CN107957463B

CN107957463B - 一种土壤中林可霉素残留量的检测方法

Info

Publication number: CN107957463B
Application number: CN201711488116.4A
Authority: CN
Inventors: 王�义; 张鹏; 金昌福; 李宁飞
Original assignee: Ningxia Xiwang Tianye Biological Agricultural Technology Co ltd
Current assignee: Ningxia Xiwang Tianye Biological Agricultural Technology Co ltd
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2021-02-23
Anticipated expiration: 2037-12-29
Also published as: CN107957463A

Abstract

一种土壤中林可霉素残留量的检测方法，它涉及一种土壤中林可霉素残留效价的检测方法，该方法包括对照品溶液的制备、供试品溶液的制备，之后采用高效液相色谱法检测，将上述标准品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪中，根据外标法计算林可霉素效价。本发明通过对色谱条件的优选及供试品、标准品制备方法的试验，建立了土壤中林可霉素的高效液相色谱检测分析方法；通过对色谱条件和净化工艺的优化，建立了土壤中林可霉素的检测方法，通过方法学验证试验研究表明：所建立的方法准确度高、专属性强、重现性良好，能有效检测土壤中残留林可霉素。

Description

一种土壤中林可霉素残留量的检测方法

技术领域

本发明涉及土壤的检测检验技术领域，特别是涉及一种土壤中林可霉素残留效价的检测方法。

背景技术

兽用抗生素用于动物疾病预防、治疗、提高饲料利用率和促进动物生长。随着禽畜养殖业规模的扩大，抗生素使用量也随之增加。兽用抗生素经过动物体内后主要以原药和代谢产物的形式随粪尿排出体外进入土壤，从而导致土壤中抗生素的污染，对生态安全和人体健康产生威胁。相关检测发现，土壤中抗生素的含量已达到11～300μg/kg，主要是磺胺类、喹诺酮类、四环素类抗生素。建立土壤中不同种类抗生素的痕量检测分析方法成为比较热门的探索方向。但土壤中的抗生素主要是对于四环素类抗生素的分析检测，林可霉素的检测报道比较少见，且土壤样品基质复杂，含有大量的有机酸等干扰成分，兽药抗生素残留在土壤中的含量又低，因此对样品前处理和检测的仪器都有很高的要求。

林可霉素类抗生素对大多数革兰氏阳性菌及某些厌氧的革兰氏阴性菌有效，主要用作兽药治疗鸡的慢性呼吸道疾病和耐青霉素G的金色葡萄球菌和链球菌引起的感染，也能促进鸡肉的生长，已经广泛的用于禽畜养殖业中。林可霉素结构稳定可在土壤中存在长达5个月，随着粪肥使用量的增加，其不断在土壤中积累，进而影响土壤微生物群落结构，打破微生态平衡。为降低林可霉素所带来的环境危害，须严格控制进入土壤中林可霉素的含量。因此建立快速、准确的土壤林可霉素检测方法是研究和控制其生态风险的基础。目前抗生素的检测方法主要有微生物检测、酶联免疫法和色谱法。色谱法因检出限低，精密度高应用比较广泛。由于土壤基质复杂，含有大量的有机酸等干扰成分，有效去除杂质，快速定量是检测的重点。

发明内容

本发明的目的是弥补现有技术中无法快速/准确检测土壤中林可霉素的缺陷，没有一种有效解决基质效应影响的问题，提供一种土壤中林可霉素提取且测定残留量的方法，以期为检测土壤中林可霉素的残留量提供方法依据。

本发明的一种土壤中林可霉素残留量的检测方法，它是按照以下步骤进行的：

一、供试品样品制备：

1)取含有林可霉素的土壤，加入提取剂，涡旋振荡1min，于超声中辅助提取30min，以3000～4000rpm离心10min，取上清液；

2)将上清液于30℃水浴旋转蒸发至近干，然后用超纯水复溶，得待处理样品；

3)分别移取甲醇和超纯水对HLB固相萃取柱进行活化后，加入待处理样品，以1mL/min速度过柱，待样液全部流出后，用超纯水进行淋洗，淋洗后抽真空5～10min，分析物用体积百分含量为80％甲醇洗脱，收集洗脱液定容，摇匀，过0.45μm滤膜后，得供试品溶液；

二、标准曲线绘制：

用甲醇将标准贮备液稀释成质量浓度为1.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、50.0mg/L、100.0mg/L、200.0mg/L和500.0mg/L的标准工作溶液，采用高效液相色谱法对上述标准工作溶液进行检测，以测得峰面积作为纵坐标，以标准工作溶液浓度作为横坐标，绘制标准曲线，并求回归方程和相关系数；

三、测定：吸取上述标准工作溶液和供试品溶液注入液相色谱仪中，根据外标法计算泰乐菌素残留量；采用高效液相色谱仪，即完成所述的土壤中林可霉素残留效价的检测；

色谱条件：色谱柱：Waters-XBridge C₁₈柱，色谱柱内径为4.6mm，柱长250mm，填料颗粒直径为5μm，流动相：甲醇-0.05moL/L四硼酸钠十水合物按体积比为55:45的比例混合的溶液，检测波长：214nm，进样量：10μL，流速：1mL/min，柱温：30℃。

本发明包含以下有益效果：

应用本方法进行土壤中林可霉素残留的测定，操作简便，准确度高，林可霉素含量与峰面积具有良好的线性关系，回收率、灵敏度、检出限以及相对标准偏差等均能满足残留分析的要求。经实验证明，该方法能用于各种性质差异较大的土壤，其回收率、灵敏度、检出限等在各批次土壤中都有较好的准确度和精密度。

通过本发明的方法可以有效地从土壤中提取林可霉素，尽最大可能降低土壤中其他杂质对后续检测的影响，从而提高检测的准确度。

(1)本发明首次较完善的提出超声辅助结合固相萃取法提取土壤中林可霉素的高效液相色谱法：第一步超声辅助提取土壤中的林可霉素，第二步固相萃取技术应用于提取液净化和浓缩，第三步高效液相色谱-紫外检测器用于林可霉素含量的测定，此方法简单快速，准确可靠。

(2)本发明灵敏度高，可满足我国对于林可霉素在动物性组织中的最高残留限量的检测要求，可为土壤林可霉素污染鉴定提供一定的技术依据。

本发明的方法对林可霉素在100mg/kg添加浓度水平上回收率为86％～95％；定性检测限为0.037mg/kg，定量检测限为0.059mg/kg；日内变异系数为2％～8％，小于10％；日间变异系数为3％～12％，小于15％。

附图说明

图1为林可霉素标准曲线图；其中，标准曲线的回归方程为y＝1817.3x-721.71；R²＝0.9992；

图2为浓度为100mg/L林可霉素的标准品测定图；

图3为土壤林可霉素样品品图谱。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种土壤中林可霉素残留量的检测方法，它是按照以下步骤进行的：

一、供试品样品制备：

二、标准曲线绘制：

具体实施方式二：本实施方式以具体实施方式一不同的是：林可霉素土壤与提取剂的质量体积比为1g：10mL。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式以具体实施方式一不同的是：所述的提取剂是由磷酸盐与乙腈按体积比为3:4的比例混合而成。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式以具体实施方式一不同的是：步骤3)中甲醇与超纯水的体积比为1:1。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式以具体实施方式一不同的是：该方法的定性检测限为0.037mg/kg，定量检测限为0.059mg/kg。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式以具体实施方式一不同的是：土壤中林可霉素的残留量为800～850mg/Kg。其它与具体实施方式一相同。

本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

通过以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例1

本实施例的一种土壤中林可霉素残留效价的检测方法，包括如下步骤：

仪器：高效液相色谱仪

色谱条件：色谱柱为Waters-XBridge C₁₈柱(4.6mm×250mm,5μm)、流动相：甲醇-0.05moL/L四硼酸钠十水合物＝55:45洗脱，检测波长：214nm，进样量：10μL，流速：1mL/min，柱温：30℃。

1)供试品样品制备：称取样品1g(精确至0.0001g)，于50mL聚丙烯离心管中，加入10mL提取剂(磷酸盐-乙腈V：V＝3:4)，涡旋振荡1min，于超声中辅助提取30min，以3000～4000rpm离心10min，取上清液。将上清液于30℃水浴旋转蒸发至近干，然后用超纯水复溶，定容至4mL。分别移取3mL甲醇、3mL超纯水对HLB固相萃取柱进行活化，加入上述处理所得样品，以1mL/min速度过柱，待样液全部流出后，用3mL超纯水进行淋洗，淋洗后抽真空5～10min，分析物用3mL 80％甲醇洗脱，收集洗脱液定容至3mL。摇匀，过0.45μm滤膜后供液相色谱检测。

2)标准曲线绘制：用甲醇将标准贮备液稀释成质量浓度为1.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、50.0mg/L、100.0mg/L、200.0mg/L和500.0mg/L的标准工作溶液，采用高效液相色谱-质谱联用法对上述标准工作溶液进行检测，以测得峰面积作为纵坐标，以标准溶液浓度作为横坐标，绘制标准曲线，并求回归方程和相关系数；

3)测定：吸取上述标准品溶液和供试品溶液10μL注入液相色谱仪中，进行分析测定。

4)计算：计算分离出的林可霉素对应的峰面积，根据标准曲线进行定量计算，得处林可霉素含量。

5)方法回收率、检测限和定量限：采用加标回收法检测方法的回收率，将空白土壤中加林可霉素标准品溶液制成其浓度为100mg/L,用上述方法检测林可霉素含量，计算本方法的回收率。以3倍信噪比确定检测限，以10倍信噪比确定定量限。实验结果表明本方法的回收率为86％～95％，定性检测限为0.037mg/kg，定量检测限为0.059mg/kg。

实施例2

本实施例的土壤中残留林可霉素检测方法，是按照以下步骤进行的：

仪器：高效液相色谱仪

色谱条件：色谱柱：Waters-XBridge C₁₈柱(4.6mm×250mm,5μm)、流动相：甲醇-0.05moL/L四硼酸钠十水合物＝55:45洗脱，检测波长：214nm，进样量：10μL，流速：1mL/min，柱温：30℃。

2)标准曲线绘制：用甲醇将标准贮备液稀释成各质量浓度的标准溶液5.00mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L、50.0mg/L、100.0mg/L、200.0mg/L、400.0mg/L采用高效液相色谱法对上述标准工作溶液进行检测，测得峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。

方法验证：

在空白土壤样品中的加标浓度分别为20、50、100mg/kg。采用本实验方法进行分析检测，实验室重复进行3次，求得的回收率及其标准偏差，样品中林可霉素的含量按公式(1)计算。

式中：X—样品中林可霉素的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

C—样品溶液中林可霉素的浓度，单位为毫克每升(mg/L)；

m—样品质量，单位为克(g)；

V—样品溶液体积，单位为毫升(mL)

本实施例方法的林可霉素在100mg/kg添加浓度水平上回收率为86％～95％；定性检测限为0.037mg/kg，定量检测限为0.059mg/kg；日内变异系数为2％～8％，小于10％；日间变异系数为3％～12％，小于15％。

Claims

1.一种土壤中林可霉素残留量的检测方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：

一、供试品样品制备：

1）取含有林可霉素的土壤，加入提取剂，涡旋振荡1 min，于超声中辅助提取30 min，以3000～4000 rpm离心10 min，取上清液；

2）将上清液于30℃水浴旋转蒸发至近干，然后用超纯水复溶，得待处理样品；

3）分别移取甲醇和超纯水对HLB固相萃取柱进行活化后，加入待处理样品，以1 mL/min速度过柱，待样液全部流出后，用超纯水进行淋洗，淋洗后抽真空5～10min，分析物用体积百分含量为80%甲醇洗脱，收集洗脱液定容，摇匀，过0.45 μm滤膜后，得供试品溶液；

二、标准曲线绘制：

用甲醇将标准贮备液稀释成质量浓度为1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、50.0 mg/L、100.0 mg/L 、200.0 mg/L和500.0 mg/L的标准工作溶液，采用高效液相色谱法对上述标准工作溶液进行检测，以测得峰面积作为纵坐标，以标准工作溶液浓度作为横坐标，绘制标准曲线，并求回归方程和相关系数；

三、测定：吸取上述标准工作溶液和供试品溶液注入液相色谱仪中，根据外标法计算林可霉素残留量；采用高效液相色谱仪，即完成所述的土壤中林可霉素残留效价的检测；

色谱条件：色谱柱：Waters-XBridge C₁₈柱，色谱柱内径为4.6 mm，柱长250 mm，填料颗粒直径为5 μm，流动相：甲醇-0.05moL/L四硼酸钠十水合物按体积比为55:45的比例混合的溶液，检测波长：214 nm，进样量：10 μL，流速：1 mL/min，柱温：30℃；土壤中林可霉素的残留量为800~850 mg/Kg；该方法的定性检测限为0.037mg/kg，定量检测限为0.059mg/kg；所述的提取剂是由磷酸盐与乙腈按体积比为3:4的比例混合而成。

2.根据权利要求1所述的一种土壤中林可霉素残留量的检测方法，其特征在于林可霉素土壤与提取剂的质量体积比为1g：10mL。

3.根据权利要求1所述的一种土壤中林可霉素残留量的检测方法，其特征在于步骤3）中甲醇与超纯水的体积比为1:1。