CN103424478B

CN103424478B - 一种吡利霉素的残留分析方法

Info

Publication number: CN103424478B
Application number: CN201310159490.5A
Authority: CN
Inventors: 袁宗辉; 陶燕飞; 陈冬梅; 潘源虎; 王玉莲; 黄玲利; 王旭; 刘振利; 谢书宇; 彭大鹏; 戴梦红; 郝海红; 程古月
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2013-05-03
Filing date: 2013-05-03
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2033-05-03
Also published as: CN103424478A

Abstract

本发明属于兽药残留分析领域，具体涉及一种吡利霉素的残留检测方法。采用仲胺基化合物氢取代衍生反应高效液相色谱柱前衍生化反应分析。在室温下，衍生化试剂氯甲酸-9-芴基甲酯的浓度为10-2mol/L，将0.1mol/L的硼酸缓冲液调至pH为9，该反应为即时反应，由于只有一个仲胺作为单一的反应位点，不需加反应终止剂即可达到衍生化的目的，衍生产物稳定。衍生产物经高效液相色谱检测，衍生产物的紫外检测波长为266nm时有最大紫外强度，最小检出量为5μg/L，在20～4000μg/L范围内对峰面积呈线性响应，结果重现性良好，3个浓度、15次重复的变异系数小于8％。

Description

一种吡利霉素的残留分析方法

技术领域

本发明属于兽药残留分析技术领域，与分析化学有关，本发明具体涉一种标识化合物吡利霉素吡利霉素残留的分析方法，本发明利用氯甲酸-9-芴基甲酯为衍生试剂与含仲胺基的吡利霉素药物通过柱前衍生化方法，HPLC方法联测，判定待测动物制品中标识化合物吡利霉素的残留水平。

背景技术

吡利霉素是一种兽用的抗生素类药物，不溶于水，其盐酸盐溶于甲醇、丙二醇，微溶于水。盐酸盐含有1个结晶水，为白色或类白色粉末，分子式为C₁₇H₃₁ClN₂O₅S·HCl·H₂O，分子量465.43，化学名为(2S-顺式)-甲基7-氯-6，7，8-三脱氧-6-[[(4-乙基-2-吡啶基)羰基]氨基]-1-硫代-L-苏式-α-D-半乳-辛吡喃糖苷单盐酸盐一水合物，其化学结构式如下：

吡利霉素(Pirlimycin)由美国Upjohn公司研制的动物专用林可胺类抗生素。该药在我国已于2007年获批生产使用。抗菌谱与林可霉素、克林霉素相似，抗菌活性与克林霉素相似或较弱，特点是对G细菌如金黄色葡萄球菌、链球菌等具有强大的抗菌活性，尤其对内酰胺类耐药的G细菌仍有强大的抗菌活性。其作用机制是与敏感菌的50S核糖体亚单位结合，抑制转肽酶，阻止肽链形成，进而抑制蛋白质的合成。

目前，国外主要批准用于敏感菌引起的奶牛乳房炎的治疗。毒性研究表明，过量吡利霉素导致沉郁、腹泻、痉挛、胃肠道刺激等中毒症状，同时伴有严重的眼刺激和中等程度的皮肤刺激，无基因毒性、无致癌性。药动学研究表明，吡利霉素在体内以吡利霉素和吡利霉素亚砜存在，其中吡利霉素为主要成分，故残留检测的标识化合物为吡利霉素。欧盟规定其在肌肉、牛奶中的MRL值均为100μg/kg、肝脏1000μg/kg、肾脏400μg/kg。关于吡利霉素残留的检测方法很少，涉及样品较多的是牛奶，其次为肝脏。其方法有液相色谱-串联质谱法和超高效液相色谱-串联质谱。方法的检测限多在2～10ng/mL，回收率为80％左右。国外HORNISH等使用LC-MS测定牛奶和肝脏中吡利霉素的残留，该方法的定量限和检测限分别为50和10ng/mL。国内孙雷等采用高效液相色谱-串联质谱法检测牛奶中吡利霉素的残留量，方法检测限和定量限分别为2和5ng/mL，回收率在90％以上。目前尚未见高效液相色谱的残留检测方法。

氯甲酸-9-芴基甲酯中含有活性氯基团，可以与药物中的仲胺基相互作用，同时含有荧光基团和较强的紫外吸收。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种标识化合物吡利霉素吡利霉素残留的分析方法，利用氯甲酸-9-芴基甲酯为衍生试剂与含仲胺基的吡利霉素药物进行柱前衍生化反应，然后通过高效液相色谱(HPLC)方法进行分离检测，紫外检测器测定表明，含仲胺基的吡利霉素药物与氯甲酸-9-芴基甲酯反应产物的紫外吸收强度高。本发明的方法灵敏度高，反应快速高效，操作简便。

本发明的总体技术方案如下：

确立仲胺基化合物标样与氯甲酸-9-芴基甲酯进行衍生化反应的条件→衍生产物高效液相色谱(HPLC)分离检测方法的建立→样本的分析检测

具体步骤如下所述：

1.仲胺基化合物与氯甲酸-9-芴基甲酯的衍生化反应

将净化后氮气吹干后的样本残渣，加乙腈1-10mL溶解残渣，旋涡混匀，取40μL提取液，依次加入80μL pH＝9.0的0.1mol/L硼酸缓冲液和80μL衍生化试剂(0.01mol/L)，旋涡混匀反应3min后经高效液相色谱检测。

2.衍生产物HPLC测定的技术条件：

色谱柱：Agilent SB-AqC18柱色谱柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm；

柱温：30℃；

流动相：梯度洗脱(A相：0.02mol/L乙酸铵溶液；B相：乙腈)

表1 梯度洗脱程序

检测器：紫外检测器：266nm；

本发明衍生化试剂为氯甲酸-9-芴基甲酯溶液，该物质与含仲胺基的吡利霉素药物发生衍生化反应具有反应速度快、反应产物荧光活性高、紫外吸收强度高等特点，在反应温度25～55℃时，其衍生产物在266nm时具有最大的紫外吸收强度。本发明的衍生反应的具体条件为：衍生化反应体系中氯甲酸-9-芴基甲酯与含仲胺基的吡利霉素药物的最佳摩尔比例为1∶5～10；硼酸缓冲液浓度(0.05～0.2mol/L)；反应体系最佳pH值8～11，最佳反应温度为25～55℃；最佳反应时间为3～30min。反应方程式如下所述：

其中R1-N-R2为吡利霉素的结构。

本发明的优点在于，克服了液相柱后反应检测不易找到合适的流动相及反应过程难以控制的缺陷，更适合残留痕量分析。

附图说明

图1是吡利霉素标准衍生化产物浓度为20μg/L的色谱图。

图2是肌肉样品空白色谱图。

图3是肌肉添加吡利霉素20μg/kg的色谱图。

图4是肌肉添加吡利霉素100μg/kg的色谱。

图5是肌肉添加吡利霉素200μg/kg的色谱图。

图6是肝脏样品空白色谱图。

图7是肝脏添加吡利霉素100μg/kg的色谱图。

图8是肝脏添加吡利霉素1000μg/kg的色谱图。

图9是肝脏添加吡利霉素2000μg/kg的色谱图。

图10是肾脏样品空白色谱图。

图11是肾脏添加吡利霉素20μg/kg的色谱图。

图12是肾脏添加吡利霉素200μg/kg的色谱图。

图13是肾脏添加吡利霉素400μg/kg的色谱图。

图14是牛奶样品空白色谱图。

图15是牛奶添加吡利霉素20μg/kg的色谱图。

图16是牛奶添加吡利霉素100μg/kg的色谱图。

图17是牛奶添加吡利霉素200μg/kg的色谱图。

具体实施方式

实施例1：仲胺基化合物与氯甲酸-9-芴基甲酯的衍生化反应

(1)吡利霉素与溴乙酰芘衍生化反应

准确称取吡利霉素对照品10mg，用甲醇溶解至10mL容量瓶中，分别配制成1mg/mL的标准储备液。准确移取标准工作液适量，用甲醇依次稀释成浓度分别为5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L标准工作液。准确移取标准工作液40μL，依次加入80μL硼酸缓冲液(配置方法：准确量取0.38g四硼酸钠，加水溶解稀释，用盐酸调节pH＝9.0，定容至100mL容量瓶中)和80μL衍生化试剂(准确称取26mg氯甲酸-9-芴基甲酯，用无水乙腈稀释定容至10mL容量瓶中)，旋涡混匀反应3min后，待上机检测。(2)衍生产物HPLC检测

按如下HPLC检测条件进行测定：

色谱柱：Agilent SB-AqC18色谱柱，柱长：250mm，内径：4.6mm，粒径：5μm；柱温：30℃；流动相：0.02mol/L乙酸铵溶液/乙腈梯度洗脱；流速：0.9mL/min；进样量：50μL，检测器：紫外检测器266nm。

(3)衍生产物检测结果

每个浓度重复3次，将测得的峰面积与相对应浓度绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。检测见表2，各数据表明本发明建立的分析方法和仪器条件合理可用。

表2标准曲线线性结果

药物名称	线性范围/(μg/L)	线性方程	相关系数
				吡利霉素	20～4000	y＝0.7832x+99.226	0.9999

实施例2：样本测定

(1)样本的处理

选择牛的肌肉、牛奶及牛的肾脏中为实验样本，对吡利霉素进行添加回收实验。在空白样品中加入适量标准溶液，使样品中浓度分别为LOQ、1MRL、2MRL三个浓度(每种药具体浓度如下表)，样品预处理后检测。同一天内每个浓度重复5个样，计算回收率，并取平均值，计算日内变异系数；每种组织重复5天，计算平均回收率。

提取：准确称取新鲜牛奶或解冻后的牛肌肉、肾脏样品5g置于离心管中，加1％甲酸乙腈10mL，旋涡混合1min，8000r/min离心10min，取出上清液，在残渣中加1％甲酸乙腈10mL重复操作一次。合并两次上清液，于55℃水浴旋转蒸干。加入1％的甲酸的50mmol/L乙酸铵溶液5mL溶解残渣(样品提取液)，待净化。

净化：

肌肉、牛奶、牛的肾脏净化方法：MCX柱依次用甲醇3mL、水3mL和2％的甲酸水溶液3mL活化，加样品提取液至MCX柱中，控制流速小于1mL/min，先后用2％甲酸水溶液2mL，甲醇2mL淋洗抽干，用5％的氨化甲醇6mL洗脱。40℃左右氮气吹干，加乙腈1mL溶解残渣，旋涡混匀，提取液待衍生化。

肝脏净化方法：MCX柱依次用甲醇3mL、水3mL和2％的甲酸水溶液3mL活化，加样品提取液至MCX柱中，控制流速小于1mL/min，先后用2％甲酸水2mL，甲醇2mL淋洗抽干，用5％的氨化甲醇6mL洗脱。40℃左右氮气吹干，加乙腈10mL溶解残渣，旋涡混匀，提取液待衍生化。

衍生化：取40μL提取液，依次加入80μL硼酸缓冲液(同上)和80μL衍生化试剂(同上)，旋涡混匀反应3min后，经高效液相色谱检测。

(2)样本的测定

按如下HPLC检测条件进行测定：色谱柱：Agilent SB-Aq C18色谱柱，柱长：250mm，内径4.6mm，粒径：5μm；柱温：30℃；流动相：0.02mol/L乙酸铵溶液/乙腈梯度洗脱；流速-0.9mL/min；进样量：50μL，检测器：紫外检测器266nm。

(3)测定结果分析

吡利霉素在牛的肌肉、牛奶及牛的肾脏中残留量的定量限为20μg/kg，在牛肝脏中残留的定量限为100μg/kg，可以满足残留检测要求。

根据中华人民共和国农业行业标准《动物性食品中兽药残留检测方法标准编制规则》附录A(规范性附录)，在空白样品中加入适量标准溶液，使样品中浓度分别为LOQ、1MRL、2MRL三个浓度(牛奶和肌肉20、100、200μg/kg；肝脏100、1000、2000μg/kg；肾脏20、200、400μg/kg，回收率71.2～85.9％；批内变异系数小于14.8％，批间变异系数小于12％。本标准中三种浓度的变异系数均小于15％以内，符合兽药残留检测规定。

结果说明，本发明建立牛可食性组织样品中的吡利霉素残留的检测方法，其方法的灵敏度、准确度和精密度均符合农业部规定的兽药残留检测要求。吡利霉素在目前只有液相色谱串联质谱法的相关标准，还没有吡利霉素测定的高效液相色谱法的标准及相关文献报道，本发明的优势是通过衍生化，使吡利霉素用高效液相色谱紫外检测器就能检测出来，且检出限为10μg/L，本发明的优势是通过衍生化，可以采用高效液相色谱检测吡利霉素的残留。

Claims

1.一种吡利霉素药物残留分析方法，其特征在于：

(1)准确称取新鲜牛奶或解冻后的牛肌肉、肾脏样品5g置于离心管中，再加1％甲酸乙腈10mL，旋涡混合1min，8000r/min离心10min，取出上清液，在残渣中加1％甲酸乙腈10mL重复操作一次，合并两次上清液，于55℃水浴旋转蒸干，加入1％的甲酸的50mmol/L乙酸铵溶液5mL溶解残渣，待净化；

(2)将(1)中待净化的样本过MCX柱，依次用甲醇3mL、水3mL和2％的甲酸水溶液3mL活化，加样品提取液至MCX柱中，控制流速小于1mL/min，先后用2％甲酸水2mL，甲醇2mL淋洗抽干，用5％的氨化甲醇6mL洗脱，40℃氮气吹干，加乙腈1mL溶解残渣，旋涡混匀，得到待衍生化的提取液；

(3)取40μL的待衍生化的提取液，依次加入80μL pH＝9.0的0.1mol/L硼酸缓冲液和80μL 0.01mol/L氯甲酸-9-芴基甲酯乙腈溶液，旋涡混匀反应3min后，待上样测定；

(4)按如下HPLC检测条件对样本进行测定：

(a)色谱柱：C18柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm，或相当者；

(b)流动相：A相：0.02mol/L乙酸铵溶液；B相：乙腈，采用梯度洗脱程序；

(c)流速：0.9mL/min；

(d)紫外检测波长：266nm；

(e)柱温：30℃；

(f)进样量：50μL；

上述(b)中的梯度洗脱程序如下：