CN114200053A - 一种沼液中多种类兽药残留的同时检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于环境检测技术领域，公开了一种沼液中多种类兽药残留的同时检测方法，包括样品前处理、混合标准溶液配制及样品检测。本发明基于LC‑MS/MS，通过优化样品前处理和实验仪器参数，建立了检测方法。通过特定的样品前处理，本发明方法具有操作简便、净化效果强、基质效应低等优势；本发明中所有检测项目在线性范围内的相关系数r2均大于0.99，具有良好的线性关系，具有高灵敏性的优势；并且根据不同化合物的极性差别，通过分组采用正负离子扫描模式，可一次性实现17大类79种兽药的同时分析，具有高通量的优势；本发明提供的检测方法为人体健康监督管理提供了技术保障。

Description

一种沼液中多种类兽药残留的同时检测方法
技术领域
本发明属于环境检测技术领域，具体涉及一种沼液中多种类兽药残留的同时检测方法。
背景技术
以人类或禽畜粪便、农作物秸秆、树木残枝枯叶和餐厨垃圾为原料的厌氧发酵产沼气工艺给我国农村人民的生活带来了极大的便利和清洁的能源。随着沼气工程的建设和推广，对生产残留物——沼液进行合理的应用是农村生态化和可持续发展的必然要求。一方面，沼液富含有机质，具有突出的肥效和杀菌作用，已被广泛使用在浸种、施肥及喂食禽畜和水产品以提高产能和经济效益。但另一方面，沼液的成分复杂、品质不一，其中残留的多种类兽药有可能随着使用过程对农作物、禽畜和水产品造成二次污染，进而影响食品安全和人群健康。因此，有必要对沼液中多种类兽药进行测定，为人体健康监督管理提供技术保障。
然而，目前国内外对沼液中兽药残留的研究较少，检测手段相对匮乏。已有的研究多侧重于养殖废水、禽畜粪便基底或者沼液中单一种类兽药的检测，如利用高效液相紫外可见检测器或者LC-MS/MS对沼液中磺胺或者四环素进行检测等，目前，关于沼液中多种类兽药的同时测定方法尚未见报道。这是由于沼液样品基质复杂，并且不同种类兽药的理化性质各异，从而难以实现多种类兽药残留的同时提取、净化和检测。
综上，如何建立一种样品前处理简单、高效快速、可同时检测多种类兽药残留的检测方法是目前国内外研究的热点和难点。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中无法同时检测沼液中多种类兽药残留的缺陷，而提供一种沼液中多种类兽药残留的同时检测方法，该方法样品前处理简单、灵敏度高、稳定性好，可以同时实现共17大类79种兽药残留的检测。
具体地，本发明提供了一种沼液中多种类兽药残留的同时检测方法，所述多种类兽药包括磺胺类、喹诺酮类、β-受体激动剂、大环内酯类、四环素类、β-内酰胺类、工业染料类、雄激素类、硝基呋喃及其代谢物类、雌激素类、氯霉素类、乙胺嘧啶、喹乙醇、卡巴氧、螺旋霉素、玉米赤酶醇和尼卡巴嗪共17类79种兽药；该检测方法包括以下步骤：
(1)样品前处理
将HLB柱依次用甲醇和超纯水进行活化，得到活性HLB柱；将新鲜沼液高速离心后用0.1～0.3μm水系滤膜过滤，之后将所得澄清沼液采用超纯水稀释，得到稀释沼液样品；于稀释沼液样品中加入Na2EDTA后摇匀，以4～6mL/min的流速通过活性HLB柱进行上样；上样结束后用甲醇-水进行淋洗，淋洗结束并抽干后依次用甲醇、甲醇-二氯甲烷进行洗脱；将所得洗脱液在35～45℃下氮吹至干后进行定容，最后经0.1～0.3μm有机滤膜过滤得到待测样品溶液，待LC-MS/MS检测；其中，所述活性HLB柱中填料干重和柱内体积与新鲜沼液的比例为(0.5～1)g:(6～20)mL:2mL，所述稀释沼液样品的稀释比例为100～200倍；
(2)混合标准溶液配制
将17类79种兽药标准品配制成0.02～500μg/L系列梯度的混合标准溶液，-25℃～-18℃下避光保存；
将10种替代物标准品混合配制成1mg/mL的混合标准溶液，-25℃～-18℃下避光保存；
(3)样品检测
将兽药标准品和替代物标准品的混合标准溶液进行LC-MS/MS测定，得到标准工作曲线；将待测样品溶液进行LC-MS/MS测定，采用外标法定量，将所得检测曲线与标准工作曲线进行比对，得到待测样品溶液中各种类兽药的种类及含量。
在一种优选的实施方式中，步骤(1)中，相对于2mL沼液，所述Na2EDTA的用量为0.1～0.2g。
在一种优选的实施方式中，步骤(2)中，所述79种兽药标准品包括：磺胺类：磺胺甲恶唑、胺甲噻二唑、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺喹恶啉、磺胺氯哒嗪、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺二甲基异嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲异恶唑、磺胺硝苯、磺胺甲氧哒嗪；喹诺酮类：环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星、氟甲喹、麻保沙星、沙拉沙星、恶喹酸；β-受体激动剂：莱克多巴胺、克伦特罗、特步他林、沙丁胺醇、西马特罗、非诺特罗、氯丙那林、妥布特罗、喷布特罗；大环内酯类：红霉素、泰乐菌素、替米考星、林可霉素；四环素类：土霉素、金霉素、四环素、强力霉素；β-内酰胺类：阿莫西林、头孢噻呋、青霉素G、双氯青霉素、苯唑青霉素、氯唑青霉素、氨苄青霉素；工业染料类：结晶紫、隐性结晶紫、隐性孔雀石绿、孔雀石绿；雄激素类：甲基睾丸酮、丙酸睾丸酮；硝基呋喃及其代谢物类：呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林、NP-AOZ、NP-AMOZ、NP-AHD、NP-SCA；雌激素类：己烯雌酚、雌三醇、雌二醇、己烷雌酚、双烯雌酚、氯地孕酮；氯霉素类：氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素；其他类：乙胺嘧啶、喹乙醇、卡巴氧、螺旋霉素、玉米赤酶醇、尼卡巴嗪。
在一种优选的实施方式中，步骤(2)中，10种替代物标准品为莱克多巴胺-d3、克伦特罗-d9、沙丁胺醇-d3、隐性孔雀石绿-d5、孔雀石绿-d5、NP-AOZ-d4、NP-AMOZ-d5、NP-AHD-13C3、NP-SCA-13C15N2和氯霉素-d5。
在一种优选的实施方式中，所述LC-MS/MS测定过程中液相色谱条件包括：色谱柱为Phenomenex Kinetex C18；柱温为30℃；流速为0.25mL/min；样品进样量为10μL；其中，将目标物分为ESI+A项目组、ESI+B项目组和ESI-C项目组，共三组；ESI+A项目组、ESI+B项目组使用的流动相为含0.10％甲酸的超纯水A1相和含0.10％甲酸的乙腈B1相，ESI-C项目组使用的流动相为超纯水A2相和乙腈B2相，采用梯度洗脱方式且梯度洗脱流程如下：
(1)ESI+A、ESI+B项目组的梯度洗脱程序：0～2min的流动相为90％A1相和10％B1相；2.01～12min的流动相为85％A1相和15％B1相；12.01～16min的流动相为75％A1相和25％B1相；16.01～26min的流动相为20％A1相和80％B1相；26.01～30min的流动相为90％A1相和10％B1相；
(2)ESI-C项目组的梯度洗脱程序：0～1min的流动相为75％A2相和25％B2相；1.01～5min的流动相为55％A2相和45％B2相；5.01～12min的流动相为20％A2相和80％B2相；12.01～15min的流动相为75％A2相和25％B2相。
在一种优选的实施方式中，用于ESI+A项目组测试的兽药分别为磺胺甲恶唑、胺甲噻二唑、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺喹恶啉、磺胺氯哒嗪、磺胺甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺二甲基异嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲异恶唑、磺胺硝苯、磺胺甲氧哒嗪、环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星、氟甲喹、麻保沙星、沙拉沙星、恶喹酸、土霉素、金霉素、四环素、强力霉素、结晶紫、隐性结晶紫、隐性孔雀石绿、孔雀石绿和氯地孕酮。
在一种优选的实施方式中，用于ESI+B项目组测试的兽药分别为莱克多巴胺、克伦特罗、特步他林、沙丁胺醇、西马特罗、非诺特罗、氯丙那林、妥布特罗、喷布特罗、泰乐菌素、替米考星、红霉素、林可霉素、阿莫西林、头孢噻呋、青霉素G、双氯青霉素、苯唑青霉素、氯唑青霉素、氨苄青霉素、甲基睾丸酮、丙酸睾丸酮、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林、NP-AOZ、NP-AMOZ、NP-AHD、NP-SCA、乙胺嘧啶、喹乙醇、卡巴氧和螺旋霉素。
在一种优选的实施方式中，用于ESI-C项目组测试的兽药分别为己烯雌酚、雌三醇、雌二醇、己烷雌酚、双烯雌酚、氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素、玉米赤酶醇和尼卡巴嗪。
在一种优选的实施方式中，所述LC-MS/MS测定过程中质谱条件包括：离子源为电喷雾电离；正负离子扫描；离子源温度为350℃；毛细管电压为4000V；雾化气流速为12L/min；多反应监测扫描。
本发明具有以下技术效果：
(1)本发明将稀释沼液样品经Na2EDTA处理后，通过活性HLB柱进行上样处理，用甲醇-水进行淋洗，最后经甲醇、甲醇-二氯甲烷洗脱，将活性HLB柱中填料干重和柱内体积与沼液的比例控制在(0.5～1)g:(6～20)mL:2mL，沼液的稀释比例控制在100～200倍；以如此特定的样品前处理方法能够提高待测兽药的回收率、净化效果强同时能有效地降低基质效应以增强质谱响应。
(2)本发明根据各种类化合物的极性差别，通过分组采用正负离子扫描模式，可一次性实现17大类79种兽药的同时分析，满足高通量的快速检测要求。
(3)本发明所提供的检测方法中所有检测项目在线性范围内的相关系数r2均大于0.99，具有良好的线性关系，可见本检测方法准确性高、重现性好，满足高灵敏度的快速检测要求。
附图说明
图1为ESI+A项目组目标兽药的TIC谱图；
图2为ESI+B项目组目标兽药的TIC谱图；
图3为ESI-C项目组目标兽药的TIC谱图。
具体实施方式
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例和对比例中所采用的仪器和试剂如下：
液相色谱柱：Phenomenex Kinetex C18(100mm×3mm,2.6μm,美国菲罗门)；液相串联质谱仪：Agilent 6490Triple Quad LC-MS/MS(美国安捷伦)；12通道固相萃取装置(上海安谱科学仪器有限公司)；HLB柱(500mg/6mL，美国Waters公司)；纯水仪：Milli-QAdvantage(美国Millipore公司)；氮吹仪：DC-24-RT(上海安谱科学仪器有限公司)；滤膜：0.22μm水系滤膜、0.22μm PVDF过滤器；
试剂：甲醇和二氯甲烷均为色谱纯；水为超纯水；Na2EDTA分析纯，购自国药集团；79种兽药标准品和10种同位素替代物标准品购自自德国奥格斯堡公司和美国Sigma公司。
实施例
(1)样品采集及制备
用500mL聚四氟乙烯塑料瓶直接采集从出液管流出的新鲜沼液，样品于5000r/min下离心15min后保存于50mL玻璃瓶中-18℃条件下冷冻保存；
(2)样品前处理
将HLB柱(500mg/6mL)依次用6mL甲醇和6mL超纯水进行活化，得到活性HLB柱；在198mL超纯水中加入2mL经0.22μm水系滤膜过滤后的沼液，得到稀释沼液样品；于稀释沼液样品中加入0.1gNa2EDTA后摇匀，以4～6mL/min的流速通过活性HLB柱进行上样；上样结束后用6mL甲醇-水(5:95,v/v)进行淋洗，抽干后依次用8mL甲醇、4mL甲醇-二氯甲烷(1:1,v/v)进行洗脱；将所得洗脱液在40℃下氮吹至干后进行定容至1.0mL，最后经0.22μmPVDF过滤器过滤后得到待测样品溶液，待LC-MS/MS检测；
(3)配制混合标准溶液
分别准确称取17类79种兽药10mg于10mL容量瓶中，分别用甲醇溶解稀释定容为1mg/mL的单标储备溶液；
分别准确移取适量的单标储备溶液与用甲醇稀释成混合标准溶液，用甲醇稀释，最终配制成0.02～500μg/L系列梯度的混合标准溶液，混合标准溶液的浓度分别为0.02μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、100μg/L和500μg/L；于-25℃～-18℃下避光保存；
分别准确称取10种替代物标准品10mg于10mL容量瓶中，分别用甲醇溶解稀释定容为1mg/mL的单标储备溶液，-25℃～-18℃下避光保存；
(4)样品检测
在最优目标物的母离子(PI)、子离子(DI)和碰撞能(CE)各质谱参数下分别测定0.02～500μg/L等系列浓度的目标兽药混标溶液，以浓度为横坐标、定量离子响应为纵坐标，绘制工作曲线；将待测样品溶液进行LC-MS/MS测定，采用外标法定量，将所得检测曲线与标准工作曲线进行比对，得到待测样品溶液中各种类兽药的含量；
LC-MS/MS检测过程中，液相色谱条件包括：柱温为30℃，流速为0.25mL/min，样品进样量为5μL；目标组ESI+A、B的流动相为含0.1％(v/v)甲酸的超纯水A1相和含0.1％(v/v)甲酸的乙腈B1相，梯度洗脱程序如表1所示；目标组ESI-C的流动相为超纯水A2相和乙腈B2相，梯度洗脱程序如表2所示；
表1 HPLC的梯度洗脱程序
时间(min) A<sub>1</sub>相(％) B<sub>1</sub>相(％)
0～2 90 10
2.01～12 85 15
12.01～16 75 25
16.01～26 20 80
26.01～30 90 10
表2 HPLC的梯度洗脱程序
时间(min) A<sub>2</sub>相(％) B<sub>2</sub>相(％)
0～1 75 25
1.01～5 55 45
5.01～12 20 80
12.01～15 75 25
LC-MS/MS检测过程中，质谱条件包括：采用电喷雾离子源(ESI)；正负离子扫描；离子源温度为350℃；毛细管电压为4000V；雾化气流速为12L/min；多反应监测扫描。
17类79种兽药和10种替代物的母离子(PI)、子离子(DI)和碰撞能(CE)等相关信息见表3，其中标注*为定量离子；编号中的D、C后缀分别表示氘代物和13C代物；PI前的“-”表示负离子检测。所有目标检测项目、替代物的离子流图见图1～3。从图1～3可知，在此优化的质谱参数条件下，质谱信号强，灵敏度高，且各峰形对称，有利于定性、定量分析；各种类兽药的峰位置见图中标记。
表3 79种兽药的质谱采集数据
Figure BDA0003405144590000071
Figure BDA0003405144590000081
Figure BDA0003405144590000091
Figure BDA0003405144590000101
本发明采用外标法定量，确定本方法的线性范围和相关系数r2；17类79种兽药和10种替代物的线性范围和相关系数r2的结果见表4。
表4 79种兽药的线性范围和相关系数
Figure BDA0003405144590000102
Figure BDA0003405144590000111
Figure BDA0003405144590000121
本实施例在样品前处理过程中需要对沼液进行稀释，对比了10倍、50倍、100倍和200倍加超纯水稀释后进行HLB柱萃取，结果发现10～50倍稀释后萃取液净化效果较差，容易造成色谱柱阻塞，引起较高的基质效应干扰。因此，综合考虑净化效果和方法检测限，选择2mL沼液加水稀释至200mL水溶液的稀释方式。
本实施例在样品前处理过程中需要选择合适的固相萃取柱，对比了Waters OasisHLB(500mg/6mL)、Varian Mega BE C18(1g/6mL)和Supelco MCAX(1g/6mL)固相萃取柱对多种类兽药残留的富集净化效果，结果发现HLB柱的富集净化效果最佳。
本实施例在样品前处理过程中需要在沼液基质中加入0.1gNa2EDTA(以0g和1.0g作为对照)用以络合重金属杂质，结果发现，添加0.1g Na2EDTA的目标项目回收率得到了较大的提升，在0.1g和0.2g的添加量条件下，两者的回收率并未有显著性差别，因此，最终选用在2.0mL沼液富集前添加0.1g的Na2EDTA，可减少试剂用量，更加经济适用。
测定方法的回收率和精密度：以沼液为基底进行加标实验，同时做平行试验(n＝4)，加标回收率及相对标准偏差(RSD)见表5；从表5结果可知，在10μg/L和50μg/L两个加标浓度下的加标回收率(RE)为62.1％～126.9％，相对标准偏差为0.5％～12.0％，不同种类兽药的检测限为0.0002～20.0μg/L；测定结果符合检测准确度与精密度的要求。
表5 79种兽药的加标回收率、相对标准偏差和检测限
Figure BDA0003405144590000131
Figure BDA0003405144590000141
实际样品测定
应用本发明所建立的方法对在全国范围采集的28份样品(北京5份、江苏、上海、浙江和陕西各4份、广西3份、重庆2份、黑龙江和四川各1份)进行检测，每份样品做两个平行。结果发现，28份样品中均有不同程度的兽药检出，检出频率达100％。而单个样品的检出兽药总浓度在4.0～1674.5μg/L，具体检出浓度和检出频率见表6。根据本研究的检测结果，沼液中兽药的复合污染状况需引起进一步的关注。
表6沼液样品中兽药检出情况
Figure BDA0003405144590000151
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.一种沼液中多种类兽药残留的同时检测方法，其特征在于，所述多种类兽药包括磺胺类、喹诺酮类、β-受体激动剂、大环内酯类、四环素类、β-内酰胺类、工业染料类、雄激素类、硝基呋喃及其代谢物类、雌激素类、氯霉素类、乙胺嘧啶、喹乙醇、卡巴氧、螺旋霉素、玉米赤酶醇和尼卡巴嗪共17类79种兽药；该检测方法包括以下步骤：
(1)样品前处理
将HLB柱依次用甲醇和超纯水进行活化，得到活性HLB柱；将新鲜沼液高速离心后用0.1～0.3μm水系滤膜过滤，之后将所得澄清沼液采用超纯水稀释，得到稀释沼液样品；于稀释沼液样品中加入Na2EDTA后摇匀，以4～6mL/min的流速通过活性HLB柱进行上样；上样结束后用甲醇-水进行淋洗，淋洗结束并抽干后依次用甲醇、甲醇-二氯甲烷进行洗脱；将所得洗脱液在35～45℃下氮吹至干后进行定容，最后经0.1～0.3μm有机滤膜过滤得到待测样品溶液，待LC-MS/MS检测；其中，所述活性HLB柱中填料干重和柱内体积与新鲜沼液的比例为(0.5～1)g:(6～20)mL:2mL，所述稀释沼液样品的稀释比例为100～200倍；
(2)混合标准溶液配制
将17类79种兽药标准品配制成0.02～500μg/L系列梯度的混合标准溶液，-25℃～-18℃下避光保存；
将10种替代物标准品混合配制成1mg/mL的混合标准溶液，-25℃～-18℃下避光保存；
(3)样品检测
将兽药标准品和替代物标准品的混合标准溶液进行LC-MS/MS测定，得到标准工作曲线；将待测样品溶液进行LC-MS/MS测定，采用外标法定量，将所得检测曲线与标准工作曲线进行比对，得到待测样品溶液中各种类兽药的种类及含量。
2.根据权利要求1所述的沼液中多种类兽药残留的同时检测方法，其特征在于，步骤(1)中，相对于2mL沼液，所述Na2EDTA的用量为0.1～0.2g。
3.根据权利要求1所述的沼液中多种类兽药残留的同时检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述79种兽药标准品包括：磺胺类：磺胺甲恶唑、胺甲噻二唑、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺喹恶啉、磺胺氯哒嗪、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺二甲基异嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲异恶唑、磺胺硝苯、磺胺甲氧哒嗪；喹诺酮类：环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星、氟甲喹、麻保沙星、沙拉沙星、恶喹酸；β-受体激动剂：莱克多巴胺、克伦特罗、特步他林、沙丁胺醇、西马特罗、非诺特罗、氯丙那林、妥布特罗、喷布特罗；大环内酯类：红霉素、泰乐菌素、替米考星、林可霉素；四环素类：土霉素、金霉素、四环素、强力霉素；β-内酰胺类：阿莫西林、头孢噻呋、青霉素G、双氯青霉素、苯唑青霉素、氯唑青霉素、氨苄青霉素；工业染料类：结晶紫、隐性结晶紫、隐性孔雀石绿、孔雀石绿；雄激素类：甲基睾丸酮、丙酸睾丸酮；硝基呋喃及其代谢物类：呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林、NP-AOZ、NP-AMOZ、NP-AHD、NP-SCA；雌激素类：己烯雌酚、雌三醇、雌二醇、己烷雌酚、双烯雌酚、氯地孕酮；氯霉素类：氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素；其他类：乙胺嘧啶、喹乙醇、卡巴氧、螺旋霉素、玉米赤酶醇、尼卡巴嗪。
4.根据权利要求1所述的沼液中多种类兽药残留的同时检测方法，其特征在于，步骤(2)中，10种替代物标准品为莱克多巴胺-d3、克伦特罗-d9、沙丁胺醇-d3、隐性孔雀石绿-d5、孔雀石绿-d5、NP-AOZ-d4、NP-AMOZ-d5、NP-AHD-13C3、NP-SCA-13C15N2和氯霉素-d5。
5.根据权利要求1所述的沼液中多种类兽药残留的同时检测方法，其特征在于，所述LC-MS/MS测定过程中液相色谱条件包括：色谱柱为Phenomenex Kinetex C18；柱温为30℃；流速为0.25mL/min；样品进样量为10μL；其中，将目标物分为ESI+A项目组、ESI+B项目组和ESI-C项目组，共三组；ESI+A项目组、ESI+B项目组使用的流动相为含0.10％甲酸的超纯水A1相和含0.10％甲酸的乙腈B1相，ESI-C项目组使用的流动相为超纯水A2相和乙腈B2相，采用梯度洗脱方式且梯度洗脱流程如下：
(1)ESI+A、ESI+B项目组的梯度洗脱程序：0～2min的流动相为90％A1相和10％B1相；2.01～12min的流动相为85％A1相和15％B1相；12.01～16min的流动相为75％A1相和25％B1相；16.01～26min的流动相为20％A1相和80％B1相；26.01～30min的流动相为90％A1相和10％B1相；
(2)ESI-C项目组的梯度洗脱程序：0～1min的流动相为75％A2相和25％B2相；1.01～5min的流动相为55％A2相和45％B2相；5.01～12min的流动相为20％A2相和80％B2相；12.01～15min的流动相为75％A2相和25％B2相。
6.根据权利要求5所述的沼液中多种类兽药残留的同时检测方法，其特征在于，用于ESI+A项目组测试的兽药分别为磺胺甲恶唑、胺甲噻二唑、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺喹恶啉、磺胺氯哒嗪、磺胺甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺二甲基异嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲异恶唑、磺胺硝苯、磺胺甲氧哒嗪、环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星、氟甲喹、麻保沙星、沙拉沙星、恶喹酸、土霉素、金霉素、四环素、强力霉素、结晶紫、隐性结晶紫、隐性孔雀石绿、孔雀石绿和氯地孕酮。
7.根据权利要求5所述的沼液中多种类兽药残留的同时检测方法，其特征在于，用于ESI+B项目组测试的兽药分别为莱克多巴胺、克伦特罗、特步他林、沙丁胺醇、西马特罗、非诺特罗、氯丙那林、妥布特罗、喷布特罗、泰乐菌素、替米考星、红霉素、林可霉素、阿莫西林、头孢噻呋、青霉素G、双氯青霉素、苯唑青霉素、氯唑青霉素、氨苄青霉素、甲基睾丸酮、丙酸睾丸酮、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林、NP-AOZ、NP-AMOZ、NP-AHD、NP-SCA、乙胺嘧啶、喹乙醇、卡巴氧和螺旋霉素。
8.根据权利要求5所述的沼液中多种类兽药残留的同时检测方法，其特征在于，用于ESI-C项目组测试的兽药分别为己烯雌酚、雌三醇、雌二醇、己烷雌酚、双烯雌酚、氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素、玉米赤酶醇和尼卡巴嗪。
9.根据权利要求1所述的沼液中多种类兽药残留的同时检测方法，其特征在于，所述LC-MS/MS测定过程中质谱条件包括：离子源为电喷雾电离；正负离子扫描；离子源温度为350℃；毛细管电压为4000V；雾化气流速为12L/min；多反应监测扫描。
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