 농도에서는 4당, 5당, 6당, 7당의 올리고머가 배타적으로 검출되었다(청색선).
도 4는 본 발명의 일실시예의 분리방법에 따라 0.5N~2N 초산암모늄 용리액을 이용하여 연속 농도 구배 방법(continuous gradient)에 의해 키토산올리고당을 분리하였을 경우 키토산올리고당이 당별로 분리가 잘 이루어지는 것을 보여주는 크로마토그램이다.
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예 1
실시예 1-1: 키토산의 효소 분해
98% 초산과 탈아세틸화도 95%인 키토산을 준비하였다. 준비한 초산 350g을 8.5ℓ의 물에 넣어 용해시켜 초산용액을 준비하였다. 여기에 키토산 840g을 첨가하여 40~60℃에서 1~4 시간 동안 잘 저어주면서 완전히 용해시켜 키토산 용액을 제조하였다. 이와 같이 제조된 키토산 용액에 키토산 분해 효소(chitosan N.acetylglucosaminohydrolase EC 3,2,1,132; 시그마사) 1,000 유닛(unit)을 첨가한 뒤, 45℃에서 10~40 시간 동안 분해시켜 키토산올리고당을 만든 후 동결건조하여 키토산올리고당 분말을 제조하였다.
이와 같이 준비된 키토산올리고당 분말 시료의 올리고당 분포는 하기의 표 1과 같다.
표 1: 키토산올리고당 분말의 당성분 함량
실시예 1-2: 양이온교환수지에 의한 올리고당별 분리(3ml 부피 컬럼)
양이온교환수지(Sephadex c-25, 40~120 ㎛, Pharmacia Fine Chemicals) 약 10g을 취해 150 ㎖의 0.02 M 아세테이트 완충용액(acetate buffer)(pH 4.5)에 하룻밤 동안 방치하였다. 상등액을 버리고 동일한 완충용액으로 전술한 과정을 반복하여 양이온교환수지를 세척하고 재생하였다.
재생된 수지를 10 ㎖ 유리컬럼에 3 ㎖의 부피가 되도록 충전한 후 세척 시 사용한 완충용액 약 10 ㎖로 컬럼을 세척하였다. 이와 같이 준비된 컬럼에, 실시예 1-1에서 준비된 키토산올리고당 분말 시료를 20 % 농도로 녹인 용액을 200 ㎕ 흡착시켰다. 10분간 방치한 후 용리액(eluent) 10 ㎖로 용출시키고 용출액을 수집한 후 이를 분석에 사용하였다.
예비실험에 사용된 용리액(eluent)으로는 종래 기술에서 사용하였던 NaCl 용액 이외에, 휘발성염인 NH4OH, 초산 암모늄(Ammonium acetate) 용액을 사용하였다. 단계별 농도 구배(step gradient)는 NaCl 용액의 경우 0.02 M 아세테이트 완충용액(pH 4.5) 내에서 0, 0.5N, 1N, 2N 순으로 차례대로 시험하였고, 다른 2개의 염의 경우도 동일하게 실험하였다.
그리고, 용출액은 환원당 검출법(somogyi-nelson 방법)과 HPLC 방법을 통해 분리 여부를 확인하였다.
실시예 1-3: 키토산올리고당 분리 결과
실시예 1-2에서 용리액으로서 NaCl 완충액과 초산암모늄 완충액을 사용한 경우, 환원당 측정 방법을 통해 정성적으로 0.5 N 이상에서 확인되었으나 NH4OH의 경우에는 다소 다른 경향을 보여 주었다.
NH4OH의 경우 용출 후 시료 정제 과정에서의 편의성을 생각해서 테스트하였는데 강염기라는 조건 때문에 적은 농도의 경우에도 -NH2 양이온 전하를 탈락시켜 초기에 모두 용출되는 경향을 보여주었고 따라서 당별 분리가 용이하지 않음을 알 수 있었다.
반면에, NaCl 완충액과 초산암모늄 완충용액의 경우에는 분리 후 정제 과정에서 다량의 용리액(eluent)에 포함된 염을 제거하는 문제가 있었는데, 휘발성 염인 초산암모늄의 경우에는 열이나 동결건조 과정에서 제거가 용이한 장점이 있어서 올리고당 분리만 문제가 없다면 공정에 채택하기에 가장 적합하다고 사료되었다.
이와 관련하여 도 3은 초산암모늄염을 사용한 단계별 농도 구배(step gradient) 방법에 의해 키토산올리고당의 당별 분리가 원활하게 이루어지는 것을 보여주는 HPLC 크로마토그램이다. 즉, 초산암모늄 용액의 농도가 0인 경우에서는 올리고머가 검출되지 않았고(녹색선), 1N 농도에서는 2당, 3당의 올리고머가 검출되었고(적색선), 2N 농도에서는 4당, 5당, 6당, 7당의 올리고머가 배타적으로 검출되었다(청색선).
이와 같은 결과는 단계별 농도 구배(step gradient)를 수행하여 얻은 결과이기 때문에 초산암모늄을 사용한 연속 단계별 농도 구배(continuous step gradient) 방법에 의해서도 키토산올리고당의 당별 분리 가능성이 높다고 판단되었다.
실시예 2
실시예 2-1: 키토산의 효소 분해
실시예 1-1에 서술된 방식에 따라 키토산올리고당 분말 시료를 준비하였다.
실시예 2-2: 양이온교환수지에 의한 올리고당별 분리(스케일 업(scale up)- 300ml 부피 컬럼)
양이온교환수지(Sephadex c-25, 40~120 ㎛, Pharmacia Fine Chemicals) 약 50g을 취해 1000 ㎖의 0.02 M 아세테이트 완충용액(acetate buffer)(pH 4.5)에 하룻밤 동안 방치하였다. 상등액을 버리고 동일한 완충용액으로 전술한 과정을 반복하여 양이온교환수지를 세척하고 재생하였다.
재생된 수지를 3(Ф)×50(높이)cm 컬럼에 300ml의 부피가 되도록 충전한 후 세척 시 사용한 완충용액 1000 ㎖로 컬럼을 세척하였다. 이와 같이 준비된 컬럼에, 실시예 2-1에서 준비한 키토산올리고당 분말 시료를 20% 농도로 녹인 용액을 2ml 흡착시켰다. 10분간 방치한 후 초산암모늄 용액이 0.5N ~ 2.0N의 연속 농도 구배(continuous gradient)가 되도록 하면서 1.5ml/분 속도로 용출시켜서 올리고당 분리를 하였다.
용출액은 환원당 검출법(somogyi-nelson 방법)과 HPLC 방법을 통해 분리 여부를 확인하였다.
실시예 2-3: 키토산올리고당 분리 결과
초산암모늄 용리액을 이용하고 컬럼의 부피를 증가시켜 0.5N ~ 2N의 연속 농도 구배 방법(continuous gradient)에 의해 키토산올리고당을 분리하였을 때 환원당 검출 결과는 도 4에 도시된 바와 같았다. 도 4에 도시된 바와 같이, 0.5N ~ 2N 초산암모늄 용리액을 이용하여 연속 농도 구배 방법에 의해 키토산올리고당을 분리하였을 경우, 올리고당이 당별로 분리가 잘 이루어지는 것을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명과 같이 휘발성의 초산암모늄을 용리액으로 사용할 경우 별도의 탈염공정 없이 키토산올리고당을 당별로 효과적으로 분리할 수 있다.
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
Claims (4)
- (a) 양이온교환수지가 충전된 컬럼을 준비하는 단계와,
(b) 상기 양이온교환수지가 충전된 컬럼에 키토산올리고당 혼합물을 흡착시키는 단계와,
(c) 상기 (b) 단계에서 얻은 컬럼에 대해, 휘발성의 초산암모늄 용리액을 농도구배를 부여하면서 용출시킴으로써 탈염과정없이 키토산올리고당을 당별로 수득하는 단계를 포함하고,
건조과정에 의해 상기 휘발성의 초산암모늄 용리액을 제거하는 것을 특징으로 하는 키토산올리고당 혼합물로부터 올리고당별 분리 방법. - 제1항에 있어서,
상기 휘발성의 초산암모늄 용리액의 농도구배는 0.5N ~ 2.0N의 연속 농도구배인 것을 특징으로 하는, 키토산올리고당 혼합물로부터 올리고당별 분리 방법. - 제2항에 있어서,
상기 휘발성의 초산암모늄 용리액의 용출 속도는 1.5ml/분인 것을 특징으로 하는, 키토산올리고당 혼합물로부터 올리고당별 분리 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 (c) 단계 이후 동결건조 및 감압농축하는 단계를 더 포함하는, 키토산올리고당 혼합물로부터 올리고당별 분리 방법.
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