CN109557206A - 一种畜禽粪便中45种抗生素同时精准检测的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种畜禽粪便中45种抗生素同时精准检测的方法，包括：建立抗生素标准曲线、样品检测等内容。新方法通过筛选得到提取液成分与比例，使得不同性质抗生素同时被提取，实现更多种抗生素同时精准检测。在检测时，降低了检测时45种抗生素整体的RSD，显著降低检测误差，提高了检测的精度。新方法中，在12min内实现了对五大类抗生素中的45种抗生素分离检测，具有可操作性强、高效、快速和准确度高等特点。

Description

一种畜禽粪便中45种抗生素同时精准检测的方法
技术领域
本发明属于固体废弃物资源化技术领域，涉及一种畜禽粪便中45种抗生素的同时精准检测方法。
背景技术
我国是养殖大国，也是抗生素消耗大国，据报道，2013年我国抗生素总使用量约为16.2万吨（约为美国总使用量的9倍），其中52%用于畜禽养殖业。由此可见，我国兽用抗生素消耗已占据举足轻重的地位。兽用抗生素使用后30%～90%随着畜禽粪尿排出体外，且大部分以母体形式存在。而我国，畜禽粪便的主要利用方式为农田利用，因此，畜禽粪便中的抗生素残留又会对土壤、水体等造成二次污染，从而危害人类健康。建立畜禽粪便中多种抗生素同时精准检测方法对研究其环境归趋行为和生态风险提供技术支持。
畜禽粪便中基质复杂，有机物对抗生素的检测造成严重影响。目前关于抗生素残留的检测主要包括微生物法、免疫分析法、毛细管电泳法、高效液相色谱以及液相-质谱联用技术等，其中大部分方法分辨率和灵敏度差、特异性差。然而高效液相色谱-质谱联用技术对抗生素残留提供的信息最多，既可进行抗生素的准确定量又可进行准确定性分析，灵敏度高，可实现畜禽粪便中多种抗生素同时精准检测。例如，“利用高效液相色谱同时检测粪便中多种抗生素的方法”《CN 105548392 A》针对粪便中11种抗生素建立检测方法；“一种定量检测鸡粪中氟喹诺酮类的方法”《CN 103969362 A》针对鸡粪中9种氟喹诺酮类抗生素建立检测方法。相关文献中也有类似报道，例如，Feng等建立了畜禽粪便中13种兽用抗生素的精准检测方法。然而，随着兽用抗生素种类越来越多，以及不同养殖户选择抗生素的习惯不同，畜禽粪便中抗生素残留种类越来越多，并且不同种类抗生素的物理化学性质差异较大，这对多种抗生素的同时精准检测提出了挑战。因此，亟需建立针对更广泛种类抗生素的精准检测方法，目前针对45种（5大类）兽用抗生素的同时精准检测方法未见报道。
发明内容
本发明公开了一种畜禽粪便中45种抗生素的同时精准检测方法，其特征在于按如下的步骤进行：
1、建立抗生素标准曲线
（1）45种抗生素标准品：盐酸土霉素、多西环素、金霉素、去甲基金霉素、四环素、氧氟沙星、恩诺沙星、二氟沙星、司帕沙星、萘啶酸、氟罗沙星、盐酸洛美沙星、沙拉沙星、环丙沙星、达氟沙星、依诺沙星、氟甲喹、西诺沙星、奥比沙星、噁喹酸、诺氟沙星、磺胺二甲异嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺噁唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺二甲（基）嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、苯酰磺胺、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺对甲氧嘧啶、罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、螺旋霉素、替米考星、苯唑西林、青霉素G、氯唑西林，纯度均大于等于95%；
（2）45种抗生素标准储备溶液：分别称取适量标准品，分别用对应的溶剂溶解，其中β-内酰胺类用乙腈:水=1:3溶解，其他的用甲醇溶解，配制成100 mg/L，置于冰箱-20 ℃保存；
（3）标准工作溶液：准确称取抗生素标准储备液适量，用甲醇配制成不同浓度系列的混合标准工作溶液，用时现配；
（4）高效液相色谱条件为：色谱柱：C18柱，ACQUITY UPLC HSS T3，2.1（内径）×100mm，1.8μm 或相当；流动相：A组分是超纯水（含1‰甲酸）；B组分是乙腈；梯度洗脱程序：0～1.5min, 90% A；1.5～8 min, 90～30% A；8～8.1min, 30～90% A；8.1～12 min, 90% A；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL；
（5）所述质谱条件为：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度为500 ℃；脱溶剂气和锥孔气为氮气；碰撞气为高纯氩气；
2、样品检测
（1）称取畜禽粪便鲜样，冷冻干燥，粉碎过2 mm筛；
（2）加入质量体积比为1:20（g:mL）的Tris溶液、乙酸盐溶液、乙腈、甲醇、EDTA-Mcllvaine混合提取液，旋涡混匀；
其中混合提取液Tris溶液：乙酸盐溶液：乙腈：甲醇：EDTA-Mcllvaine缓冲液=1:1:1:1:1～1:1:1:1:2（体积比），涡旋混合时间为30 s～5 min；
Tris溶液：将50mL的0.1mol/L Tris碱溶液与45.7mL的0.1 mol/L HCl混合，加水将体积调至100 mL；
乙酸盐溶液：取醋酸铵25g，加水25mL溶解后，加7mol/L盐酸溶液38mL，用2mol/L盐酸溶液或5mol/L氨溶液准确调节pH值至3.5，用水稀释至100mL，即得；
EDTA-Mcllvaine：称取一定量的Na2HPO4、Na2EDTA和柠檬酸，分别配制成0.2、0.4和0.2mol/L的溶液，柠檬酸溶液与Na2HPO4溶液按照体积比8:5混合，配制成Mcllvaine缓冲液；1L Mcllvaine缓冲液与Na2EDTA溶液体积比1:1混合，得到0.1mol/L的Na2EDTA-MCllvaine提取液；
（3）超声波处理15 min，以3000～10000 rpm离心5～15 min获取上清液，在上述提取液中重复提取2-3次，合并上清液，待用；
（4）提取获得的上清液加入MgCl2和蛭石，体积比为30:1:1(mL:g:g)，混合均匀后，将其置于-20℃冷冻1h，过滤获得液体部分；
（5）将上述液体通过waters PRiME HLB固相萃取柱，速度0.5-1 mL/min，抽真空5 min，用6 ml酸性甲醇、乙腈混合液洗脱柱子，其中甲醇:乙腈为3:7（含1‰甲酸），收集洗脱液；
（6）第5步中将洗脱液于低于40 ℃下氮气吹干，用1.0 mL甲醇:水（1:1，v/v）加1‰甲酸复溶，0.22 μm有机滤膜过滤，用液相色谱-质谱/质谱仪测定；所述高效液相色谱条件为：色谱柱：C18柱，ACQUITY UPLC HSS T3，2.1（内径）×100 mm，1.8 μm 或相当；流动相：A组分是超纯水（含1‰甲酸）；B组分是乙腈；梯度洗脱程序见表1；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL。
梯度洗脱程序
步骤 时间（min） 流速（ml/min） 组分A(%) 组分B(%)
1 0 0.3 90 10
2 1.5 0.3 90 10
3 8 0.3 30 70
4 8.1 0.3 90 10
5 12 0.3 90 10
所述质谱条件为：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度为500 ℃；脱溶剂气和锥孔气为氮气；碰撞气为高纯氩气。
本发明进一步公开了畜禽粪便中45种抗生素同时精准检测方法，在降低检测45种抗生素整体的RSD，降低检测误差，提高检测精度方面的应用。实验结果显示，采用本发明的方法，可以在12min内实现了对五大类抗生素中的45种抗生素的分离检测，具有可操作性强、高效、快速和准确度高等特点。
本发明主要解决了不同种类抗生素同时精准检测问题，使得45种抗生素实现同时精准检测，重点考察了样品中抗生素提取时，所使用不同提取液产生的不同提取效果，主要的难点在于：一是，筛选得到提取液的组分和比例，使45种抗生素同时高效提取；二是，在检测第（4）步骤中需要在提取获得的上清液加入MgCl2和蛭石，才能提高检测效率。
本发明更加详细的描述如下：
一、材料与方法
1、建立抗生素标准曲线
（1）45种抗生素标准品：盐酸土霉素、多西环素、金霉素、去甲基金霉素、四环素、氧氟沙星、恩诺沙星、二氟沙星、司帕沙星、萘啶酸、氟罗沙星、盐酸洛美沙星、沙拉沙星、环丙沙星、达氟沙星、依诺沙星、氟甲喹、西诺沙星、奥比沙星、噁喹酸、诺氟沙星、磺胺二甲异嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺噁唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺二甲（基）嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、苯酰磺胺、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺对甲氧嘧啶、罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、螺旋霉素、替米考星、苯唑西林、青霉素G、氯唑西林，纯度均大于等于95%。
（2）45种抗生素标准储备溶液：分别称取适量标准品，分别用对应的溶剂溶解，其中β-内酰胺类用乙腈:水=1:3溶解，其他的用甲醇溶解，配制成100 mg/L，置于冰箱-20 ℃保存。
（3）标准工作溶液：准确称取抗生素标准储备液适量，用甲醇配制成不同浓度系列的混合标准工作溶液（0, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 μg/L），用时现配。
（4）高效液相色谱条件为：色谱柱：C18柱，ACQUITY UPLC HSS T3，2.1（内径）×100mm，1.8μm 或相当；流动相：A组分是超纯水（含1‰甲酸）；B组分是乙腈；梯度洗脱程序：0～1.5 min, 90% A；1.5～8 min, 90～30% A；8～8.1min, 30～90% A；8.1～12 min, 90%A；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL。
（5）所述质谱条件为：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度为500 ℃；脱溶剂气和锥孔气为氮气；碰撞气为高纯氩气。
2、样品检测
（1）称取畜禽粪便鲜样，冷冻干燥，粉碎过2mm筛；
（2）加入质量体积比为1:20（g:mL）的Tris溶液、乙酸盐溶液、乙腈、甲醇、EDTA-Mcllvaine混合提取液，旋涡混匀；
其中混合提取液Tris溶液：乙酸盐溶液：乙腈：甲醇：EDTA-Mcllvaine=1:1:1:1:1～1:1:1:1:2（体积比），蜗旋混合时间为30 s～5 min。
Tris溶液：将50mL的0.1mol/L Tris碱溶液与45.7mL的0.1mol/L HCl混合，加水将体积调至100mL。
乙酸盐溶液：取醋酸铵25g，加水25mL溶解后，加7mol/L盐酸溶液38mL，用2mol/L盐酸溶液或5mol/L氨溶液准确调节pH值至3.5，用水稀释至100mL，即得。
EDTA-Mcllvaine：称取一定量的Na2HPO4、Na2EDTA和柠檬酸，分别配制成0.2、0.4和0.2mol/L的溶液，柠檬酸溶液与Na2HPO4溶液按照体积比8:5混合，配制成Mcllvaine缓冲液。1L Mcllvaine缓冲液与Na2EDTA溶液体积比1:1混合，得到0.1mol/L的Na2EDTA-MCllvaine提取液。
（3）超声波处理15 min，以3000～10000 rpm离心5～15 min获取上清液，在上述提取液中重复提取2-3次，合并上清液，待用；
（4）提取获得的上清液加入MgCl2和蛭石，比例为30:1:1，混合均匀后，将其置于-20℃冷冻1h，过滤获得液体部分。
（5）将上述液体通过waters PRiME HLB固相萃取柱，速度大约1 mL/min，抽真空5min，用6 mL酸性甲醇、乙腈混合液洗脱柱子（速度控制在1 mL/min左右），其中甲醇:乙腈为3:7（含1‰甲酸），收集洗脱液；
（6）第5步中将洗脱液于低于40 ℃下氮气吹干，用1.0 mL甲醇:水（1:1，v/v）加1‰甲酸复溶，0.22 μm有机滤膜过滤，用液相色谱-质谱/质谱仪测定。
所述高效液相色谱条件为：色谱柱：C18柱，ACQUITY UPLC HSS T3，2.1（内径）×100 mm，1.8 μm 或相当；流动相：A组分是超纯水（含1‰甲酸）；B组分是乙腈；梯度洗脱程序见表1；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL。
表1 梯度洗脱程序
所述质谱条件为：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度为500 ℃；脱溶剂气和锥孔气为氮气；碰撞气为高纯氩气。
二、试验结果
1、所得到的标准曲线如表2所示。
表2 45种抗生素的标准曲线与相关性系数
2、45种抗生素的检测结果
由表2可知不同提取液作用下抗生素回收率有所不用：Tris溶液+乙酸盐溶液+乙腈+EDTA-Mcllvaine提取时，四环素类回收率较低，部分磺胺类回收率低于60%；Tris溶液+乙酸盐溶液+甲醇+EDTA-Mcllvaine提取时四环素类回收率有所提高，但是仍有部分磺胺类抗生素回收率较低；Tris溶液+乙酸盐溶液+乙腈+甲醇+EDTA-Mcllvaine提取时45种抗生素提取效果有所增加。
表3结果可知，Tris溶液：乙酸盐溶液：乙腈：甲醇：EDTA-Mcllvaine =1:1:1:1:2提取时45种抗生素的回收率相对较高，几乎所有抗生素回收率在60～120%之间，而且方法重现性较好。
表3 不同提取液条件下回收率（%）与RSD（%）比较
表4 不同比例提取液条件下回收率（%）与RSD（%）比较
本发明公开的畜禽粪便中45种抗生素的同时精准检测方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：
（1）新方法通过筛选得到提取液成分与比例，使得不同性质抗生素同时被提取，实现更多种抗生素同时精准检测。
（2）在检测时，新的方法增加了粪便抗生素的回收率，更接近与实际含量，提高了检测的准度。
（3）在检测时，降低了检测时45种抗生素整体的RSD，显著降低检测误差，提高了检测的精度。
(4)新方法中，在12min内实现了对五大类抗生素中的45种抗生素分离检测，具有可操作性强、高效、快速和准确度高等特点。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
实施例1
一种畜禽粪便中45种抗生素的同时精准检测方法：
1、建立抗生素标准曲线
（1）45种抗生素标准品：盐酸土霉素、多西环素、金霉素、去甲基金霉素、四环素、氧氟沙星、恩诺沙星、二氟沙星、司帕沙星、萘啶酸、氟罗沙星、盐酸洛美沙星、沙拉沙星、环丙沙星、达氟沙星、依诺沙星、氟甲喹、西诺沙星、奥比沙星、噁喹酸、诺氟沙星、磺胺二甲异嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺噁唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺二甲（基）嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、苯酰磺胺、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺对甲氧嘧啶、罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、螺旋霉素、替米考星、苯唑西林、青霉素G、氯唑西林，纯度均大于等于95%；
（2）45种抗生素标准储备溶液：分别称取适量标准品，分别用对应的溶剂溶解，其中β-内酰胺类用乙腈:水=1:3溶解，其他的用甲醇溶解，配制成100 mg/L，置于冰箱-20 ℃保存；
（3）标准工作溶液：准确称取抗生素标准储备液适量，用甲醇配制成不同浓度系列的混合标准工作溶液，用时现配；
（4）高效液相色谱条件为：色谱柱：C18柱，ACQUITY UPLC HSS T3，2.1（内径）×100mm，1.8μm；流动相：A组分是超纯水（含1‰甲酸）；B组分是乙腈；梯度洗脱程序：0～1.5 min,90% A；1.5～8 min, 90～30% A；8～8.1min, 30～90% A；8.1～12 min, 90% A；流速：0.3mL/min；进样量：5 μL；
（5）所述质谱条件为：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度为500 ℃；脱溶剂气和锥孔气为氮气；碰撞气为高纯氩气；
2、样品检测
（1）称取畜禽粪便鲜样，冷冻干燥，粉碎过2 mm筛；
（2）加入质量体积比为1:20（g:mL）的Tris溶液、乙酸盐溶液、乙腈、甲醇、EDTA-Mcllvaine混合提取液，旋涡混匀；
其中混合提取液Tris溶液：乙酸盐溶液：乙腈：甲醇：EDTA-Mcllvaine=1:1:1:1:2（体积比），蜗旋混合时间为30 s；
Tris溶液：将50mL的0.1mol/L Tris碱溶液与45.7mL的0.1 mol/L HCl混合，加水将体积调至100 mL；
乙酸盐溶液：取醋酸铵25g，加水25mL溶解后，加7mol/L盐酸溶液38mL，用2mol/L盐酸溶液或5mol/L氨溶液准确调节pH值至3.5，用水稀释至100mL，即得；
EDTA-Mcllvaine：称取一定量的Na2HPO4、Na2EDTA和柠檬酸，分别配制成0.2、0.4和0.2mol/L的溶液，柠檬酸溶液与Na2HPO4溶液按照体积比8:5混合，配制成Mcllvaine缓冲液；1L Mcllvaine缓冲液与Na2EDTA溶液体积比1:1混合，得到0.1mol/L的Na2EDTA-MCllvaine提取液；
（3）超声波处理15 min，以10000 rpm离心10 min，获取上清液，在上述提取液中重复提取2-3次，合并上清液，待用；
（4）提取获得的上清液加入MgCl2和蛭石，体积比为30:1:1，混合均匀后，将其置于-20℃冷冻1h，过滤获得液体部分；
（5）将上述液体通过waters PRiME HLB固相萃取柱，速度0.5-1 mL/min，抽真空5 min，用6 mL酸性甲醇、乙腈混合液洗脱柱子，其中甲醇:乙腈为3:7（含1‰甲酸），收集洗脱液；
（6）第5步中将洗脱液于低于40 ℃下氮气吹干，用1.0 mL甲醇:水（1:1，v/v）加1‰甲酸复溶，0.22 μm有机滤膜过滤，用液相色谱-质谱/质谱仪测定；所述高效液相色谱条件为：色谱柱：C18柱，ACQUITY UPLC HSS T3，2.1（内径）×100 mm，1.8 μm 或相当；流动相：A组分是超纯水（含1‰甲酸）；B组分是乙腈；梯度洗脱程序见表1；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL。
梯度洗脱程序
所述质谱条件为：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度为500 ℃；脱溶剂气和锥孔气为氮气；碰撞气为高纯氩气。
实施例2
粪便样品取自天津市郊区1个养猪场，检测结果如下表。
表5 天津市郊区某猪场粪便中抗生素检测

Claims (2)

1.一种畜禽粪便中45种抗生素同时精准检测的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
一、建立抗生素标准曲线
（1）45种抗生素标准品：盐酸土霉素、多西环素、金霉素、去甲基金霉素、四环素、氧氟沙星、恩诺沙星、二氟沙星、司帕沙星、萘啶酸、氟罗沙星、盐酸洛美沙星、沙拉沙星、环丙沙星、达氟沙星、依诺沙星、氟甲喹、西诺沙星、奥比沙星、噁喹酸、诺氟沙星、磺胺二甲异嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺噁唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺二甲（基）嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、苯酰磺胺、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺对甲氧嘧啶、罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、螺旋霉素、替米考星、苯唑西林、青霉素G、氯唑西林，纯度均大于等于95%；
（2）45种抗生素标准储备溶液：分别称取适量标准品，分别用对应的溶剂溶解，其中β-内酰胺类用乙腈:水体积比为1:3溶解，其他的用甲醇溶解，配制成100 mg/L，置于冰箱-20℃保存；
（3）标准工作溶液：准确称取抗生素标准储备液适量，用甲醇配制成不同浓度系列的混合标准工作溶液，用时现配；
（4）高效液相色谱条件为：色谱柱：C18柱，ACQUITY UPLC HSS T3，2.1（内径）×100mm，1.8μm 或相当；流动相：A组分是超纯水（含1‰甲酸）；B组分是乙腈；梯度洗脱程序：0～1.5min, 90% A；1.5～8 min, 90-30% A；8～8.1min, 30～90% A；8.1～12 min, 90% A；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL；
（5）所述质谱条件为：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度为500 ℃；脱溶剂气和锥孔气为氮气；碰撞气为高纯氩气；
二、样品检测
（1）称取畜禽粪便鲜样，冷冻干燥，粉碎过2 mm筛；
（2）加入质量体积比为1:20（g:mL）的Tris溶液、乙酸盐溶液、乙腈、甲醇、EDTA-Mcllvaine混合提取液，旋涡混匀；
其中混合提取液Tris溶液：乙酸盐溶液：乙腈：甲醇：EDTA-Mcllvaine=1:1:1:1:1～1:1:1:1:2（体积比），蜗旋混合时间为30 s～5 min；
Tris溶液：将50mL的0.1mol/L Tris碱溶液与45.7mL的0.1 mol/L HCl混合，加水将体积调至100 mL；
乙酸盐溶液：取醋酸铵25g，加水25mL溶解后，加7mol/L盐酸溶液38mL，用2mol/L盐酸溶液或5mol/L氨溶液准确调节PH值至3.5，用水稀释至100mL，即得；
EDTA-Mcllvaine：称取一定量的Na2HPO4、Na2EDTA和柠檬酸，分别配制成0.2、0.4和0.2mol/L的溶液，柠檬酸溶液与Na2HPO4溶液按照体积比8:5混合，配制成Mcllvaine缓冲液；1L Mcllvaine缓冲液与Na2EDTA溶液体积比1:1混合，得到0.1mol/L的Na2EDTA-Mcllvaine提取液；
（3）超声波处理15 min，以3000～10000 rpm离心5～15 min获取上清液，在上述提取液中重复提取2-3次，合并上清液，待用；
（4）提取获得的上清液加入MgCl2和蛭石，体积比为30:1:1(mL:g:g)，混合均匀后，将其置于-20℃冷冻1h，过滤获得液体部分；
（5）将上述液体通过waters PRiME HLB固相萃取柱，速度0.5-1 mL/min，抽真空5 min，用6 mL酸性甲醇、乙腈混合液洗脱柱子，其中甲醇:乙腈为3:7（含1‰甲酸），收集洗脱液；
（6）第5步中将洗脱液于低于40 ℃下氮气吹干，用1.0 mL甲醇:水（1:1，v/v）加1‰甲酸复溶，0.22 μm有机滤膜过滤，用液相色谱-质谱/质谱仪测定；所述高效液相色谱条件为：色谱柱：C18柱，ACQUITY UPLC HSS T3，2.1（内径）×100 mm，1.8 μm 或相当；流动相：A组分是超纯水（含1‰甲酸）；B组分是乙腈；梯度洗脱程序见表1；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL；
梯度洗脱程序
所述质谱条件为：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度为500 ℃；脱溶剂气和锥孔气为氮气；碰撞气为高纯氩气。
2.权利要求1所述的畜禽粪便中45种抗生素同时精准检测方法在降低检测45种抗生素整体的RSD，降低检测误差，提高检测精度方面的应用。
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