CN103675145B - 猪毛发中西马特罗残留量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪毛发中西马特罗残留量的检测方法，该方法包括以下步骤：（1）供试品溶液的制备：猪毛发样品经清洗、水解、提取、净化步骤，得到供试品溶液；（2）高效液相色谱-串联质谱法检测：以沙丁胺醇-D3为内标，采用高效液相色谱-串联质谱法检测猪毛发中西马特罗的含量。本发明无需宰杀生猪等动物，实现动物活体检测，由于毛发生长周期长，更能准确监控畜禽生产过程中是否使用过西马特罗，检测步骤操作简便，特异性强、灵敏度高，检测结果准确可靠，为畜禽食品安全生产的监管提供可靠的控制确证技术。

Description

猪毛发中西马特罗残留量的检测方法

技术领域

本发明涉及检测领域，具体涉及一种猪毛发中西马特罗残留量的检测方法。

背景技术

瘦肉精是具有肾上腺素受体激动作用的一类药物的统称，又称β2-兴奋剂，具有促进肌肉生长、提高瘦肉率的作用，曾作为生长添加剂被广泛关注，但β2-受体激动剂在动物体内有一定的残留时间，通过食物链进入人体后会使一些易感人群产生明显的中毒症状，危害人类健康。西马特罗(Cimaterol)是目前常见的瘦肉精之一。我国于2002年农业部176号公告《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》中已明令禁止西马特罗在畜禽生产上的使用，但受经济利益驱使，西马特罗在畜禽生产上的使用仍然屡禁不止。

目前国家或行业部门已出台了多项动物源性食品或尿液中的西马特罗残留量检测标准，猪及其肉制品中的西马特罗的检测方法也多见报导。如孙雷等(高效液相色谱-串联质谱法检测猪尿中四种β-受体激动剂残留的研究.中国兽药杂志，2008,42(4)：15-18)建立了猪尿中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗残留检测的高效液相色谱-串联质谱方法，液相色谱条件为:色谱柱为XBridge C18柱(150mm x 2.1mm,5μm)，流动相为0.1％甲酸甲醇溶液+0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱，柱温为30℃，流速为0.2mL/min，进样量为20μL；质谱条件为:电喷雾离子源(ESI)，多反应监测(MRM)方式进行采集，同位素内标法定量；结果表明，四种β-受体激动剂在1-50ng/mL浓度范围内呈现良好的线性关系，方法检测限为0.3ng/mL，定量限为0.5ng/mL，该方法快速、简便、专属性强、灵敏度高。

但西马特罗在食用组织或尿液中半衰期较短，在一定休药期后将无法在肌肉或内脏组织中被检测出来，因此无法准确监控畜禽生产过程中是否使用过此类违禁药物，这给食品安全生产的监管带来一定困难。而毛发因为其结构成分特点和较低的代谢活性，使得药物进入其中后代谢缓慢，可长期蓄积保留，在动物毛发中具有较长的残留时间，因此毛发较畜禽产品的肌肉组织、肝脏及尿液更适合做为有效的检测样本为食品安全生产中违禁药物监管提供更可靠的确证依据。目前，尚未见有采用高效液相色谱-串联质谱法检测猪毛发中西马特罗的含量。

发明内容

本发明针对西马特罗在食用组织或尿液中半衰期较短，不利于食品安全生产监管的现状，提供了一种猪毛发中西马特罗残留量的检测方法，通过采集猪毛，进行简单前处理检测猪毛发中西马特罗残留量，无需宰杀生猪，实现动物活体检测，毛发样本较尿液也更方便获取。该方法检测步骤操作简便，特异性强、灵敏度高，检测结果准确可靠，为畜禽食品安全生产的监管提供可靠的控制确证技术。

本发明的技术方案为：

一种猪毛发中西马特罗残留量的检测方法，该方法包括以下步骤：

1.供试品溶液的制备：

a.清洗：取猪毛发样品，用清洗剂清洗，蒸馏水漂净，烘干或晾干；

b.水解：取清洗好的猪毛发样品剪碎，称取0.2g至50mL塑料离心管中，加入0.5mol·L^-1氢氧化钠溶液5mL、内标溶液，置于50℃水浴锅中恒温2小时，得猪毛发水解液；

c.提取：在猪毛发水解液中加入盐酸，再用盐酸调节pH值至9.8±0.2，加入氯化钠，用10mL乙酸乙酯-异丙醇(3:2)混合溶液提取，离心，转移上层有机相至圆底烧瓶中，再用5mL乙酸乙酯-异丙醇(3:2)混合溶液提取下层水相，离心，合并有机相，在40℃水浴下减压浓缩近干，加入2mL0.1mol·L^-1盐酸溶解残渣，得备用液；

d.净化：取备用液过PCX固相萃取柱，依次用30mmol·L^-1盐酸、甲醇各3mL淋洗，抽干，再用5％氨水甲醇溶液5mL洗脱，洗脱液吹干，用1:1的乙腈-水溶液0.2mL溶解，作为供试品溶液；

2.高效液相色谱-串联质谱法检测：

a.液相色谱条件：色谱柱：CAPCELL PAK CR柱，2.1mm×150mm，粒度5μm；流动相A为含0.1％甲酸的10mmol·L^-1乙酸铵水溶液，流动B为含0.1％甲酸的乙腈，流动相A:流动B为55:45；流速：0.2mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL；

b.质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描模式；选择反应监测(SRM)；喷雾电压：3500V；毛细管温度：350℃蒸发温度：100℃；鞘气压力3.67kPa，辅助气流量5L·min^-1。

以上所述猪毛发中西马特罗残留量的检测方法，所述内标物质为沙丁胺醇-D3，所述内标溶液优选500ng·mL^-1沙丁胺醇-D₃的甲醇溶液0.02mL。

以上所述猪毛发中西马特罗残留量的检测方法，所述清洗剂可为除去猪毛发杂质的任何物质，如：二氯甲烷、丙酮、己烷等有机溶剂、表面活性剂、水等，优选为十二烷基磺酸钠，最佳优选0.1％十二烷基磺酸钠。

以上所述猪毛发中西马特罗残留量的检测方法，所述烘干步骤优选为置50℃干燥箱中烘干。

以上所述猪毛发中西马特罗残留量的检测方法，所述提取步骤优选为：在猪毛水解液加入0.5mol·L^-1盐酸3mL，再用0.1mol·L^-1盐酸调节pH值至9.8±0.2，加入2g氯化钠，用10mL乙酸乙酯-异丙醇(3:2)混合溶液提取，在3500r·min^-1下离心5min，转移上层有机相，再用5mL乙酸乙酯-异丙醇(3:2)混合溶液提取下层水相，3500r·min^-1下离心5min，合并有机相，在40℃水浴下减压浓缩近干，加入2mL0.1mol·L^-1盐酸溶解残渣，得备用液。

以上所述猪毛发中西马特罗残留量的检测方法，所述净化步骤优选为：PCX固相萃取柱依次用甲醇、水、30mmol·L^-1盐酸活化，取备用液过PCX固相萃取柱，依次用30mmol·L^-1盐酸、甲醇各3mL淋洗，抽干，用5％氨水甲醇溶液5mL洗脱，洗脱液在50℃下用氮气吹干，用1:1的乙腈-水溶液0.5mL溶解，涡旋混匀后过0.45μm滤膜，作为供试品溶液。

以上所述猪毛发中西马特罗残留量的检测方法，所述质谱条件西马特罗的定量离子为m/z220＞160，定性离子为m/z220＞160和m/z220＞202，沙丁胺醇-D3的定量离子为m/z为243＞151。

本方法按照内标法以峰面积计算西马特罗在毛发中的残留量，计算公式为：

$X=\frac{c\×c_i\×A\×A_{\mathrm{si}}\×V}{c_{\mathrm{si}}\×A_i\×A_s\×m}\·\·\·\left(1\right)$

式中：

X——样品中被测物残留量，单位为微克每千克(μg·kg^-1)；

c——西马特罗标准工作液的浓度，单位为微克每升(μg·L^-1)；

c_si——标准工作溶液中内标物的浓度，单位为微克每升(μg·L^-1)；

c_i——样液中内标物的浓度，单位为微克每升(μg·L^-1)；

A_s——西马特罗标准工作溶液的峰面积；

A——样液中西马特罗的峰面积；

A_si——标准工作溶液中内标物的峰面积；

A_i——样液中内标物的峰面积；

V——样品定容体积，单位为毫升(mL)；

M——样品称样量，单位为克(g)。

计算结果需要扣除空白值，结果小于本标准检出限0.5μg·kg^-1时，视为未检出。

以上所述猪毛发中西马特罗残留量的检测方法，所述方法在检测动物毛发中的应用，所述动物优选为猪、牛、羊、鸡等畜禽类，最佳优选为猪。由于在食用组织或尿液中半衰期较短，在一定休药期后将无法在肌肉或内脏组织中被检测出来，因此无法准确监控畜禽生产过程中是否使用过此类违禁药物，而毛发因为其结构成分特点和较低的代谢活性，使得药物进入其中后代谢缓慢，可长期蓄积保留，在动物毛发中具有较长的残留时间，因此，该方法可用于检测动物毛发中西马特罗的残留量，实现畜禽等食品安全生产监管的目的。

本发明的有益效果是：

1.本发明无需宰杀生猪等动物，实现动物活体检测，毛发样本较尿液、肌肉、内脏组织等获取方便，且由于毛发生长周期长，更能准确监控畜禽生产过程中是否使用过西马特罗，实现对畜禽等食品安全生产监管的目的。

2.本发明检测步骤操作简便，时间短，检测结果准确；特异性强，不会有假阳性情况发生，避免误判；灵敏度高，本方法的最低检出限为0.5μg·kg^-1，定限量为2μg·kg^-1；在2μg·L^-1～100μg·L^-1浓度范围内，峰面积与标准溶液浓度量呈良好的线性关系。

附图说明

图1阳性猪毛样品及内标物选择反应监测(SRM)色谱图

图2未喂给西马特罗猪毛样品及内标物选择反应监测(SRM)色谱图

图3西马特罗标准品及内标物选择反应监测(SRM)色谱图

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式对本发明作进一步描述，但不限制本发明的使用范围和应用范围。

仪器设备：高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪(TSQ Quantum Access Max)：配有电喷雾离子源(ESI)、旋涡混合器、高速离心机、氮吹仪、真空过柱装置、感量天平(0.1mg)等。

试药：西马特罗标准品：纯度＞98％；内标：沙丁胺醇-D3；乙腈：色谱纯；其余试剂为分析纯，试验用水为超纯水。

标准溶液的制备：准确称取适量的西马特罗标准品，用甲醇分别配制成100μg·mL^-1的标准储备液。

混合标准储备液的制备：准确吸取1.00mL西马特罗至100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。

内标储备溶液：准确称取适量的沙丁胺醇-D3，用甲醇配制成100μg·mL^-1的标准储备液，即得。

内标工作液的制备(500ng·mL^-1)：将上述同位素内标储备液用乙腈-水溶液(1:1)进行适当稀释。

1.线性回归方程与检测限

配制浓度为2μg·L^-1～100μg·L^-1的一系列标准工作液，以峰面积(Y)对含量(X)作图。结果表明，在2μg·L^-1～100μg·L^-1浓度范围内，峰面积与标准溶液浓度量呈良好的线性关系。西马特罗的线性方程为Y＝112387+49365X，相关系数r²＝0.9989。

在空白猪毛发样品中添加西马特罗标准溶液，使样品中西马特罗浓度为1μg·kg^-1，按建立的方法进行检测，根据得到的西马特罗色谱峰信噪比计算方法最低检出限，确定本方法的最低检出限(S/N＝3)为0.5μg·kg^-1，定限量(S/N＝10)为2μg·kg^-1。

2.回收率与精密度

以未检出西马特罗的空白猪毛发做为样品基质，在5μg·kg^-1、20μg·kg^-1、100μg·kg^-13个含量水平上添加西马特罗标样，按前述实验方法测定并计算回收率，每个添加水平平行测定6次。实验测得西马特罗的回收率分别为95.0％～102％，相对标准偏差为2.7％～3.8％，结果符合《GB 27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测》关于残留分析的要求。西马特罗的测定方法回收率与相对标准偏差见表1。

表1猪毛发中西马特罗测定方法回收率与相对标准偏差(n＝6)

3.实验室间方法回收率与精密度

广西兽药监查所、广西进出口检验检疫局技术中心2家检测机构，按建立的检测方法对在空白样品中添加5μg·kg^-1、20μg·kg^-1、100μg·kg^-13种西马特罗添加浓度水平的样品进行回收率试验，结果见表2。

表2样品实验室间方法回收率和精密度的原始数据统计结果(n＝3)

结果表明：实验室的平均回收率在95.0％-98.2％之间，相对标准偏差在3.5％－4.5％之间，进一步证实本方法有较好的准确度和精密度。

4.样品测定

取给药喂养得到的8份阳性猪毛样品、2份未喂给西马特罗的猪毛样品按照下面方法检测。

供试品溶液的制备：

a.清洗：取猪毛发样品，用0.1％十二烷基磺酸钠清洗，蒸馏水漂净，置50℃干燥箱中烘干；

b.水解：取清洗好的猪毛发样品剪碎，称取0.2g至50mL塑料离心管中，加入0.5mol·L^-1氢氧化钠溶液5mL、500ng·L^-1沙丁胺醇-D3的甲醇溶液0.02mL，置于50℃水浴锅中恒温2小时，得猪毛发水解液；

c.提取：在猪毛水解液加入0.5mol·L^-1盐酸3mL，再用0.1mol·L^-1盐酸调节pH值至9.8±0.2，加入2g氯化钠，用10mL乙酸乙酯-异丙醇(3:2)混合溶液提取，在3500r·min^-1下离心5min，转移上层有机相，再用5mL乙酸乙酯-异丙醇(3:2)混合溶液提取下层水相，3500r·min^-1下离心5min，合并有机相，在40℃水浴下减压浓缩近干，加入2mL0.1mol·L^-1盐酸溶解残渣，得备用液；

d.净化：PCX固相萃取柱依次用甲醇、水、30mmol·L^-1盐酸活化，取备用液过PCX固相萃取柱，依次用30mmol·L^-1盐酸、甲醇各3mL淋洗，抽干，用5％氨水甲醇溶液5mL洗脱，洗脱液在50℃下用氮气吹干，用1:1的乙腈-水溶液0.2mL溶解，涡旋混匀后过0.45μm滤膜，作为供试品溶液。

液相色谱条件：色谱柱：CAPCELL PAK CR柱，2.1mm×150mm，粒度5μm；流动相A为含0.1％甲酸的10mmol·L^-1乙酸铵水溶液，流动B为含0.1％甲酸的乙腈，流动相A:流动B为55:45；流速：0.2mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL；

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描模式；选择反应监测(SRM)；喷雾电压：3500V；毛细管温度：350℃蒸发温度：100℃；鞘气压力3.67kPa，辅助气流量5L·min^-1。西马特罗的定量离子为m/z220＞160，定性离子为m/z220＞160和m/z220＞202，沙丁胺醇-D3的定量离子为m/z为243＞151。详见表3。

表3质谱参数

检出上述样品中含有西马特罗残留量在10.3～48.1μg·kg^-1之间，未喂给西马特罗的猪毛样品西马特罗残留未检出。部分色谱图见图1-3。说明该检测方法具有可行性。

Claims (3)

1.一种猪毛发中西马特罗残留量的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：

a.清洗：取猪毛发样品，用十二烷基磺酸钠清洗，蒸馏水漂净，置50℃干燥箱中烘干或晾干；b.水解：取清洗好的猪毛发样品剪碎，称取0.2g至50mL塑料离心管中，加入0.5mol·L^-1氢氧化钠溶液5mL、500ng·L^-1沙丁胺醇-D3的甲醇溶液0.02mL，置于50℃水浴锅中恒温过夜，得猪毛发水解液；

c.提取：在猪毛水解液加入0.5mol·L^-1盐酸3mL，再用0.1mol·L^-1盐酸调节pH值至9.8±0.2，加入2g氯化钠，用10mL比例为3:2的乙酸乙酯-异丙醇混合溶液提取，在3500r·min^-1下离心5min，转移上层有机相，再用5mL比例为3:2的乙酸乙酯-异丙醇混合溶液提取下层水相，3500r·min^-1下离心5min，合并有机相，在40℃水浴下减压浓缩近干，加入2mL0.1mol·L^-1盐酸溶解残渣，得备用液；

d.净化：PCX固相萃取柱依次用甲醇、水、30mmol·L^-1盐酸活化，取备用液过PCX固相萃取柱，依次用30mmol·L^-1盐酸、甲醇各3mL淋洗，抽干，用5％氨水甲醇溶液5mL洗脱，洗脱液在50℃下用氮气吹干，用1:1的乙腈-水溶液0.5mL溶解，涡旋混匀后过0.45μm滤膜，作为供试品溶液；

(2)高效液相色谱-串联质谱法检测：

a.液相色谱条件：色谱柱：CAPCELL PAK CR柱，2.1mm×150mm，粒度5μm；流动相A为含0.1％甲酸的10mmol·L^-1乙酸铵水溶液，流动B为含0.1％甲酸的乙腈，比例为55:45的流动相A-流动B；流速：0.2mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL；

b.质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描模式；选择反应监测(SRM)；喷雾电压：3500V；毛细管温度：350℃；蒸发温度：100℃；鞘气压力3.67kPa，辅助气流量5L·min^-1。

2.根据权利要求1所述猪毛发中西马特罗残留量的检测方法，其特征在于，所述质谱条件西马特罗的定量离子为m/z220＞160，定性离子为m/z220＞160和m/z220＞202，沙丁胺醇-D3的定量离子为m/z为243＞151。

3.根据权利要求1或2所述猪毛发中西马特罗残留量的检测方法，其特征在于，所述方法在检测动物毛发中的应用。