CN111505152B - 一种猪毛发中五氯酚残留量的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及检测领域，具体涉及一种猪毛发中五氯酚残留量的测定方法。主要包括(1)通过对动物源性毛发进行清洗水解处理，(2)水解液进行前处理提取五氯酚，(3)采用高效液相色谱‑质谱法对样品进行测定。通过以上方法可以达到活猪测定禁用药物的目的，对支撑监管、污染源排查比对有一定的意义。检测结果准确度高，易于操作掌握。

Description

一种猪毛发中五氯酚残留量的测定方法
技术领域
本发明涉及检测领域，具体涉及一种猪毛发中五氯酚残留量的检测方法。
背景技术
五氯酚常作为除草杀虫剂，是一种毒性物质，其组成物可能会形成二噁英。其可通过吸入、食入或经皮肤接触进入人体，产生急性或慢性中毒，具有致畸、致癌性。其钠盐经过酸化可转化为五氯酚，在目前的动物养殖、植物种植过程中，农药的过量使用、草料等污染，导致动物体内五氯酚类物质残留超标。同时五氯酚的蓄积性比较强、化学性质稳定，在环境中不易分解，通过食物链进入人体后，将对人体肝脏、肾脏、神经系统等造成伤害。
根据中华人民共和国农业部公告第235号要求，五氯酚酸钠禁止在所有食品动物中使用，不得在所有可食组织中检出。根据国家的不合格样品公告，有食用农产品中五氯酚检出不合格。按照国家标准，有相关人员对五氯酚在动物源性中残留进行检测，或对水环境中残留进行了检测。但尚未见有采用高效液相色谱-串联质谱法检测猪毛发中五氯酚的含量。
通常由于动物摄入了含五氯酚类食物，没经过足够代谢，导致动物源性食品检出五氯酚或五氯酚经过代谢排除，无法排查污染源，造成监管困难。通过毛发中五氯酚的检测，可更直观、持久的观察五氯酚的摄入程度，对于环境改造、养殖过程改进以及挽回养殖经济损失有重要的作用和意义。
发明内容
本发明针对五氯酚类物质在动物源性食品中，蓄积后影响食用、影响养殖户经济收益；或及时排除，但无法排查污染来源、造成严重损失，在不需要屠杀生猪的情况下，通过对猪毛前期清洗、处理进行五氯酚残留的检测。
一种猪毛发中五氯酚残留量的测定方法具体操作步骤如下：
1、前处理
a.样本采集：需采取猪活体的干净毛发，尽量采集颈部位置毛发。
b.清洗：用清洗剂清洗干净，用蒸馏水进一步淋洗，对样本进行烘干。
c.预处理：将清洗干燥后的猪毛发进行剪切、粉碎、均质。
d.水解：将预处理后的毛发称取2g至于10mL离心管中，加入0.3-0.5mol/L的HCl中，在50-60℃水解2h，得到猪毛发水解液。
2、提取净化
a.提取：在猪毛发水解液中加入6mL5％三乙胺的乙腈—水溶液(70％乙腈+30％水)，超声5-10min，均质涡旋完全混匀，离心5min，收集上清液于另一带有刻度的离心管中，对剩余掺杂进行再次提取。
b.净化：用HLB固相萃取柱进行净化，先后用5mL氨甲醇溶液(5％)、5mL2％甲酸的甲醇-水溶液进行淋洗，淋洗后将所有的液体排净，用5mL2％甲酸甲醇溶液洗脱，洗脱液用氮吹管进行收集吹干。
c.定容：用2％甲酸甲醇水定容至1.0mL，旋涡混合1min，上机测定。
3、高效液相色谱-质谱法上机检测：
a.质谱条件：离子源：电喷雾ESI负离子扫描方式：多反应监测监测离子对：五氯酚262.7/262.7(定量离子)，264.7/264.7，266.7/266.7，268.7/268.7外标法定量。
b.液相色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3，50mm×2.1mm，1.8μm
流动相：A：乙腈B：含0.1％甲酸的10mmol/L乙酸铵溶液流速：0.4mL/min柱温40℃进样量：5μL。
以上所述猪毛发五氯酚残留检测方法，所述清洗剂可以用乙醇、二氯甲烷、0.1％SDS(十二烷基磺酸钠)或含有吐温80的缓冲溶液。
以上所述猪毛发烘干采取55℃恒温干燥。
以上所述猪毛发中五氯酚残留量测定，所述步骤优选为：在猪毛发中加入0.3-0.5mol/L的HCl，在50-60℃水浴锅中恒温水解，加入6mL5％三乙胺的乙腈—水溶液(70％乙腈+30％水)，超声10min，均质后涡旋1min，5000r/min离心5min，收集上清液于另一带有刻度的离心管中，将HLB固相萃取柱进行净化，先后用5mL氨甲醇溶液(5％)、5mL2％甲酸的甲醇-水溶液进行淋洗，淋洗后将所有的液体排净，用5mL2％甲酸甲醇溶液洗脱，洗脱液用氮吹管进行收集吹干。2％甲酸甲醇水定容至1.0mL，旋涡混合1min。
附图说明
图1五氯酚选择反应监测(SRM)色谱图
具体实施方式
以上猪毛发中五氯酚残留量测定，将采集的干净活猪毛发，用清洗剂清洗干净，用蒸馏水进一步淋洗，对毛发在55℃恒温干燥；将清洗干净的毛发，通过剪碎、均质等手段让样本更均匀，然后用有机溶剂对毛发进行水解；在猪毛发中加入0.3-0.5mol/L的HCl，在50-60℃水浴锅中恒温水解，再次对水解液进行五氯酚残留物的提取，加入6mL5％三乙胺的乙腈—水溶液(70％乙腈+30％水)，超声10min，均质后涡旋1min，5000r/min离心5min，收集上清液于另一带有刻度的离心管中；将HLB固相萃取柱进行净化，先后用5mL氨甲醇溶液(5％)、5mL2％甲酸的甲醇-水溶液进行淋洗，淋洗后将所有液体抽干，用5mL2％甲酸甲醇溶液洗脱，洗脱液用氮吹管进行收集吹干；2％甲酸甲醇水定容至1.0mL，旋涡混合1min。
本方法以外标法峰面积计算五氯酚含量，相应的计算公式为：
Figure BDA0002478732170000031
式中：
X—样本中被测组分残留量，单位为微克每千克，μg/kg；
C—从标准工作曲线得到被测组分溶液浓度，单位为微克每升，μg/L；
V—样品溶液最终定容体积，单位为毫升，mL；
m—最终样品溶液所代表的试液的质量，单位为克，g
计算结果需扣除空白值
按公式X(五氯酚酸钠)＝X(五氯酚)×1.07折算，测得五氯酚酸钠含量
标准曲线制备：用空白基质溶液逐级稀释得到1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL标准溶液工作曲线，上机测定。以浓度-峰面积关系外标法作标准曲线，结果如下表：
Figure BDA0002478732170000041
五氯酚检出限：称取2.0g阴性样品置于10mL离心管中，加入混合标准中间溶液，按标准方法提取和净化后，由仪器计算得到方法检出限浓度点的信号噪声的比值。
结果如下：
Figure BDA0002478732170000042
方法测定低限对应的浓度点信噪比均大于3，满足标准要求。
五氯酚回收率和精密度:分别添加一定浓度的标准中间溶液，进行三水平实验，按标准方法提取和净化，上机测定，每一水平重复测定6次，结果如下表，计算回收率(R)和变异系数(CV)。
Figure BDA0002478732170000043
Figure BDA0002478732170000051
平均回收率均在60％～120％之间，实验室内变异系数(CV)＜21％，符合GB/T27404-2008要求。
结果表明：该方法的检出限、回收率、精密度能满足标准要求，方法准确度可性。

Claims (2)

1.一种猪毛发中五氯酚残留量的测定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）前处理
a.样本采集：需采取猪活体的干净毛发，尽量采集颈部位置毛发；
b.清洗：用清洗剂清洗干净，用蒸馏水进一步淋洗，对样本进行烘干，恒温干燥的温度为55℃，所述清洗剂为乙醇、二氯甲烷、0.1％十二烷基磺酸钠或含有吐温80的缓冲溶液；
c.预处理：将清洗干燥后的猪毛发进行剪切、粉碎、均质；
d.水解：将预处理后的毛发称取2g置于10mL离心管中，加入0.3-0.5mol/L的HCl，在50-60℃水解2h，得到猪毛发水解液；
（2）提取净化
a.提取：在猪毛发水解液中加入6mL5%三乙胺的乙腈—水溶液，其中乙腈与水的比例为70%乙腈与30%水，超声5-10min，均质涡旋完全混匀，离心5min，收集上清液于另一带有刻度的离心管中，对剩余掺杂进行再次提取；
b.净化：用HLB固相萃取柱进行净化，先后用5mL5%氨甲醇溶液、5mL2%甲酸的甲醇-水溶液进行淋洗，淋洗后将所有的液体排净，用5mL2%甲酸甲醇溶液洗脱，洗脱液用氮吹管进行收集吹干；
c.定容：用2%甲酸甲醇水定容至1.0mL，旋涡混合1min，上机测定；
（3）高效液相色谱 -质谱法上机检测
a.质谱条件：离子源：电喷雾ESI负离子；扫描方式：多反应监测；监测离子对：五氯酚262.7/262.7定量离子，264.7/264.7，266.7/266.7，268.7/268.7；
b.液相色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3，50 mm×2.1 mm，1.8 μm，流动相：A：乙腈B：含0.1%甲酸的10 mmol/L 乙酸铵溶液 流速：0.4 mL/min 柱温40℃ 进样量：5μL；
对于猪毛发中五氯酚残留量进行检测，以外标法峰面积计算五氯酚含量， 相应的计算公式为：
Figure 151592DEST_PATH_IMAGE002
式中：
X—样本中被测组分残留量，单位为微克每千克，μg/kg；
C—从标准工作曲线得到被测组分溶液浓度，单位为微克每升，μg/L；
V—样品溶液最终定容体积，单位为毫升，mL；
m—最终样品溶液所代表的试液的质量，单位为克，g
计算结果需扣除空白值；
按公式X五氯酚酸钠=X五氯酚×1.07折算，测得五氯酚酸钠含量；
标准曲线制备：用空白基质溶液逐级稀释得到1ng/mL、2ng/mL、5 ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50 ng/mL标准溶液工作曲线，上机测定；以浓度-峰面积关系外标法作标准曲线Y=68200X-21940；相关系数R2为0.9954。
2.根据权利要求1所述的一种猪毛发中五氯酚残留量的测定方法，其特征在于：采取活猪颈部毛发。
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