CN107884502B - 一种土壤中阿维菌素残留量的检测方法 - Google Patents

Abstract

一种土壤中阿维菌素残留量的检测方法，它涉及一种土壤中阿维菌素残留量的检测方法，该方法包括对照品溶液的制备、供试品溶液的制备，之后采用超高效液相色谱串联质谱法以梯度洗脱的方式将上述标准品溶液和供试品溶液注入仪器中，根据内标法计算阿维菌素残留。本发明通过对色谱和质谱条件的优选及供试品、标准品制备方法的试验，建立了土壤中阿维菌素的超高效液相色谱串联质谱检测分析方法；通过对色谱以及质谱条件的优化，建立了土壤中阿维菌素的检测方法，通过方法学验证试验研究表明：所建立的方法准确度高、专属性强、重现性良好，能有效检测土壤中阿维菌素残留量。

Description

一种土壤中阿维菌素残留量的检测方法

技术领域

本发明涉及土壤的检测检验技术领域，特别是涉及一种土壤中阿维菌素残留的检测方法。

背景技术

在我国，农业及畜牧业的规模越来越大，为了促进植物生长以及防病治病，农用抗生素使用量也随之增加，由此而产生的抗生素滥用问题愈发严重。农用抗生素的最终环境归宿为土壤，多数农药进入环境后并没有发挥应有的药效而是直接进入土壤及水体中，针对土壤环境，其残留对土壤动物、微生物及土壤酶活性产生影响，破坏生态环境，经食物链作用也可能进入人体。农用抗生素作为一种新的环境污染物所引起的危害不容忽视，必须高度重视。建立土壤中不同种类抗生素的痕量检测分析方法成为比较热门的探索方向。但土壤中的抗生素主要是对于四环素类抗生素的分析检测，阿维菌素的检测报道比较少见，且土壤基质不同提取和净化条件的选择也有所不同。

我国主要应用发酵法来生产阿维菌素，自八十年代引入了阿维菌素链霉菌，对其工艺的菌株培育、提取、发酵、纯化等各个步骤都有深入创新研究，并在农畜业及医疗方面得到了广泛的应用。现在，我国已成为阿维菌素唯一生产国，全部替代进口，中国企业已成立阿维菌素产业联盟，并已拥有上市公司。年产值达30亿。2013年，总产能达5500t左右。

由于阿维菌素残留在土壤中会威胁到生态平衡，故为了研究阿维菌素菌渣有机肥在土壤中环境行为、稳定性及衰减规律，必须首先建立土壤中阿维菌素残留的检测方法。由于基质效应的影响及检测限的要求，故不同于菌渣已建立的方法，需要重新建立在土壤中目标物质残留的检测方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术存在检测限较高、不灵敏；没有一种有效解决基质效应的影响，且现有技术无法快速/准确检测土壤中阿维菌素残留量的问题，而提供了一种土壤中阿维菌素残留量的检测方法。

本发明的一种土壤中阿维菌素残留量的检测方法，它是按照以下步骤进行的：

一、供试品样品制备：

1)称取含有阿维菌素的土壤，加入甲氨基阿维菌素苯甲基盐、乙腈和去离子水，涡旋均质45～60s，超声辅助提取18～20min，而后置于离心机内，以3500～4000r/min离心8～10min，收集上清液，将收集的沉淀保存备用；

2)向上一步收集的沉淀中，加入甲氨基阿维菌素苯甲基盐、乙腈和去离子水，涡旋均质45～60s，超声辅助提取18～20min，而后置于离心机内，以3500～4000r/min离心8～10min，收集上清液；

3)将步骤1)和步骤2)收集的上清液合并后，定容，得待浸化样品；

4)取乙腈和活化液对HLB固相萃取柱进行活化，加入待浸化样品，以0.5～1.5mL/min流速过柱，待样液全部流出，用淋洗剂正己烷进行淋洗，用洗脱液洗脱待分析物，抽干所有的液体并收集，用氮吹仪吹近干，并加甲醇复溶，均质45～60s，过0.22μm滤膜后，得供试品溶液；

二、标准曲线绘制：

取阿维菌素标准贮备液，用甲醇稀释，配制成浓度梯度为1～1000μg/L的标准工作溶液，每一个梯度的标准工作溶液内都含有1μg/L的甲维盐，使用超高效液相色谱-串联四级杆质谱仪进行检测；以阿维菌素峰面积与甲维盐峰面积比值作为纵坐标，以从1～1000μg/L的标准工作溶液中随机选取的标准工作溶液浓度作为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数；

三、测定：吸取上述标准工作品溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱-串联四级杆质谱仪中，根据内标法计算阿维菌素残留量；

色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C₁₈柱，色谱柱内径为2.1mm，柱长50mm，填料颗粒直径为1.7μm，柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样量12μL；流动相：有机相为色谱纯甲醇，无机相为含10mM氨的水溶液并用甲酸调pH至4，洗脱条件如下：

0～2min，75％A₁～25％B₁；

2～2.1min，由75％A₁～25％B₁调节为85％A₁～15％B₁；

2.1min～5min，85％A₁～15％B₁；

5～5.1min，由85％A₁～15％B₁调节为75％A₁～25％B₁；

5.1～6min，75％A₁～25％B₁；

其中，A₁为有机相，B₁为无机相；

质谱条件：

ESI电喷雾离子源；

正离子扫描模式；

采集方式：MRM；

离子源内毛细管电压：4kV；

锥孔电压：45V；

去溶剂气温度：400℃；

离子源温度：150℃；

脱溶剂气流量：900L/Hr；

锥孔气流量：60L/hr。

本发明包含以下有益效果：

本发明研究并建立了在土壤当中，阿维菌素残留量的固相萃取-超高效液相色谱串联质谱检测的方法。

本发明经实验研究，整理完善出关于土壤中阿维菌素残留量的固相萃取-超高效液相色谱串联质谱检测方法，该方法经过验证具有较好的重复性和实用性，为我国微生物制药菌渣的科学有效管理、安全与最大程度资源化、实现低碳经济与循化经济发展提供依据。

本发明使用内标法进行基质效应校正，标准曲线线性良好，方法准确度高、专属性强、重现性良好，并取得高效分离，有效检测土壤中的阿维菌素残留量。

本发明向土壤样品中加标浓度为50μg/kg、500μg/kg的阿维菌素。按照已建立的方法，对同一批次样品一天内5次检验，连续5天对不同批次样品进行一次检验。日间回收率81.5～107.2％，日内相对标准偏差(RSD)<15％，日内回收率82～108.2％，日间RSD<15％。

通过本发明的方法可以有效地从土壤中提取阿维菌素，尽最大可能降低土壤中其他杂质对后续检测的影响，从而提高检测的准确度。

附图说明

图1为实施例1的标准曲线图；其中，回归方程为y＝2.759x+0.053；R²＝0.997；

图2为实施例1的100μg/L阿维菌素标准品甲醇溶液选择离子流测定图；

图3为实施例1的1μg/L甲维盐标准品甲醇溶液选择离子流测定图；

图4为实施例1的100μg/L阿维菌素和1μg/L甲维盐标准品甲醇溶液总离子流测定图；

图5为实施例1的含有500μg/kg阿维菌素土样预处理后选择离子流图；

图6为实施例1的含有1μg/kg甲维盐土样预处理后选择离子流图；

图7为实施例1的含有500μg/kg阿维菌素和1μg/kg甲维盐土样处理后总离子流图；

图8为实施例1的空白土壤样品阿维菌素选择离子流图；

图9为实施例1的空白土壤样品甲维盐选择离子流图；

图10为实施例1的空白土壤样品阿维菌素及甲维盐总离子流图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种土壤中阿维菌素残留量的检测方法，它是按照以下步骤进行的：

一、供试品样品制备：

1)称取含有阿维菌素的土壤，加入甲氨基阿维菌素苯甲基盐、乙腈和去离子水，涡旋均质45～60s，超声辅助提取18～20min，而后置于离心机内，以3500～4000r/min离心8～10min，收集上清液，将收集的沉淀保存备用；

2)向上一步收集的沉淀中，加入甲氨基阿维菌素苯甲基盐、乙腈和去离子水，涡旋均质45～60s，超声辅助提取18～20min，而后置于离心机内，以3500～4000r/min离心8～10min，收集上清液；

3)将步骤1)和步骤2)收集的上清液合并后，定容，得待浸化样品；

4)取乙腈和活化液对HLB固相萃取柱进行活化，加入待浸化样品，以0.5～1.5mL/min流速过柱，待样液全部流出，用淋洗剂正己烷进行淋洗，用洗脱液洗脱待分析物，抽干所有的液体并收集，用氮吹仪吹近干，并加甲醇复溶，均质45～60s，过0.22μm滤膜后，得供试品溶液；

二、标准曲线绘制：

取阿维菌素标准贮备液，用甲醇稀释，配制成浓度梯度为1～1000μg/L的标准工作溶液，每一个梯度的标准工作溶液内都含有1μg/L的甲维盐，使用超高效液相色谱-串联四级杆质谱仪进行检测；以阿维菌素峰面积与甲维盐峰面积比值作为纵坐标，以从1～1000μg/L的标准工作溶液中随机选取的标准工作溶液浓度作为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数；

三、测定：吸取上述标准工作品溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱-串联四级杆质谱仪中，根据内标法计算阿维菌素残留量；

色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C₁₈柱，色谱柱内径为2.1mm，柱长50mm，填料颗粒直径为1.7μm，柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样量12μL；流动相：有机相为色谱纯甲醇，无机相为含10mM氨的水溶液并用甲酸调pH至4，洗脱条件如下：

0～2min，75％A₁～25％B₁；

2～2.1min，由75％A₁～25％B₁调节为85％A₁～15％B₁；

2.1min～5min，85％A₁～15％B₁；

5～5.1min，由85％A₁～15％B₁调节为75％A₁～25％B₁；

5.1～6min，75％A₁～25％B₁；

其中，A₁为有机相，B₁为无机相；

质谱条件：

ESI电喷雾离子源；

正离子扫描模式；

采集方式：MRM；

离子源内毛细管电压：4kV；

锥孔电压：45V；

去溶剂气温度：400℃；

离子源温度：150℃；

脱溶剂气流量：900L/Hr；

锥孔气流量：60L/hr。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：活化液为乙腈与水按体积比为2:3的比例混合而成。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：洗脱液为甲醇与乙腈按体积比为1:1的比例混合而成。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：含有阿维菌素土壤、甲氨基阿维菌素苯甲基盐、乙腈和去离子水的质量体积比为1g：0.001～0.003μg：7～9mL：1～3mL。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：含有阿维菌素土壤、甲氨基阿维菌素苯甲基盐、乙腈和去离子水的质量体积比为1g：0.001μg：8mL：2mL。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：沉淀、甲氨基阿维菌素苯甲基盐、乙腈和去离子水的质量体积比为1g：0.001～0.003μg：7～9mL：1～3mL。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是：沉淀、甲氨基阿维菌素苯甲基盐、乙腈和去离子水的质量体积比为1g：0.001μg：8mL：2mL。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是：乙腈与活化液的体积比为1:1。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤1)和2)中的涡旋均质时间均为50～60s，超声辅助提取时间均为18～20min。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一不同的是：土壤中阿维菌素的含量为50～500μg/kg。其它与具体实施方式一相同。

本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

通过以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例1

本实施例的一种土壤中阿维菌素残留的检测方法，它包括如下步骤：

仪器：超高效液相色谱-串联四级杆质谱仪。

色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C₁₈柱(2.1mm×50mm，1.7μm)、柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样量12μL；流动相有机相采用色谱纯甲醇(A₁)，无机相使用含10mM氨的水溶液并用甲酸调pH至4(B₁)，洗脱条件如下。

0～2min，75％A₁-25％B₁；

2～2.1min，由75％A₁-25％B₁变为85％A₁-15％B₁；

2.1min～5min，85％A₁-15％B₁；

5～5.1min，由85％A₁-15％B₁变为75％A₁-25％B₁；

5.1～6min，75％A₁-25％B₁。

质谱条件：

ESI电喷雾离子源；

正离子扫描模式；

采集方式：MRM；

离子源内毛细管电压：4kV；

锥孔电压：45V；

去溶剂气温度：400℃；

离子源温度：150℃；

脱溶剂气流量：900L/Hr；

锥孔气流量：60L/hr；

阿维菌素质谱条件

甲维盐质谱条件

注：*是定量子离子。

1)供试品样品制备：称取1g(精确至0.001g)土壤样品于50mL离心管，样品中加入0.001μg甲氨基阿维菌素苯甲基盐(甲维盐)，8mL乙腈和2mL去离子水，涡旋均质45～60s，超声辅助提取18～20min，而后置于离心机内，3500～4000r/min离心8～10min。重复上述提取操作一次，合并上清液。将上清液移置50mL比色管内，用超纯水定容至50mL。分别移取5mL乙腈、5mL活化液(乙腈:水＝2:3(v/v))对HLB固相萃取柱进行活化，加入待净化样品，以1mL/min左右流速过柱，待样液全部流出，用3mL的淋洗剂正己烷进行淋洗。用3mL洗脱液(甲醇:乙腈＝1:1(v/v))洗脱待分析物，抽干所有的液体并收集于10mL玻璃氮吹管中。用氮吹仪将净化后液体吹近干，并加1mL甲醇复溶，均质45～60s，过0.22μm滤膜后供超高效液相色谱-串联四级杆质谱仪(UPLC-MS/MS)检测。

2)标准品曲线绘制：分别精密量取阿维菌素标准贮备液适量，用甲醇稀释，配制成浓度为1～1000μg/L的系列标准溶液，每一个浓度梯度标准溶液内都含有1μg/L的甲氨基阿维菌素苯甲酸盐，使用UPLC-MS/MS进行检测。以阿维菌素峰面积与甲维盐峰面积比值作为纵坐标，阿维菌素浓度作为横坐标，绘制标线。求回归方程和相关系数。

3)测定：吸取上述标准品溶液和供试品溶液12μL注入UPLC-MS/MS仪中，根据内标法计算阿维菌素残留量。检测得出阿维菌素保留时间4.2min左右，甲维盐保留时间3.6min左右。

本实施例的土壤中阿维菌素残留的检测方法，试验过程发现：现有检测方法的灵敏度低，检出限高，重复性差。同时样品处理过程复杂、繁琐，使得部分阿维菌素损失。通过大量实验，根据各杂质的性质，提取、纯化样品，内标法进行基质效应校正，将微量阿维菌素有效检出，并取得高效分离，有效检测土壤中的阿维菌素残留量。

验证结果表明：标准曲线线性良好，R²＝0.9975。向土壤样品中加标浓度为50μg/kg、500μg/kg的阿维菌素。按照已建立的方法，对同一批次样品一天内5次检验，连续5天对不同批次样品进行一次检验。日间回收率81.5～107.2％，日内相对标准偏差(RSD)<15％，日内回收率82～108.2％，日间RSD<15％。本实施例证明所建立的方法准确度高、专属性强、重现性良好，能有效检测土壤中阿维菌素残留量。

本实施例通过对空白土壤中的阿维菌素及甲维盐进行检测，如图8-10所示，空白土壤中的阿维菌素选择离子、甲维盐选择离子和阿维菌素及甲维盐总离子均未检出。

实施例2

本实施例的土壤中阿维菌素残留量检测方法，包含以下内容：

仪器：超高效液相色谱-串联四级杆质谱仪。

色谱条件：色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C₁₈柱(2.1mm×50mm，1.7μm)、柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样量12μL；流动相有机相采用色谱纯甲醇(A₁)，无机相使用含10mM氨的水溶液并用甲酸调pH至4(B₁)。洗脱条件如下。

0～2min，75％A₁-25％B₁；

2～2.1min，由75％A₁-25％B₁变为85％A₁-15％B₁；

2.1min～5min，85％A₁-15％B₁；

5～5.1min，由85％A₁-15％B₁变为75％A₁-25％B₁；

5.1～6min，75％A₁-25％B₁。

质谱条件：

ESI电喷雾离子源；

正离子扫描模式；

采集方式：MRM；

离子源内毛细管电压：4kV；

锥孔电压：45V；

去溶剂气温度：400℃；

离子源温度：150℃；

脱溶剂气流量：900L/Hr；

锥孔气流量：60L/hr；

阿维菌素质谱条件

甲维盐质谱条件

注：*是定量子离子。

1)供试品样品制备：称取1g(精确至0.0001g)土壤样品于50mL离心管，样品中加入0.001μg甲氨基阿维菌素苯甲基盐(甲维盐)，8mL乙腈和2mL去离子水，涡旋均质45～60s，超声辅助提取18～20min，而后置于离心机内，3500～4000r/min离心8～10min。重复上述提取操作一次，合并上清液。将上清液移置50mL比色管内，用超纯水定容至50mL。分别移取5mL乙腈、5mL活化液(乙腈:水＝2:3(v/v))对HLB固相萃取柱进行活化，加入待净化样品，以1mL/min左右流速过柱，待样液全部流出，用3mL的淋洗剂正己烷进行淋洗。用3mL洗脱液(甲醇:乙腈＝1:1(v/v))洗脱待分析物，抽干所有的液体并收集于10mL玻璃氮吹管中。用氮吹仪将净化后液体吹近干，并加1mL甲醇复溶，均质45～60s，过0.22μm滤膜后供超高效液相色谱-串联四级杆质谱仪(UPLC-MS/MS)检测。

2)标准品曲线绘制：分别精密量取阿维菌素标准贮备液适量，用甲醇稀释，配制成浓度为1～1000μg/L的系列标准溶液，每一个浓度梯度标准溶液内都含有1μg/L的甲氨基阿维菌素苯甲酸盐，使用UPLC-MS/MS进行检测。以阿维菌素峰面积与甲维盐峰面积比值作为纵坐标，阿维菌素浓度作为横坐标，绘制标线。求回归方程和相关系数。

3)测定：吸取上述标准品溶液和供试品溶液12μL注入UPLC-MS/MS仪中，根据内标法计算阿维菌素残留量。

方法验证：

通过一定的处理，土壤中的阿维菌素残留量于较低水平，在空白样品中的加标浓度分别为50、500μg/kg。采用本实验方法进行分析检测，实验室重复进行5次，求得的回收率及其相对标准偏差，样品中阿维菌素的含量按公式(1)计算。

式中：X—样品中阿维菌素的含量，单位为微克每克(μg/g)；

C—样品溶液中阿维菌素的浓度，单位为毫克每升(μg/mL)，由标准曲线计算得出；

m—样品质量，单位为克(g)，本方法取1g；

V—样品溶液体积，单位为毫升(mL)，本方法中取1mL。

向土壤样品中加标浓度为50μg/kg、500μg/kg的阿维菌素。对同一批次样品一天内5次检验，连续5天对不同批次样品进行一次检验。日间回收率81.5～107.2％，日间相对标准偏差(RSD)<15％，日内回收率82～108.2％，日内RSD<15％。取三倍信噪比(S/N)作为定性检出限LOD＝50ng/kg，十倍信噪比作为定量检出限LOQ＝165ng/kg。且在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。

Claims (6)

1.一种土壤中阿维菌素残留量的检测方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：

一、供试品样品制备：

1)称取含有阿维菌素的土壤，加入甲氨基阿维菌素苯甲基盐、乙腈和去离子水，涡旋均质45～60s，超声辅助提取18～20min，而后置于离心机内，以3500～4000r/min离心8～10min，收集上清液，将收集的沉淀保存备用；

2)向上一步收集的沉淀中，加入甲氨基阿维菌素苯甲基盐、乙腈和去离子水，涡旋均质45～60s，超声辅助提取18～20min，而后置于离心机内，以3500～4000r/min离心8～10min，收集上清液；

3)将步骤1)和步骤2)收集的上清液合并后，定容，得待浸化样品；

4)取乙腈和活化液对HLB固相萃取柱进行活化，加入待浸化样品，以0.5～1.5mL/min流速过柱，待样液全部流出，用淋洗剂正己烷进行淋洗，用洗脱液洗脱待分析物，抽干所有的液体并收集，用氮吹仪吹近干，并加甲醇复溶，均质45～60s，过0.22μm滤膜后，得供试品溶液；

二、标准曲线绘制：

取阿维菌素标准贮备液，用甲醇稀释，配制成浓度梯度为1～1000μg/L的标准工作溶液，每一个梯度的标准工作溶液内都含有1μg/L的甲维盐，使用超高效液相色谱-串联四级杆质谱仪进行检测；以阿维菌素峰面积与甲维盐峰面积比值作为纵坐标，以从1～1000μg/L的标准工作溶液中随机选取的标准工作溶液浓度作为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数；

三、测定：吸取上述标准工作品溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱-串联四级杆质谱仪中，根据内标法计算阿维菌素残留量；

色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C₁₈柱，色谱柱内径为2.1mm，柱长50mm，填料颗粒直径为1.7μm，柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样量12μL；流动相A1为有机相:色谱纯甲醇，流动相B1为无机相：含10mM氨的水溶液并用甲酸调pH至4，洗脱条件如下：

0～2min，75％A₁+25％B₁；

2～2.1min，由75％A₁+25％B₁调节为85％A₁+15％B₁；

2.1min～5min，85％A₁+15％B₁；

5～5.1min，由85％A₁+15％B₁调节为75％A₁+25％B₁；

5.1～6min，75％A₁+25％B₁；其中，A₁为有机相，B₁为无机相；

质谱条件：

ESI电喷雾离子源；

正离子扫描模式；

采集方式：MRM；

离子源内毛细管电压：4kV；

锥孔电压：45V；

去溶剂气温度：400℃；

离子源温度：150℃；

脱溶剂气流量：900L/Hr；

锥孔气流量：60L/hr；活化液为乙腈与水按体积比为2:3的比例混合而成；洗脱液为甲醇与乙腈按体积比为1:1的比例混合而成。

2.根据权利要求1所述的一种土壤中阿维菌素残留量的检测方法，其特征在于沉淀、甲氨基阿维菌素苯甲基盐、乙腈和去离子水的质量体积比为1g：0.001～0.003μg：7～9mL：1～3mL。

3.根据权利要求1或2所述的一种土壤中阿维菌素残留量的检测方法，其特征在于沉淀、甲氨基阿维菌素苯甲基盐、乙腈和去离子水的质量体积比为1g：0.001μg：8mL：2mL。

4.根据权利要求1所述的一种土壤中阿维菌素残留量的检测方法，其特征在于乙腈与活化液的体积比为1:1。

5.根据权利要求1所述的一种土壤中阿维菌素残留量的检测方法，其特征在于步骤1)和2)中的涡旋均质时间均为50～60s，超声辅助提取时间均为18～20min。

6.根据权利要求1所述的一种土壤中阿维菌素残留量的检测方法，其特征在于土壤中阿维菌素的含量为50～500μg/kg。

Images