CN108663464B

CN108663464B - 检测水果蔬菜或土壤中的环酰菌胺的方法

Info

Publication number: CN108663464B
Application number: CN201710215925.1A
Authority: CN
Inventors: 许振岚; 吴珉; 张昌朋; 赵华; 何红梅; 汤涛; 俞建忠; 李岗; 蒋金花; 王彦华; 陈列忠
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-04-01
Filing date: 2017-04-01
Publication date: 2021-05-04
Anticipated expiration: 2037-04-01
Also published as: CN108663464A

Abstract

本发明提供一种检测蔬菜水果中环酰菌胺的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1)、称取5g样品于50mL离心管中，加入5mL乙腈，涡旋1分钟，4000r/min离心5min后，收集上清液，再用5mL乙腈提取一次，收集并合并提取液，通过旋转蒸发去除乙腈后，用蒸馏水定容至10mL，待净化；2)、净化的步骤包括：提供MAX小柱，3cc/60mg，用3mL甲醇和3mL水分别按照顺序添加进行活化MAX小柱，将10mL样品全部上样，分别依次用1mL 2％氨水和2mL甲醇淋洗，用吸耳球吹干MAX小柱中的液体；2mL的1％甲酸甲醇溶液洗脱MAX小柱，洗脱液在40℃条件下浓缩干，用甲醇定容到2.0mL，过0.22μm滤膜，进行检测。通过本发明的方法，可以提高检测的最低阀值，提高了检测的灵敏度。

Description

检测水果蔬菜或土壤中的环酰菌胺的方法

技术领域

本发明属于分析检测领域，特别的，属于环酰菌胺在蔬菜、水果和土壤中的分析检测方法

背景技术

环酰菌胺(fenhexamid)是一种酰胺类保护性杀菌剂，可抑制真菌孢子萌发和菌丝体生长.主要用于防治园艺作物及蔬菜上各种灰霉病及相关菌核病、黑斑病等。环酰菌胺在环境中降解较快，不易挥发.与生态具有良好的相容性，使用量大。

环酰菌胺(fenhexamid)的化学名称为N-(2,3-二氯-4-羟基苯基)-1-甲基-环己基甲酰胺；化学结构式为

分子式C₁₄H₁₇Cl₂NO₂，分子量302.20。环酰菌胺熔点为153.8℃，沸点为230℃软化。难溶于水，易溶于丙酮、二氯甲烷、异丙醇、乙腈，可溶于甲苯，不溶于正己烷。

环酰菌胺在农产品中的分析多采用气相色谱法和液相色谱串联质谱法。净化方法一般采用基质分散方法，用N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、C18的组合，或者固相萃取柱(硅胶柱、弗罗里硅土柱或者石墨化碳-氨基复合柱)，最低检测浓度为1.20μg/kg。郭庆龙等采用高效液相色谱串联质谱法测定了水果中环酰菌胺的残留，样品经溶剂提取，PSA和C18基质分散净化后，用仪器检测。成云峰等研究并建立了环酰菌胺在番茄中的残留分析方法，样品经乙腈提取，并溶剂转化为丙酮-正己烷后，用气相色谱检测。这些方法虽然方便，但是净化效果不理想，易对仪器造成污染。有待对这些方法进行改进。

发明内容

为了改进现有的方法，本发明提供一种蔬菜水果中环酰菌胺的提取和净化的方法，该方法包括以下步骤：

1)、称取5g样品于50mL离心管中，加入5mL乙腈(含有0.1％的甲酸)，涡旋1分钟，4000r/min离心5min后，收集上清液，再用5mL乙腈(含有0.1％的甲酸)提取一次，收集并合并提取液，通过旋转蒸发去除乙腈后，用蒸馏水定容至10mL，待净化；

2)、提供MAX小柱，3cc/60mg，用3mL甲醇和3mL水分别按照顺序添加进行活化MAX小柱，将10mL样品全部上样，分别依次用1mL2％氨水和2mL甲醇淋洗，用吸耳球吹干MAX小柱中的液体；2mL的1％甲酸甲醇溶液洗脱MAX小柱，洗脱液在40℃条件下浓缩干，用甲醇定容到2.0mL，过0.22μm滤膜，进行检测。

在一些优选的方式中，样品上样结束后，用1mL2％氨水淋洗。我们惊讶的发现，如果不用1mL2％氨水淋洗，环酰菌胺有可能不能完全被保留到MAX小柱上，这取决于上样水溶液的pH值。如果上样之前先调节样品pH使其大于等于8(pH值大于环酰菌胺的pKa值＝7.3)，然后再上样，不管是否用1mL2％氨水淋洗，环酰菌胺都可以被MAX小柱完全保留；相反，如果上样之前不调节pH或调节pH小于8，则必须用1mL2％氨水淋洗，以确保环酰菌胺在MAX小柱上可以完全保留。因此，综合以上，我们采用不调节样品pH值，直接上样，而后用1mL2％氨水淋洗的方法来保证环酰菌胺被柱子完全保留，又可以省略调pH的步骤，提高方法的可操作性。

我们也发现氨水浓度在0.1％-10％之间均可以保证环酰菌胺在MAX小柱的完全保留，故在本发明中选用浓度为2％的氨水。

在一些优选的方式中，淋洗结束后，用2mL的1％甲酸甲醇溶液洗脱。我们发现用1mL的1％甲酸甲醇溶液洗脱就能保证环酰菌胺的回收在90％左右，本发明中用2mL的1％甲酸甲醇溶液洗脱，是为了确保环酰菌胺能被完全洗脱下来，而再提高1％甲酸甲醇溶液洗脱液的量时，会把更多的杂质洗脱下来，不利于样品的净化。

我们也发现甲酸浓度在0.1％-5％之间均可以保证环酰菌胺从MAX小柱的完全洗脱，故在本发明中选用浓度为1％的甲酸甲醇洗脱液。

在一些方式中，蔬果样品可以被任何样品替代，例如，为了检测土壤中的环酰菌胺，一般先从土壤中进行环酰菌胺的提取，然后再经过处理后，最终进行环酰菌胺的测定。从土壤中提取环酰菌胺的方法如下：

1)、称取土壤样品2g(精确至0.01g)，加入5mL乙腈(含有0.1％的甲酸)，涡旋1分钟，4000r/min离心5min后，收集上清液，再用5mL乙腈(含有0.1％的甲酸)提取一次，收集并合并提取液，通过旋转蒸发去除乙腈后，用蒸馏水定容至10mL，待净化；

蔬果样品可以被水样替代，例如田水或地表水，一般田水可以直接上样，然后再经过处理后，最终进行环酰菌胺的测定。从水样中提取环酰菌胺的方法如下：

1)、量取水样10mL，待处理；

在一些优选的方式中，测定采用超高效液相色谱进行测定，测定的条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH(1.7μm，2.1×100mm，Waters公司)。流动相：乙腈/0.1％甲酸水溶液＝70/30；流速：0.2mL/min；柱温：40℃；进样量：2μL。

在一些优选的方式中，毛细管电压：4.0KV；离子源温度：400℃；DL管温度：250℃；雾化气流量3.0L/min；加热气流量：10.0L/min；定量模式：MRM模式；电离方式：ESI⁺；母离子：302.0；Q1偏转电压-20V；碰撞能量为-24eV、Q3偏转电压为-19V的定量离子：97.2；碰撞能量为-36eV、Q3偏转电压为-22V的定性离子：55.10。

有益效果

国内外关于环酰菌胺在各种基质中的前处理方法是提取后直接进行检测的方法，或者是采用硅胶/弗罗里硅土固相萃取小柱净化，或者是采用基质分散方法，用PSA、GCB、C18的组合，虽然过程简便，但是净化效果不理想，容易造成检测仪器的污染。本方法的前处理过程简单，省去了大量有机溶剂的使用，回收率高，重复性好，净化分离效果好，而且最低检测浓度比较低，适合于环酰菌胺在土壤、水、蔬菜和水果中的分析检测；环酰菌胺在土壤、草莓、葡萄、番茄、黄瓜和水中的最低检测浓度为0.002mg/kg。

附图说明

图1为环酰菌胺标准曲线。

图2为环酰菌胺0.1mg/L标准溶液色谱图

具体实施方式

1材料与方法

1.1主要仪器设备和化学试剂

超高效液相色谱串联质谱仪(LCMS8050，岛津公司)、

涡旋仪(MX-S，大龙兴创实验仪器(北京)有限公司)、

R-201型旋转蒸发器(上海申胜生物技术有限公司)、

乙腈(色谱纯Honeywell 4L，Burdick&Jackson公司)、

甲醇(色谱纯Honeywell 4L，Burdick&Jackson公司)、

甲酸(99％，HPLC 1L，Anaqua company)、

MAX小柱(3cc/60mg,Waters公司)

滤膜(0.22μm，型号为TQP-61322,Pall公司)

1.2方法

1.2.1仪器条件

超高效液相色谱条件：

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH(1.7μm，2.1×100mm，Waters公司)。流动相：乙腈/0.1％甲酸水溶液＝70/30；流速：0.2mL/min；柱温：40℃；进样量：2μL。

质谱条件：毛细管电压：4.0KV；离子源温度：400℃；DL管温度：250℃；雾化气流量3.0L/min；加热气流量：10.0L/min；定量模式：MRM模式；电离方式：ESI⁺；母离子：302.0；Q1偏转电压-20V；碰撞能量为-24eV、Q3偏转电压为-19V的定量离子：97.2；碰撞能量为-36eV、Q3偏转电压为-22V的定性离子：55.10。

1.2.2提取和净化

蔬菜水果中环酰菌胺的提取和净化：

称取5g样品于50mL离心管中，加入5mL乙腈(含有0.1％的甲酸)，涡旋1分钟，4000r/min离心5min后，收集上清液，再用5mL乙腈(含有0.1％的甲酸)提取一次，收集并合并提取液，通过旋转蒸发去除乙腈后，用蒸馏水定容至10mL，待净化。

净化(MAX小柱，3cc/60mg,Waters公司)：用3mL甲醇和3mL水分别按照顺序添加进行活化MAX小柱，将10mL样品全部上样，分别依次用1mL 2％氨水和2mL甲醇淋洗，用吸耳球吹干MAX小柱中的液体；2mL的1％甲酸甲醇溶液洗脱MAX小柱，洗脱液在40℃条件下浓缩干，用甲醇定容到2.0mL，过0.22μm滤膜，进行检测。

实验过程必须用1mL 2％氨水淋洗。由于水溶液没有调节pH，不能保证环酰菌胺的完全电离，使得上样后，环酰菌胺在MAX小柱上的保留不完全，而用1mL 2％氨水淋洗后，可以保证环酰菌胺完全解离并被MAX小柱完全保留。1mL2％氨水淋洗后，用甲醇淋洗掉一些杂质，再用洗脱液(1％甲酸甲醇溶液)洗脱环酰菌胺，从而达到净化环酰菌胺的目的。

土壤中环酰菌胺的提取和净化：

称取土壤样品2g(精确至0.01g)，加入5mL乙腈(含有0.1％的甲酸)，涡旋1分钟，4000r/min离心5min后，收集上清液，再用5mL乙腈(含有0.1％的甲酸)提取一次，收集并合并提取液，通过旋转蒸发去除乙腈后，用蒸馏水定容至10mL，待净化。

水样中提取环酰菌胺的方法如下：

量取水样10mL，待处理；

MAX小柱是混合型阴离子交换固相萃取小柱，提供了离子交换和反相双重保留模式，而且保留作用发生在一种洁净、稳定、高表面积、在pH 0-14范围内稳定的有机共聚物上。

1结果

1.1分析方法线性关系的测定

用甲醇配制0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2mg/L的环酰菌胺标准溶液，分别进样2μL，获得UPLC-MS/MS的响应值(见表1)，以浓度-峰面积绘制环酰菌胺标准溶液曲线(见图1)，其回归方程为y＝12232277.6x+7454.5(R²＝0.9991)。

表1环酰菌胺标准曲线

2.2方法的回收率和检出限

根据环酰菌胺在超高效液相色谱串联质谱仪的响应情况，在0.002～5.0mg/kg范围内分别设定了3种添加浓度，每种添加浓度设5个重复。

根据环酰菌胺在超高效液相色谱串联质谱仪上的响应情况，环酰菌胺在土壤、草莓、葡萄、番茄、黄瓜和水样品中设定了3档添加浓度(0.002、0.02和5.0mg/kg)，每档添加浓度设5个重复。

按上述提取、净化及测定步骤，进行添加回收率试验。得到土壤、草莓、葡萄、番茄、黄瓜和水样品中环酰菌胺的添加回收率和相对标准偏差(RSD)，见表2。由表2可知，环酰菌胺在土壤中添加浓度为0.002、0.02和5.0mg/kg时，平均回收率分别为88％、90％和85％，相对标准偏差分别为2.8％、3.8％和4.8％。环酰菌胺在草莓中添加浓度为0.002、0.02和5.0mg/kg时，平均回收率分别为90％、79％和77％，相对标准偏差分别为8.0％、1.6％和0.7％。环酰菌胺在葡萄中添加浓度为0.002、0.02和5.0mg/kg时，平均回收率分别为84％、82％和93％，相对标准偏差分别为4.0％、4.0％和3.7％。环酰菌胺在番茄中添加浓度为0.002、0.02和5.0mg/kg时，平均回收率分别为86％、85％和94％，相对标准偏差分别为3.7％、3.7％和4.6％。环酰菌胺在黄瓜中添加浓度为0.002、0.02和5.0mg/kg时，平均回收率分别为84％、83％和85％，相对标准偏差分别为3.5％、5.3％和4.8％。环酰菌胺在水中添加浓度为0.002、0.02和5.0mg/kg时，平均回收率分别为93％、93％和95％，相对标准偏差分别为2.8％、4.0％和4.0％。

超高效液相色谱串联质谱仪对环酰菌胺的最小检出量为4×10^-12g。

根据环酰菌胺在超高效液相色谱串联质谱仪上的响应情况，以及各样品基质中环酰菌胺最低添加浓度0.002mg/L的样品在仪器上响应值均大于仪器的3倍信号噪音比，得出：环酰菌胺在蔬菜水果、土壤和水的最低检测浓度为0.002mg/kg。

因此该方法完全满足农药残留分析中对准确度、精密度和灵敏度的要求。

表2环酰菌胺的添加回收率

3结论

本发明建立了蔬菜水果中环酰菌胺的分析检测方法。该方法环酰菌胺在0.002～0.2mg/L浓度范围内呈良好的线性关系；环酰菌胺在土壤、草莓、葡萄、番茄、黄瓜和水样品中平均回收率为77～95％，相对标准偏差分别为0.7～8.0％。最低检测浓度为0.002mg/kg。该方法操作简便，准确可靠、可满足农药残留分析的要求，并可用于大量样品的快速检测。

在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下，可以实现本文所示和所述的发明。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制，并且不希望在这些术语和表达法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而且应该认识到各种改型在本发明的范围内都是可行的。因此应该理解，尽管通过各种实施例和可选的特征具体公开了本发明，但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人员所采用，并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。

本文中所述或记载的文章、专利、专利申请以及所有其他文献和以电子方式可得的信息的内容在某种程度上全文包括在此以作参考，就如同每个单独的出版物被具体和单独指出以作参考一样。申请人保留把来自任何这种文章、专利、专利申请或其他文献的任何及所有材料和信息结合入本申请中的权利。

Claims

1.一种检测水果、蔬菜或者土壤中环酰菌胺的方法，其特征在于，该方法由以下顺序的步骤组成：

1)、称取5g样品于50mL离心管中，加入5mL乙腈，涡旋1分钟，4000r/min离心5min后，收集上清液，再用5mL乙腈提取一次，收集并合并提取液，通过旋转蒸发去除乙腈后，用蒸馏水定容至10mL，待净化，其中，所述的乙腈含有0.1％的甲酸；

2)、提供MAX小柱，3cc/60mg，用3mL甲醇和3mL水分别按照顺序添加进行活化MAX小柱，将10mL样品全部上样，分别依次用1mL2％氨水和2mL甲醇淋洗，用吸耳球吹干MAX小柱中的液体；2mL的1％甲酸甲醇溶液洗脱MAX小柱，洗脱液在40℃条件下浓缩干，用甲醇定容到2.0mL，过0.22μm滤膜，进行检测;

其中，测定的条件为：色谱柱：1.7μm，2.1×100mm 的ACQUITY UPLC BEH；流动相：乙腈/0.1％甲酸水溶液＝70/30；流速：0.2mL/min；柱温：40℃；进样量：2μL；质谱条件：毛细管电压：4.0KV；离子源温度：400℃；DL管温度：250℃；雾化气流量3.0L/min；加热气流量：10.0L/min；定量模式：MRM模式；电离方式：ESI⁺；母离子：302.0；Q1偏转电压-20V；碰撞能量为-24eV、Q3偏转电压为-19V的定量离子：97.2；碰撞能量为-36eV、Q3偏转电压为-22V的定性离子：55.10。