CN103969362A

CN103969362A - 一种定量检测鸡粪中氟喹诺酮类的方法

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Publication number: CN103969362A
Application number: CN201410093362.XA
Authority: CN
Inventors: 薛南冬; 刘博�; 张石磊; 李发生; 陈宣宇; 孟磊
Original assignee: Chinese Research Academy of Environmental Sciences
Current assignee: Chinese Research Academy of Environmental Sciences
Priority date: 2014-03-14
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2014-08-06
Anticipated expiration: 2034-03-14
Also published as: CN103969362B

Abstract

本发明公开了一种定量检测鸡粪中6种氟喹诺酮类的检测分析方法，该方法包括：(1)鸡粪样品经冷冻干燥；(2)粉碎鸡粪样品并过筛；(3)加入EDTA-Mcllvaine和乙腈混合提取剂，漩涡混匀并超声处理；(4)离心获上清液为提取液；(5)去除有机溶剂后，提取液用滤膜过滤；(6)过滤液过HLB柱并抽干，用5%甲醇溶液清洗柱，最后经甲醇洗脱目标抗生素，收集洗脱液；(7)吹干，用乙腈/0.7%磷酸定容，充分溶解后过滤即可用于定量检测。本发明方法实现了6种氟喹诺酮类的同时检测，具有低成本、易操作等特点，为复杂基质中FQs类抗生素的检测提供了一种可选的方法，且方法检出限、定量限均低，回收率高。

Description

一种定量检测鸡粪中氟喹诺酮类的方法

技术领域

本发明涉及一种复杂基质中抗生素的检测方法，具体地说是鸡粪中6种氟喹诺酮类(FQs) 抗生素的检测方法。

背景技术

氟喹诺酮类(FQs)抗生素是一类由人工合成的广谱类抗菌药，是喹诺酮的哌嗪基派生物,通过抑制细菌的DNA解旋酶II(topoisomerase II)和拓扑异构酶IV(topoisomerase IV)而影响细菌的DNA复制过程。由于具有广谱抗革兰氏细菌活性和口服吸收效果好等特性，FQs在禽畜养殖业被大量用于禽畜疾病防治以及被用作饲料添加剂。依据世界卫生组织统计，全球每年消耗的抗生素总量中，有90%被用于禽畜养殖。如美国每年养殖业使用抗生素约为1万多吨，由于代谢率仅为10%到40%，大部分抗生素被直接排放到环境中。近年来中国养殖业发展迅猛，规模化、集约化的程度不断提高，每年用于饲料添加剂的抗生素占全球使用量的50%以上。中国每年畜禽粪便产生量约是工业固体废弃物的2倍以上，部分地区甚至超过4倍。大量抗生素将进入环境中而可能导致生物毒性和致病菌产生抗药性基因等环境风险和生态风险。而以欧盟为例，氟喹诺酮类和喹诺酮类作为主要的兽药抗生素，其在欧盟主要国家使用比例仅次于四环素类、磺胺类，由此带来的环境风险不容忽视。而对环境中该类抗生素的检测是评估其环境风险、生态风险的首要步骤，也是对其进行治理的基础环节，因此迫切需要开发一种复杂基质中氟喹诺酮类(FQs)的检测分析方法。

由于畜禽粪便基质复杂，FQs分析时受到的杂质干扰大。目前在环境基质中抗生素的检测技术中，高效液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）具有检测范围宽，灵敏度高，较强的抗干扰能力等特点，但由于成本较高而影响到它的广泛应用。而荧光检测器（FLD）成本相对较低而且对于FQs类物质灵敏度较高，因此通过高效液相色谱-荧光分析法（LC/FLD）检测FQs应用越来越多。潘等使用LC/FLD对食品中6种FQs检测分析，Li等使用LC/FLD对土壤中的4种FQs进行残留检测，但回收率相对偏低（洛美沙星为61.3%～67.8%、恩诺沙星63.2%～75.7%）。Zhao等建立了LC-FLD对禽畜粪便中7中FQs同时检测分析的方法，但由于未经过SPE净化过程，方法定量限偏高（0.031～0.15 mg/kg）。

发明内容

本发明的目的是解决复杂基质中FQs不易于分析测定，且现有分析测定技术回收率低、定量限高、成本高等问题，建立了一种基于固相萃取—高效液相色谱荧光检测法，用以分析鸡粪中6种氟喹诺酮类(FQs) ：诺氟沙星（NOR）、环丙沙星（CIP）、洛美沙星（LOM）、达氟沙星（DAN）、恩诺沙星（ENR）、沙拉沙星（SAR）。该方法具有较高的回收率，较低的定量限，且分析成本较LC-MS/M S方法低，为复杂基质中FQs的检出提供了一种高效经济的方法，具有较高的推广价值。

本发明的技术方案是：一种定量检测鸡粪中氟喹诺酮类的方法，包括如下步骤：

(1) 鸡粪样品经冷冻干燥；

(2) 粉碎鸡粪样品并过筛；

(3) 加入EDTA-Mcllvaine和乙腈混合提取剂，漩涡混匀并超声处理；

(4) 离心获上清液为提取液，重复提取1-3次，合并各次提取液；

(5) 去除有机溶剂后，提取液用滤膜过滤；

(6) 过滤液过HLB柱并抽干，用5%甲醇溶液清洗柱，最后经甲醇洗脱目标抗生素，收集洗脱液；

(7) 吹干，用乙腈/0.7%磷酸定容，充分溶解后过滤即可用于定量检测。

上述的方法，所述氟喹诺酮类包括NOR、CIP、LOM、DAN、ENR和SAR六种物质。

上述的方法，第(2)步粉碎并过筛是后过2mm筛。

第(3)步加入EDTA-Mcllvaine：乙腈=1:1(体积比)的混合提取剂，漩涡混匀30 s，超声10-25 min，其中混合提取剂为pH≤3.0，优选pH=2，超声提取时间为15min。

第 (4)步离心获上清液为提取液，重复提取2次，合并3次提取液，其中以3000至5000 rpm进行离心。

第(5)步去除有机溶剂采用旋转蒸发仪在40℃左右水浴中减压蒸发，提取液用过1.2μm 玻璃纤维滤膜。

第(6)步的具体步骤是：以1 mL/min的速率通过HLB柱并抽干，用6 mL 5%甲醇溶液清洗柱，最后经5 mL甲醇洗脱目标抗生素，收集洗脱液。

第(7)步的具体步骤是：在40℃条件下高纯氮气吹干，用体积比为1:9的乙腈/0.7%磷酸定容至1 mL，超声5 min促溶，过0.22 μm滤膜后待测。

所述的方法，采用高效液相色谱荧光检测法测定氟喹诺酮类抗生素。

所述的方法，所述检测具体操作步骤是：WATERS Xterra RP18色谱柱（250 mm×4.6 μm×5 μm,），柱温：40℃；荧光检测器(FLD)检测波长：激发波长280 nm,发射波长450 nm：进样体积：20 μL；流速：0.8 ml/min，采用二元梯度泵，流动相A为乙腈，流动相B为0.7 %磷酸溶液；梯度洗脱程序：0～20 min,10% A；20～35 min，10%～25% A；35～45 min，40% A；45～55 min;10% A。

本发明采用固相萃取—高效液相色谱荧光检测法分析鸡粪中6种氟喹诺酮类(FQs)，选用Mcllvaine- Na₂EDTA缓冲液/乙腈（1:1）（pH=2）作为提取剂，超声提取时间15分钟，经HLB固相柱净化，选用甲醇为洗脱剂，浓缩后用HPLC/FLD检测时应用乙腈/0.7%磷酸（1:9,V/V）为流动相。FQs在0.01～1.0 mg/kg浓度范围内呈现良好线性关系，R²为0.9969～0.9999。加标（浓度水平0.01、0.5、1.0 mg/kg 干重）回收率达76.7%～106.7%，相对标准偏差0.7%～14.4%（n=4）。方法检出限为0.002～0.022 mg/kg，方法定量限为0.0068～0.074 mg/kg。

对FQs类物质从环境样品中提取，提取剂的选择非常重要。目前常用的提取剂有Mg(NO₃)₂溶液、EDTA-Mcllvaine缓冲液和乙腈等无机有机溶液。比较研究50% Mg(NO₃)₂-2.5% NH₃·H₂O、EDTA-Mcllvaine缓冲液(pH=4)和乙腈等无机、有机提取液，甲醇：乙酸：水(6:1:3,V/V)和 EDTA-Mcllvaine：乙腈(1:1,V/V)等混合提取液，以及EDTA-Mcllvaine缓冲液与甲醇：乙酸：水(6:1:3,V/V)复合提取时各目标物的回收率后，本发明选择EDTA-Mcllvaine：乙腈（1:1）作为提取剂，NOR、CIP、LOM、DAN、ENR和SAR六种物质的回收率分别为83.6%±4.4 、68.0%±4.9、74.1%±6.1、79.7%±4.8、90.8%±4.7和64.3%±5.5。

氟喹诺酮类抗生素结构式含哌嗪基，有2个pKa值(pKa₁=5.5～6.3，pKa₂=7.6～8.5)，在水溶液酸性条件下(通常pH<5)，氟喹诺酮是阳离子形式，在对喹诺酮类样品预处理中大多将样品pH调节为酸性，将其转化为阳离子形式有利于提取。在选择EDTA-Mcllvaine：乙腈（1:1）作为提取剂，用HCL或NaOH调节提取液pH为1.0～8.0后对样品进行提取，过SPE柱后上机测定。经对比研究，本发明在选择EDTA-Mcllvaine：乙腈=1:1作为提取剂条件下，调节提取剂pH至pH=2。

提取时间影响目标物的回收率，提取时间过短无法有效将目标抗生素从基质中提取出来，致使回收率低，而提取时间多长这可能将基质中的有机物杂质提取出来，影响随后的分析测定。本发明在40℃条件下超声提取时间确定为15 min，采用3次提取，合并提取液，以备下一步处理。

由于鸡粪基质的复杂性，需选择适当的有机溶剂尽可能将目标物洗脱，同时避免洗脱下来干扰杂质影响目标物的检测。目前常用的洗脱溶剂有甲醇、甲醇：丙酮（80:20）、甲醇：乙酸乙酯（1:9）和二氯甲烷。分别以甲醇，甲醇：丙酮（80:20）、甲醇：乙酸乙酯（1:9）和二氯甲烷为洗脱剂，进行对比研究，本发明选用甲醇作为洗脱剂，洗脱体积为4ml。

本发明中，样品前处理后采用初始流动相乙腈/0.7%磷酸（1:9,V/V）定容，色谱峰峰形对称，分离效果较好。定容后采取超声5 min促溶。

本发明中色谱仪器运行条件及环境如下：WATERS Xterra RP18色谱柱（250 mm×4.6 μm×5 μm,），柱温：40℃；荧光检测器(FLD)检测波长:激发波长280 nm,发射波长450 nm;进样体积：20 μL；流速：0.8 ml/min。二元梯度泵，流动相A为乙腈，流动相B为0.7 %磷酸溶液。梯度洗脱程序：0～20 min,10% A；20～35 min，10%～25% A；35～45 min，40% A；45～55 min;10% A。

高效液相色谱荧光检测法（SPE-HPLC/FLD）测定氟喹诺酮类（FQs）抗生素，流动相的选择非常重要。目前采用0.025 mol/L的乙酸铵—0.5%乙酸缓冲液与乙腈或0.7%磷酸与乙腈作为流动相较为常见。本发明选用0.7%磷酸与乙腈作为流动相，使得6种FQs抗生素出峰时间稳定，分离效果较好，分离度均大于1.5，无拖尾现象。

本发明与现有检测方法相比，具有以下优点：

1、回收率高：加标（浓度水平0.01、0.5、1.0 mg/kg 干重）回收率达76.7%～106.7%；

2、定量限低：定量限为0.0068～0.074 mg/kg；

3、检出限低：方法检出限为0.002～0.022 mg/kg；

4、分析成本低：分析成本较LC-MS/M S方法低。

具体实施方式

实施例一

比较50% Mg(NO₃)₂-2.5% NH₃·H₂O、EDTA-Mcllvaine缓冲液(pH=4)和乙腈等无机、有机提取液，甲醇：乙酸：水(6:1:3,V/V)和 EDTA-Mcllvaine：乙腈(1:1,V/V)等混合提取液，以及EDTA-Mcllvaine缓冲液与甲醇：乙酸：水(6:1:3,V/V)复合提取时各目标物的回收率。结果如表1，从表中可以看出，单独使用无机提取液50% Mg(NO₃)₂-2.5% NH₃·H₂O、EDTA-Mcllvaine缓冲液或有机提取液乙腈时，均无法从基质中有效提取出目标物；而使用有机无机混合提取液甲醇：乙酸：水(6:1:3,V/V)时，对于NOR、CIP等目标物提取效率仍然偏低，采用EDTA-Mcllvaine缓冲液与甲醇：水：乙酸=6:1:3复合提取时，提取效率基本能达到要求，但实验提取剂使用量较大，提取步骤较繁琐，需两种提取剂先后各提取两次，前处理后的样品上机检测时检出的杂质也较多；而使用EDTA-Mcllvaine：乙腈（1:1）时，6种目标物回收率均较理想，且溶剂使用量小，提取步骤简便，杂质也较少。这是因为FQs容易与环境样品中的二价或三价金属离子形成化合物，加入螯合剂EDTA可以防止被二价或三价金属离子绑定。而乙腈相对于甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷等具有更好的提取喹诺酮类的效果，并且乙腈在沉淀粪便样品中蛋白质方面效果较好，要优于甲醇和丙酮。综合考虑，选择EDTA-Mcllvaine：乙腈（1:1）作为提取剂。

表1 不同提取剂的比较

表中：a为. 50% Mg(NO₃)₂-2.5% NH₃·H₂O；b.为EDTA-Mcllvaine缓冲液(pH=4)；

c.为乙腈；d.为甲醇：乙酸：水(6:1:3,V/V)；

e.为EDTA-Mcllvaine (pH=4)与甲醇：乙酸：水(6:1:3,V/V)复合提取；

f.为EDTA – Mcllvaine (pH=4)：乙腈(1:1,V/V)。

实施例二

在选择EDTA-Mcllvaine：乙腈（1:1）作为提取剂，用HCL或NaOH调节提取液pH为1.0～8.0后对样品进行提取，过SPE柱后上机测定，研究提取液在pH值条件下的提取效率。结果如表2，各目标物回收率受提取剂pH变化影响非常明显，在一定范围内，抗生素回收率随着pH的降低而提高。pH≥5时，目标物回收率较低，均小于60%，而当pH≤3.0时，6种氟喹诺酮类回收率均较高，在68.5%以上，且在pH=2时回收率最佳，达76.6%～104.3%，同时提取液中所含杂质相对较少。因此选择EDTA-Mcllvaine：乙腈=1:1作为提取剂，pH值调至2时，提取效率最佳。

表2 提取液不同pH值条件下6种FQs的回收率和相对标准偏差比较

实施例三

下面列举一个发明实施例，并结合数据对本发明加以进一步说明，但本发明不只限于此实施例。

鸡粪样品来自北京市郊区4个规模化养鸡场（养鸡场1、养鸡场2、养鸡场3和养鸡场4）和1个天然放养场（养鸡场5,该养鸡场未曾使用FQs等抗生素）。在养鸡场鸡舍使用不锈钢铲采集当天新鲜鸡粪，在一个养鸡场内多点收集并混合均匀成为一个鸡粪样品，避光密封（每个养鸡场样品依次编号为1号，2号，3号，4号，5号），带回实验室在-10℃保存。从鸡粪样品取适量经冷冻干燥、粉碎后过2mm筛，取0.5±0.005g研磨过筛样品于离心管，后加入5 mL EDTA-Mcllvaine：乙腈=1:1提取剂，漩涡混匀30 s，超声15 min，以4000 rpm离心15 min，上清液转入250 mL容量瓶中，重复提取两次。合并3次提取液，利用旋转蒸发仪在40℃左右水浴中减压蒸发，去除有机溶剂。提取液过1.2μm玻璃纤维滤膜，然后以1 mL/min的速率通过HLB柱并抽干，用6 mL 5%甲醇溶液清洗小柱，最后经5 mL甲醇洗脱目标抗生素，收集洗脱液，在40℃条件下高纯氮气吹至近干，用乙腈/0.7%磷酸（1:9,V/V）定容至1 mL，超声5 min促溶，过0.22 μm滤膜后待测。

按上述方法进行提取与检测，结果见表3。4个规模化养鸡场（养鸡场1，2，3，4）的样品均有不同程度目标物检出，而在天然放养场（养鸡场5）的样品中未有任何目标物检出。同一养鸡场中的不同类抗生素检出率以及含量差异较大。其中养鸡场3均有各抗生素不同浓度的检出，其中ENR含量达0.74 mg/kg，养鸡场2中检出的NOR、CIP、DAN和SAR 4种抗生素含量范围达0.40～1.13 mg/kg，养鸡场1检出的最高含量抗生素为ENR，含量为0.94 mg/kg，养鸡场4除了LOM外，其他抗生素均有检出，不过其含量（0.04～0.39 mg/kg）与其他养鸡场比相对较低。同一种抗生素在不同养鸡场鸡粪样品中含量也不同，CIP、DAN和SAR污染较为严重，在不同养鸡场样品中均有不同浓度的检出，其中CIP检出含量达0.25～0.49 mg/kg，而LOM只在养鸡场3中有检出，NOR检出的最高含量在养鸡场2中，达1.13 mg/kg，ENR除了在养鸡场2中未检出，在养鸡场1，3和4中含量较高（0.24～0.94 mg/kg）。

表3 北京市郊养鸡场6种FQs含量（mg/kg干重）

采样点	NOR	CIP	LOM	DAN	ENR	SAR
							养鸡场1	ND	0.25	ND	0.07	0.94	0.18
养鸡场2	1.13	0.49	ND	0.59	ND	0.40
							养鸡场3	0.23	0.39	0.21	0.06	0.74	0.10
养鸡场4	0.09	0.39	ND	0.04	0.24	0.24
							养鸡场5	ND	ND	ND	ND	ND	ND

Claims

1.一种定量检测鸡粪中氟喹诺酮类的方法，其特征在于：

(1) 鸡粪样品经冷冻干燥；

(2) 粉碎鸡粪样品并过筛；

(5) 去除有机溶剂后，提取液用滤膜过滤；

2.根据权利要求1所述的定量检测鸡粪中氟喹诺酮类的检测分析方法，其特征在于：氟喹诺酮类是NOR、CIP、LOM、DAN、ENR和SAR六种物质。

3.根据权利要求1所述的定量检测鸡粪中氟喹诺酮类的检测分析方法，其特征在于：第(2)步粉碎并过筛是后过2mm筛。

4.根据权利要求1所述的定量检测鸡粪中氟喹诺酮类的检测分析方法，其特征在于：第(3)步加入EDTA-Mcllvaine：乙腈=1:1(体积比)的混合提取剂，漩涡混匀30 s，超声10-25 min，其中混合提取剂为pH≤3.0，优选pH=2，超声提取时间为15min。

5.根据权利要求1所述的定量检测鸡粪中氟喹诺酮类的检测分析方法，其特征在于：第 (4)步离心获上清液为提取液，重复提取2次，合并3次提取液，其中以3000至5000 rpm进行离心。

6.根据权利要求1所述的定量检测鸡粪中氟喹诺酮类的检测分析方法，其特征在于：第(5)步去除有机溶剂采用旋转蒸发仪在40℃左右水浴中减压蒸发，提取液用过1.2μm 玻璃纤维滤膜。

7.根据权利要求1所述的定量检测鸡粪中氟喹诺酮类的检测分析方法，其特征在于：第(6)步的具体步骤是：以1 mL/min的速率通过HLB柱并抽干，用6 mL 5%甲醇溶液清洗柱，最后经5 mL甲醇洗脱目标抗生素，收集洗脱液。

8.根据权利要求1所述的定量检测鸡粪中氟喹诺酮类的检测分析方法，其特征在于：第(7)步的具体步骤是：在40℃条件下高纯氮气吹干，用体积比为1:9的乙腈/0.7%磷酸定容至1 mL，超声5 min促溶，过0.22 μm滤膜后待测。

9.根据权利要求1所述的定量检测鸡粪中氟喹诺酮类的检测分析方法，其特征在于：采用高效液相色谱荧光检测法测定氟喹诺酮类抗生素。

10.根据权利要求9所述的定量检测鸡粪中氟喹诺酮类的检测分析方法，其特征在于：

所述检测具体操作步骤是：WATERS Xterra RP18色谱柱（250 mm×4.6 μm×5 μm,），柱温：40℃；荧光检测器(FLD)检测波长：激发波长280 nm,发射波长450 nm：进样体积：20 μL；流速：0.8 ml/min，采用二元梯度泵，流动相A为乙腈，流动相B为0.7 %磷酸溶液；梯度洗脱程序：0～20 min,10% A；20～35 min，10%～25% A；35～45 min，40% A；45～55 min;10% A。