CN112666271B - 一种蜂蜜中有机污染物的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蜂蜜中有机污染物通用型前处理的试剂包及其方法和检测应用，特点是该试剂包包括混合盐缓冲溶液和混合有机萃取剂，混合盐缓冲溶液含有2 mol/L甲酸铵、0.1 mol/L的EDTA‑Na₂和1vt%的二甲亚砜并调pH至于4.8；混合有机萃取剂为由乙腈和乙醇按体积比2:1混合而成，其前处理方法步骤如下：称取待测样品于塑料离心管中加入混合盐缓冲溶液，并放入均质陶瓷粒若干颗，漩涡混合，加入混合有机萃取剂，接着漩涡混合后，在0℃下离心取上清液于另一试管中，在35℃水浴中氮吹至一定的大致体积后，加水离心，取上清液供LC‑MS/MS分析，优点是成本低、通用性良好、简便快速，且灵敏度高、准确性好。

Description

一种蜂蜜中有机污染物的检测方法

技术领域

本发明涉及一种蜂蜜中有机污染物通用型的前处理方法，尤其是涉及蜂蜜中有机污染物极性-弱极性目标物的通用型提取试剂及其液质联用(LC-MS/MS)检测的前处理方法和检测应用。

背景技术

蜂蜜是一种深受人们喜爱食用的天然的营养滋补品。由于受人类生产、生活以及环境等因素影响，蜂蜜可能遭受兽药或农药残留、真菌毒素、环境污染物和非法添加物等化学危害因子的污染，已成为蜂蜜安全和质量所关注的关键问题之一。因此，加强对蜂蜜中化学危害因子的检测非常必要，尤其是对原料蜜进行快速全面筛查把关。此外，蜂蜜是一种廉价的农产品，高昂的检测费对蜂农和工厂来说是沉重的经济负担。到目前为止，已有大量关于蜂蜜中多类别有机污染物的GC-MS/MS或LC-MS/MS分析的文献方法和标准方法，前处理主要采用固相萃取法和QuEChERS法。由于涉及的化学因子不仅数量庞大，而理化性质差异大，现有的前处理方法在通用性、检测效率、检测成本等方面仍不同程度存在一定问题。为了保障蜂蜜的质量与安全，尤其对于原料蜜的快筛，开发出一种通用的、快速的、低成本的测定蜂蜜中化学污染物的测定前处理方法和分析方法具有十分重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种成本低、通用性良好、简便快速，并且准确性好的蜂蜜中有机污染物通用型前处理的试剂包及其方法和检测应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种蜂蜜中有机污染物的通用型前处理试剂包，包括混合盐缓冲溶液和混合有机萃取剂，所述的混合盐缓冲溶液含有2mol/L甲酸铵、0.1mol/L的EDTA-Na₂和体积百分比为 1％的二甲亚砜(DMSO)，并用甲酸调整pH至于4.8；所述的混合有机萃取剂为由乙腈和乙醇按体积比2:1的比例混合而成。适合比例的乙腈和乙醇，可以将水相从糖分中萃取到有机相中，而糖分很难进入该有机相，从而大幅提高极性化合物的回收率。

2、一种蜂蜜中有机污染物的通用型前处理方法，具体步骤如下：称取5g待测样品于塑料离心管中，加入3mL的混合盐缓冲溶液，并放入均质陶瓷粒若干颗，漩涡混合5 min，加入混合有机萃取剂27mL，接着漩涡混合5min后，在0℃下，4500转/min离心10 min，取6mL上清液于另一只15mL试管中，在35℃水浴中，氮吹至1.2-1.4mL，加水至 1.5mL，在0℃下，12000转/min离心5min，取上清液供LC-MS/MS分析，所述的混合盐缓冲溶液含有2mol/L甲酸铵、0.1mol/L的EDTA-Na₂和体积百分比为1％的二甲亚砜，并用甲酸调整pH至于4.8；所述的混合有机萃取剂为由乙腈和乙醇按体积比2:1的比例混合而成。

3、一种蜂蜜中有机污染物的检测方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理

称取5g待测样品于塑料离心管中，加入3mL的混合盐缓冲溶液，并放入均质陶瓷粒(5× 10mm，为了混匀充分)若干颗，漩涡混合5min，加入混合有机萃取剂27mL，接着漩涡混合5min后，在0℃下，4500转/min离心10min，取6mL上清液于另一只15mL试管中，在35℃水浴中，氮吹至1.2-1.4mL，加水至1.5mL，在0℃下，12000转/min离心5 min，取上清液供LC-MS/MS分析；

(2)标准曲线制作

分别配制四环素、青霉素V、恩诺沙星、克罗特罗、心安得、金刚烷胺、丙基硫脲嘧啶、氟甲砜霉素、甲硝唑、林可霉素、红霉素、多菌灵、磺胺对甲氧嘧啶、三甲氧苄胺嘧啶、舒林酸、孔雀石绿、杀虫脒、氯丙嗪、盐霉素、克百威、黄曲霉毒素B1、吡氟禾草灵、醋酸地塞米松、醋酸追宝龙、罗丹明B、6-苄基氨基嘌呤、辛硫磷、联苯菊酯、定虫脒、三环唑、哒螨灵、腈菌唑、氯霉素、磺胺硝苯、己烯雌酚、三溴水杨酰苯胺、尼卡巴嗪、对羟基苯甲酸乙酯和BPA双酚A的一系列标准溶液，在空白样品中加入混合标准溶液0，25，50， 100，200，400和800μL标准溶液，静置20min后，按样品前处理方法进行样品提取和净化后，以浓度为横坐标，响应值为纵坐标，做基质添加标准曲线；

(3)LC-MS/MS条件

液相色谱为Waters Acquity UPLC；质谱为Waters Xevo TQS；色谱柱为AcquityWaters HSS- T₃ C₁₈(2.1mm×100mm，1.8μm)；柱温：45℃；流路切换：0～2.5min切换阀打开，色谱柱流出液进入废液，2.5min后开始质谱采集；通过多反应监测(MRM)进行数据采集，正、负离子模式毛细管电压分别为3.5和3.0kV，离子源温度：150℃，去溶剂气温度： 500℃；去溶剂流速：950L/h；锥孔流速：150L/h；碰撞气体：氩气3.3×10^-3mba。流速、梯度洗脱条件分别见表1，通过两次进样完成；

表1目标物的UPLC流动相梯度参数设置

其中流动相^a含甲酸0.1％(v/v)的水；^b含甲酸0.1％(v/v)的甲醇；^c含乙酸铵2mmol/L水溶液；^d甲醇；

(4)浓度计算

样品中待测物的含量根据如下计算公式(1)得到：

式中：

X－试样中待测物含量，单位为μg/kg；

C－试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为ng/mL；

V－定容体积，单位为mL；

m－试样质量，单位为g；

F—稀释因子。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、混合缓冲液多功能设计：不仅具有螯合钙镁离子的功能，而且其高盐度在乙醇的配合下，发挥了阻止糖分进入有机相的作用。其次，其pH为4.8，既发挥了一定的沉淀蛋白的作用，且绝大多数目标物可获得更好的稳定性；

2、通用性强，适合极性-弱极性范围的有机物污染物：如抗病毒药物、四环素类、β-内酰胺类、喹诺酮类、甲状腺抑制剂类、β-激动剂、阻断剂类、苯并咪唑类、砜类抗菌剂、硝基咪唑类、喹恶啉类、磺胺类及增效剂、林可酰胺&大环内酯类、镇静安眠类、抗球虫药类 (三嗪类)、三苯甲烷类染料、酰胺醇类抗球虫药类、非甾类消炎药类、真菌毒素类、防腐剂类、糖皮质激素、雌激素、孕激素雄激素、阿维菌素类、聚醚类、除草剂类农药、杀虫剂类农药、杀菌剂类农药、杀螨剂类农药等数百种常见农兽药、真菌毒素、环境污染物和非法添加物等类别(具体见表2和3，由于同类物理化性质基本接近，每类物质仅选择典型一种代表物质进行验证)。但不适合氨基糖苷类抗生素、草甘膦等强极性目标物，以及非极性农药和污染物；

3、操作步骤少，简便快捷，检测效率高且重复性良好。除浓缩外，基本一步同时完成提取和净化，不需要使用固相萃取步骤，样品通量高；

4、成本消耗极低。无须使用固相萃取小柱或QuEChERS耗材。

附图说明

图1为蜂蜜中添加标准品典型图谱(左边为Run1，右边为Run2)。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例一

一种蜂蜜中有机污染物的通用型前处理试剂包，包括混合盐缓冲溶液和混合有机萃取剂，所述的混合盐缓冲溶液含有2mol/L甲酸铵、0.1mol/L的EDTA-Na₂和体积百分比为1％的二甲亚砜(DMSO)，并用甲酸调整pH至于4.8；所述的混合有机萃取剂为由乙腈和乙醇按体积比2:1的比例混合而成。适合比例的乙腈和乙醇，可以将水相从糖分中萃取到有机相中，而糖分很难进入该有机相，从而大幅提高极性化合物的回收率。

具体实施例二

一种蜂蜜中有机污染物的通用型前处理方法，具体步骤如下：称取5g待测样品于塑料离心管中，加入3mL的混合盐缓冲溶液，并放入均质陶瓷粒(5×10mm，为了混匀充分)若干颗，漩涡混合5min，加入混合有机萃取剂27mL，接着漩涡混合5min后，在0℃下，4500 转/min离心10min，取6mL上清液于另一只15mL试管中，在35℃水浴中，氮吹至1.2- 1.4mL，加水至1.5mL，在0℃下，12000转/min离心5min，取上清液供LC-MS/MS分析，其中混合盐缓冲溶液含有2mol/L甲酸铵、0.1mol/L的EDTA-Na₂和体积百分比为1％的二甲亚砜(DMSO)，并用甲酸调整pH至于4.8；混合有机萃取剂为由乙腈和乙醇按体积比2:1的比例混合而成。

具体实施例三

1、标准品与试剂

抗病毒药物、四环素类、β-内酰胺类、喹诺酮类、甲状腺抑制剂类、β-激动剂、阻断剂类、苯并咪唑类、砜类抗菌剂、硝基咪唑类、喹恶啉类、磺胺类及增效剂、林可酰胺&大环内酯类、镇静安眠类、抗球虫药类(三嗪类)、三苯甲烷类染料、酰胺醇类抗球虫药类、非甾类消炎药类、真菌毒素类、防腐剂类、糖皮质激素、雌激素、孕激素雄激素、阿维菌素类、聚醚类、除草剂类农药、杀虫剂类农药、杀菌剂类农药、杀螨剂类农药等数百种常见农兽药、真菌毒素、环境污染物等类别典型代表41种标准物质购自Dr.Ehrenstorfer，Sigma- Aldrich,Witega和EU pharmacopoeia等公司(具体见表2和3，由于同类物理化性质基本接近，每类物质仅选择典型一种代表物质进行验证)。根据各自的溶解性质和纯度，分别用乙腈-乙醇(50：50，v/v)或乙腈-二甲亚砜(50：50，v/v)，配制成0.5mg/mL。用移液器吸取适量的各单标，用乙腈定容至200ng/mL的标准工作溶液，-18℃冷藏，标准工作溶液每2个月重新配制。乙腈、乙醇、甲醇、甲酸和乙酸铵由美国天地公司提供(HPLC级别)。其他试剂均为分析纯。水由Milli-Q纯水仪(Millipore)纯化得到。

2、前处理步骤

称取5g待测样品于塑料离心管中，加入3mL的混合盐缓冲溶液，并放入均质陶瓷粒(5× 10mm，为了混匀充分)3颗，漩涡混合5min，加入混合有机萃取剂(乙腈+乙醇，按2:1 的体积比)27mL，接着漩涡混合5min。在0℃下，4500转/min离心10min，取6mL上清液于另一只15mL试管中，在35℃水浴中，氮吹至1.3mL左右，加水至1.5mL，在0℃下，12000转/min离心5min，上清液供LC-MS/MS分析。

3、仪器分析条件

液相色谱为Waters Acquity UPLC；质谱为Waters Xevo TQS；色谱柱为AcquityWaters HSS- T₃ C₁₈(2.1mm×100mm，1.8μm)；柱温：45℃；流路切换：0～2.5min切换阀打开，色谱柱流出液进入废液，2.5min后开始质谱采集。通过多反应监测(MRM)进行数据采集，正、负离子模式毛细管电压分别为3.5和3.0kV，离子源温度：150℃，去溶剂气温度： 500℃；去溶剂流速：950L/h；锥孔流速：150L/h；碰撞气体：氩气3.3×10^-3mba。流速、梯度洗脱条件分别见表1，通过两次进样完成。

表1.目标物的UPLC流动相梯度参数设置

其中流动相^a含甲酸0.1％(v/v)的水；^b含甲酸0.1％(v/v)的甲醇；^c含乙酸铵2mmol/L水溶液；^d甲醇。

4、方法验证

分别配制四环素、青霉素V、恩诺沙星、克罗特罗、心安得、金刚烷胺、丙基硫脲嘧啶、氟甲砜霉素、甲硝唑、林可霉素、红霉素、多菌灵、磺胺对甲氧嘧啶、三甲氧苄胺嘧啶、舒林酸、孔雀石绿、杀虫脒、氯丙嗪、盐霉素、克百威、黄曲霉毒素B1、吡氟禾草灵、醋酸地塞米松、醋酸追宝龙、罗丹明B、6-苄基氨基嘌呤、辛硫磷、联苯菊酯、定虫脒、三环唑、哒螨灵、腈菌唑、氯霉素、磺胺硝苯、己烯雌酚、三溴水杨酰苯胺、尼卡巴嗪、对羟基苯甲酸乙酯和BPA双酚A的一系列标准溶液，在空白样品中加入混合标准溶液0，25，50， 100，200，400和800μL标准溶液，静置20min后，按上述前处理方法进行样品提取和净化后，以浓度为横坐标，响应值为纵坐标，做基质添加标准曲线，作为定量的依据；

为了考察潜在的干扰峰，对15个不同的空白样品进行前处理并分析。以10倍信噪比作为定量检测限。在空白样品中，加入混合标准溶液0，5，10，25，50μL，以信号大于10倍基线噪音确定最低定量限。在空白样品中加入混合标准溶液100、200和400μL，按上述前处理方法处理后进行测定，每个水平重复6次，测定三个添加水平的回收率和精密度。

5、浓度计算方法

样品中待测物的含量根据如下计算公式(1)得到：

式中：

X－试样中待测物含量，单位为μg/kg；

C－试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为ng/mL；

V－定容体积，单位为mL；

m－试样质量，单位为g；

F—稀释因子(超出线性范围应稀释进样)。

6、方法学验证结果

在受试的41种代表性化合物中，经过优化的前处理方法制备后，没有受到复杂的样品基体对分析的明显干扰。所有目标化合物均具有良好的线性关系，线性回归系数(R)均高于 0.99。检出限为0.05～2μg/kg。在选择的条件下，平均回收率范围为57.3％至133.2％，相应的RSD值为1.6％至21.2％。无论从灵敏度、线性、回收率和精密度验证方法可行性。提高效率和极性覆盖范围，将在日常监测程序挥发积极作用。(见表2和表3，部分目标物的谱图参见图1)

表2正离子模式下，通过Run1测定的蜂蜜中21种化合物的保留时间(R.T.)、定量和定性离子对、校准曲线斜率、线性度、定量限(LOQs)、平均回收率及其重复性(n＝6)

表3正负离子切换模式下，通过运行2(Run2)测定的蜂蜜中20种化合物的保留时间(R.T.)、定量和定性离子对、校准曲线斜率、线性度、定量限(LOQs)、平均回收率及其重复性(n＝6)

由于精力和经费有限，验证仅涉及上述代表性目标化合物，方法适用的范围更宽。但该方法不适合强极性目标物，如氨基糖苷类、草甘膦等。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种蜂蜜中有机污染物的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）样品前处理

称取5 g待测样品于塑料离心管中，加入3 mL的混合盐缓冲溶液，并放入均质陶瓷粒若干颗，漩涡混合5 min，加入混合有机萃取剂27 mL，接着漩涡混合5 min后，在0℃下，4500转/min离心10 min，取6 mL上清液于另一只试管中，在35℃水浴中，氮吹至1.2-1.4 mL，加水至1.5 mL，在0℃下，12000转/min离心5 min，取上清液供LC-MS/MS分析，所述的混合盐缓冲溶液含有2 mol/L甲酸铵、0.1 mol/L的EDTA-Na₂和体积百分比为1%的二甲亚砜，并用甲酸调整pH至于4.8；所述的混合有机萃取剂为由乙腈和乙醇按体积比2:1的比例混合而成；

（2）标准曲线制作

分别配制四环素、青霉素V、恩诺沙星、克罗特罗、心安得、金刚烷胺、丙基硫脲嘧啶、氟甲砜霉素、甲硝唑、林可霉素、红霉素、多菌灵、磺胺对甲氧嘧啶、三甲氧苄胺嘧啶、舒林酸、孔雀石绿、杀虫脒、氯丙嗪、盐霉素、克百威、黄曲霉毒素B1、吡氟禾草灵、醋酸地塞米松、醋酸追宝龙、罗丹明B、6-苄基氨基嘌呤、辛硫磷、联苯菊酯、定虫脒、三环唑、哒螨灵、腈菌唑、氯霉素、磺胺硝苯、己烯雌酚、三溴水杨酰苯胺、尼卡巴嗪、对羟基苯甲酸乙酯和BPA双酚A的一系列标准溶液，在空白样品中加入混合标准溶液0，25，50，100，200，400和800 μL标准溶液，静置20 min后，按上述前处理方法进行样品提取和净化后，以浓度为横坐标，响应值为纵坐标，做基质添加标准曲线；所述的标准溶液配制方法为：根据各标准品的溶解性质和纯度，分别用体积比为50：50的乙腈-乙醇或体积比为50：50的乙腈-二甲亚砜配制成0.5 mg/mL，用移液器吸取适量的各单标，用乙腈定容至200 ng/ mL；

（3）LC-MS/MS条件

液相色谱为Waters Acquity UPLC；质谱为Waters Xevo TQS；色谱柱为AcquityWaters HSS-T₃ C₁₈，2.1 mm ×100 mm，1.8 μm；柱温：45℃；流路切换：0~2.5 min 切换阀打开，色谱柱流出液进入废液，2.5 min后开始质谱采集；通过多反应监测进行数据采集，正、负离子模式毛细管电压分别为3.5和3.0 kV，离子源温度：150℃，去溶剂气温度：500℃；去溶剂流速：950 L/h；锥孔流速：150 L/h；碰撞气体：氩气3.3×10^-3 mba，流速、梯度洗脱条件分别见表1，通过两次进样完成；在正离子模式下，通过Run1测定的蜂蜜中21种化合物的保留时间、定量和定性离子对见下表2，在正负离子切换模式下，通过Run2测定的蜂蜜中20种化合物的保留时间、定量和定性离子对见下表3；

表1目标物的UPLC流动相梯度参数设置

其中流动相^a含甲酸0.1% ，v/v的水； ^b含甲酸0.1%， v/v的甲醇； ^c含乙酸铵2 mmol/L水溶液；^d 甲醇；

表2 在正离子模式下，通过Run1测定的蜂蜜中21种化合物的保留时间、定量和定性离子对

；

表3 在正负离子切换模式下，通过Run2测定的蜂蜜中20种化合物的保留时间、定量和定性离子对

；

（4）浓度计算

样品中待测物的含量根据如下计算公式（1）得到：

…(1)，式中：

X－试样中待测物含量，单位为μg/kg；

C－试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为ng/ mL；

V－定容体积，单位为 mL；

m－试样质量，单位为g；

F— 稀释因子。

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