CN109142572A

CN109142572A - 一种环境多介质中多种药物同步提取及检测分析方法

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Publication number: CN109142572A
Application number: CN201810966281.4A
Authority: CN
Inventors: 李海普; 姚晶晶; 林惠菊; 杨兆光; 刘博宇
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2018-08-23
Filing date: 2018-08-23
Publication date: 2019-01-04
Anticipated expiration: 2038-08-23
Also published as: CN109142572B

Abstract

本发明公开了一种环境多介质中多种药物同步提取和检测分析方法，包括以下步骤：1）将污水经过离心过滤得到水样和固体样品；2）水样中和固体样品中药物萃取；3）水样中和固体样品中药物提取；4）环境多介质中多种药物的定性分析；5）环境多介质中多种药物的定量分析。该方法在完成环境多介质中多种药物提取的基础上，采用固相萃取与高效液相色谱与质谱串联（LC‑MS/MS）的方法，通过优化色谱条件和检测方法等，建立适用于环境多介质（地表水、污水处理厂进出水、污泥和沉积物）中多种药物同步提取和检测的分析方法，为全面普查复杂环境中药物的含量水平及分布特征提供可靠的分析手段。

Description

一种环境多介质中多种药物同步提取及检测分析方法

技术领域

本发明属于环境分析领域，具体一种环境多介质中多种药物同步提取及检测分析方法。

背景技术

近几年，药物作为一种新兴的环境污染物引起了人们广泛的关注，在地表水、污水处理厂、沉积物及生物样品等环境介质中都有不同浓度水平的药物残留检出(ng L^-1～μgL^-1)，其长期大量留存在环境中会产生内分泌干扰效应，威胁人类的健康。人们在日常生活中会消耗大量的药物，如各种口服药、感冒药和消炎药等。在某些地区，特别是在没有集中式污水处理设施的农村地区，污水直排现象频繁发生，成为环境中药物类污染物的一个最主要的来源。污水处理厂是药物类污染物一个重要的“汇”。药物经人和动物服用后，以原药或代谢物的形式经粪便和尿液排出体外，之后经市政排水管网进入污水处理厂。生产及生活过程中产生的药物及其代谢产物，有一部分也将通过各种途径汇入污水处理厂。同时，污水处理厂也是水环境中药物类污染物一个重要的“源”。由于现行的污水处理厂处理工艺并未针对药物类污染物进行优化，绝大部分药物得不到有效的去除，随污水处理厂出口水进入受纳环境中，对水生生物甚至人类的健康产生了不利的影响。部分兽用的药物(大部分为抗生素)不仅用于治疗动物疾病，同时也用于水产养殖。除了预防和治疗疾病外，部分抗生素还用于促进动物的生长速率。据报道，甚至有一些国家会在肉中添加低剂量的抗生素用来增加蛋白质的含量，减少脂肪的百分比。另一方面，垃圾填埋厂中被丢弃的未使用或者过期药物也是一个重要的污染源。

由于药物在天然水体中的含量通常很低，现有分析仪器无法直接对水样进行定量检测。因此，水环境样品中药物的分析检测技术通常先通过水样前处理技术浓缩富集被测的痕量组分，然后再由分析仪器检测分析。常用的药物样品前处理方法有液液萃取法(Liquid-Liquid Extraction，LLE)、分散液液微萃取(Dispersive Liquid-LiquidMicroextraction，DLLME)、固相萃取(Solid-Phase Extraction，SPE)、固相微萃取法(Solid-Phase Microextraction，SPME)等。近年来，SPME与气相、液相能够匹配，并可实现在线联用，适合于分析水样中挥发性、半挥发性、难挥发的物质，已被广泛应用于水环境中样品的富集。目前对于水环境中PPCPS的仪器分析方法大多是在气相色谱 (GC)和高效液相色谱(HPLC)基础上改进和创新而来的，通过优化色谱、质谱条件和减少基质效应等来提高分离能力和灵敏度。近年来发展迅速、应用较多的药物仪器分析技术有二维气相色谱法(Two-Dimensional Gas Chromatography，GC×GC)、高效液相色谱法(High PerformanceLiquid Chromatography，HPLC))、气相色谱质谱联用(Gas Chromatography withMassSpectrometry，GC-MS)、高效液相色谱质谱联用(High Performance LiquidChromatography with Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS)等。

在SPE和SPME基础上改进的样品前处理方法广泛应用于低浓度的环境样品的富集浓缩，且效率高，可同时萃取多种不同物质。在GC和HPLC基础上不断创新的仪器分析技术越来越多用于水环境中超痕量药物的定量分析且灵敏度高，自动化程度高。但环境中药物具有不同的物理化学性质和复杂的基体，对其精准定量分析的研究依旧薄弱，因此，未来研究应更多地开发便携高效、灵敏度高的前处理方法，以及实现在线前处理 -分析仪器检测的联合使用，以便精准定量环境中超痕量的药物。建立适用于环境多介质(地表水、污水处理厂进出水、污泥和沉积物)中多种药物同步提取和检测的分析方法，为全面普查复杂环境中药物的含量水平及分布特征提供可靠的分析手段。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种环境多介质中多种药物同步提取和检测分析方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种环境多介质中多种药物同步提取和检测分析方法，包括以下步骤：

1)将污水经过离心过滤得到水样和固体样品；

2)水样中和固体样品中药物萃取：在步骤1)得到的水样中加入内标混合溶液(为混合标准液50ng L^-1))过玻璃纤维滤膜，调节pH至3.0后加入Na₂EDTA，混匀至溶解，然后过活化后的Oasis HLB固相萃取柱；同时，将步骤1)得到的固体样品加入内标混合溶液涡旋混匀平衡后，加入一定体积的乙腈和pH为3的醋酸缓冲溶液，涡旋混匀后超声离心得到萃取液，将萃取液倒入圆底烧瓶中，重复萃取多次，合并萃取液，将萃取液于45℃水浴条件下旋蒸至近干，用超纯水稀释放至顶空瓶中，加入 Na₂EDTA，过0.7μm玻璃纤维滤膜，然后过活化后的Oasis HLB固相萃取柱；

3)水样中和固体样品中药物提取：步骤2)的水样和固体样品分别经过Oasis HLB固相萃萃取柱后加入甲醇洗脱得到洗脱液，将洗脱液于45℃水浴条件下用氮吹仪温和氮吹至近干，用体积比甲醇：超纯水＝20:80的溶剂定容，离心，取上清液于进样瓶中；

4)环境多介质中多种药物的定性分析：步骤3)得到的上清液采用液相色谱与三重四级杆质谱串联、电喷雾离子化源、多重反应监测模式进行定性分析；

5)环境多介质中多种药物的定量分析：步骤3)得到的洗脱液同时用内标法定量分析，方法检出限和方法定量限分别采用3倍和10倍信噪比进行计算，信噪比采用Masshunter软件对添加较低浓度目标化合物的样品进行计算从而对药物进行定量分析。

其中，所述环境多介质中多种药物包括但不仅限于地表水、污水处理厂进出水、污泥和沉积物中的29种抗生素和8种非甾体类消炎药，还应包括地下水、泥沙等基质中的药物。

本发明所述的多种药物不限于29种抗生素和8种非甾体类消炎药这37种，还应包括环境中存在的痕量微污染物。

其中，所述步骤2)中水样以5-10mL min^-1的流速过活化后的Oasis HLB固相萃取柱。

其中，所述步骤2)所述的玻璃纤维滤膜使用之前在马弗炉中450℃烘烧5h。

其中，Oasis HLB固相萃取柱预先活化程序为2×3mL甲醇活化，2×3mL超纯水，调节pH至3平衡。

其中，所述的Oasis HLB固相萃取柱为德国CNW的200mg、6cc和美国Waters的60mg、3cc两种规格。

其中，所述的29种抗生素为氟喹诺酮类抗生素、磺胺嘧啶：环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、双氟沙星、培氟沙星、氟甲喹、四环素、金霉素、土霉素、多西环素、林可霉素、阿莫西林、头孢噻肟、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、泰乐菌素、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、罗红霉素；磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹喔啉、磺胺嘧啶和甲氧苄氨嘧啶。

其中，所述8种非甾体类消炎药为布洛芬、双氟沙星、甲灭酸、扑热息痛、萘普生、酮洛芬、消炎痛和安替比林。

其中，所述步骤4)中的色谱柱采用Agilent公司Infinity Lab Poroshell 120EC-C18，保护柱采用Poroshell 120EC-C18，进样量为5μL，柱温保持在30℃，离子源温度350℃，干燥气流速8mL min^-1，雾化气压力30psi。

其中，所述步骤4)中的离子模式选择如下六种化合物：氯霉素，甲砜霉素，氟苯尼考，布洛芬，双氯芬酸和甲灭酸在负模式下进行分析，其余化合物均在正模式下进行分析，正模式流动相A相为含0.1％甲酸的超纯水，B相为甲醇，流速为0.2mL min^-1，负模式流动相A相为含0.01％氨水的超纯水，B相为甲醇，流速为0.3mL min^-1，进样量为5μL，柱温保持在30℃。

本发明还包括对所述的固体样品进行悬浮颗粒物的质量计算，悬浮颗粒物由水样离心过滤得到，将得到的悬浮颗粒物与预先称量的玻璃纤维滤膜(m1)一起剪碎加入预先称量的离心管(m2)中，称量其质量(m3)，则得到的悬浮颗粒物质量△m＝m3-(m1+m2)。

本发明所述的离子模式选择如下六种化合物：氯霉素，甲砜霉素，氟苯尼考，布洛芬，双氯芬酸和甲灭酸在负模式下进行分析，其余化合物均在正模式下进行分析。正模式流动相A相为含0.1％甲酸的超纯水，B相为甲醇，流速为0.2mL min^-1，负模式流动相A相为含0.01％氨水的超纯水，B相为甲醇，流速为0.3mL min^-1。进样量为5μL，柱温保持在30℃。若增加药物需根据药物理化性质确定离子模式。

本发明所述的定性分析时，保留时间在±0.02min之间，两个离子丰度(20％)。

本发明在样品分析过程中，每15个样品设定一组程序空白，控制样品加标平行和样品平行。控制样品是采用干净的基质(纯水或不受药物污染的土壤)，程序空白考察提取过程中是否引入污染，控制样品加标平行和样品平行考察方法的准确性和重现性。

有益效果：本发明提供的一种环境多介质中多种药物同步提取和检测的分析方法，操作简单、方法可靠、回收率合理、适用范围广，在环境分析领域提取检测分析痕量微污染物具有广阔的应用前景。

具体而言，本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

1、利用环境多介质中多种药物同步提取和检测的分析方法，能够浓缩富集被测的痕量组分，降低检测限，并改善方法的灵敏度，而高效灵敏、适应性高的分析仪器保证了多种药物检测结果的精确性。

2、环境多介质中多种药物同步提取及检测的分析方法的重复利用性、稳定性和回收率都得到显著提高，可根据所测药物需要选择不同提取方法，应用范围广。

3、环境多介质中多种药物同步提取及检测的分析方法适合于分析环境中挥发性、半挥发性、难挥发的物质。

4、环境多介质中多种药物同步提取及检测的分析方法操作简单，可批量处理；节约溶剂；同时完成样品的浓缩与净化，提高检测灵敏度。

5、环境多介质中多种药物同步提取及检测的分析方法通过优化色谱、质谱条件和减少基质效应等来提高分离能力和灵敏度。

本发明提供的环境多介质中多种药物同步提取及检测的分析方法处理效率高，快速检测、高选择性、高灵敏性，特别是能在多种环境介质中精准定量多种痕量污染物。

附图说明

图1水样和固体样品中药物提取方法示意图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。

实施例1

(1)单个标准液的制备：

标准品环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、双氟沙星、培氟沙星、氟甲喹和磺胺嘧啶单个标准品制备方法：分别准确称取10mg上述标准品，分别溶解于10mL 含0.5％(v/v)0.03M NaOH的甲醇溶液中，用甲醇稀释成100mgL^-1单个标准液。

脱水红霉素标准液制备方法：取10mL 1000mg L^-1的红霉素标准溶液，加入10mL 超纯水，加入少量的3M H₂SO₄调节pH至3，室温下搅拌4h，定容至50mL，此时溶液浓度为200mgL^-1。

标准品四环素、金霉素、土霉素、多西环素、林可霉素、阿莫西林、头孢噻肟、克拉霉素、阿奇霉素、泰乐菌素、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、罗红霉素；磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹喔啉、甲氧苄氨嘧啶；布洛芬、双氟沙星、甲灭酸、扑热息痛、萘普生、酮洛芬、消炎痛和安替比林的单个标准液制备：分别准确称取10mg上述标准品溶解于10mL甲醇中，最终浓度为1000mg L^-1，即为上述单个标准液。

(2)混合标准液的制备：分别取100μL上述37种单个标准液于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制形成最终溶液为1mg L^-1混合标准液。标准工作溶液：分别取 2-6mL含37种药物的混合标准液(环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、双氟沙星、培氟沙星、氟甲喹、四环素、金霉素、土霉素、多西环素、林可霉素、阿莫西林、头孢噻肟、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、泰乐菌素、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、罗红霉素；磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹喔啉、磺胺嘧啶和甲氧苄氨嘧啶；布洛芬、双氟沙星、甲灭酸、扑热息痛、萘普生、酮洛芬、消炎痛和安替比林)，以初始流动相比例(甲醇：水＝20:80)为溶剂，配制梯度为：1，5， 10，20，50，100μg L^-1并绘制曲线。

(3)水样中药物提取方法：水样(地表水1L，污水处理厂进出水200mL)采集后加内标混合溶液(即混合标准液50ng L^-1)均过玻璃纤维滤膜，用3M稀H₂SO₄调节 pH至3.0。由于某些抗生素(如四环素类)容易与水中的金属离子发生螯合反应，为提高其回收率，往水样中加入0.2g Na₂EDTA，混匀至溶解。样品以约5-10mL min^-1的流速通过预先活化的OasisHLB固相萃取柱(污水处理厂水样、污泥及悬浮颗粒物用200 mg,6cc,地表水水样用60mg,3cc)，活化程序为2×3mL甲醇活化，2×3mL超纯水 (调节pH至3)平衡，将过完水样的固相萃取柱在真空条件下抽干半小时，用2×3mL 甲醇洗脱(自然重力留下)，收集洗脱液。将洗脱液于45℃水浴氮吹浓至近干。用与流动相初始比例相同的溶剂复溶至1mL。16000rpm高速离心30min，取0.5mL上清液于进样瓶中，经LC-MS/MS检测。

(4)固体样品中药物提取方法：取0.1g冻干污泥中(沉积物用2g)加入50μL混合内标标准工作液(为混合标准液50ng L^-1)，涡旋混匀之后过夜平衡。加入5mL的乙腈和5mL pH为3的醋酸缓冲溶液，涡旋混匀1min，超声15分钟，5000rpm离心10min。萃取液倒入100mL圆底烧瓶中，重复萃取3次，合并萃取液。萃取液于45℃水浴旋蒸至近干，用200mL水稀释放至250mL顶空瓶中，加入0.2g Na₂EDTA。过0.7μm玻璃纤维滤膜。后续步骤经过与步骤(2)中水样相同的固相萃取流程进行萃取。悬浮颗粒物由水样离心过滤得到，将得到的悬浮颗粒物与预先称量的玻璃纤维滤膜(m₁)一起剪碎加入预先称量的离心管中(m₂)，称量其质量(m₃)，则得到的悬浮颗粒物质量△m＝m₃-(m₁+m₂)。悬浮颗粒物的前处理流程与沉积物相同。计算结果如表4。

(5)定性分析：采用液相色谱与三重四级杆质谱串联(LC/MS/MS)，电喷雾离子化源(ESI)、多重反应监测模式(MRM)进行分析。色谱柱采用Agilent公司Infinity LabPoroshell 120EC-C18(3.0×50mm,2.7μm)，保护柱采用Poroshell 120EC-C18(4.6×5 mm,2.7μm)。六种化合物：氯霉素，甲砜霉素，氟苯尼考，布洛芬，双氯芬酸和甲灭酸在负模式下进行分析，其余化合物均在正模式下进行分析。正模式流动相A相为含0.1％甲酸的超纯水，B相为甲醇，流速为0.2mL min^-1，负模式流动相A相为含0.01％氨水的超纯水，B相为甲醇，流速为0.3mL min^-1。进样量为5μL，柱温保持在30℃。正负模式液相条件见表1，目标化合物的定性分析(碰撞能(CE)、碎裂电压(Fragmentor)、母离子和子离子)结果见表2。

(6)定量分析：用内标法定量，方法检出限(MDL)和方法定量限(MQL)分别采用3倍和10倍信噪比进行计算，信噪比采用Masshunter软件(Agilent)对添加较低浓度目标化合物的样品进行计算。方法回收率实验选用了超纯水，地表水、污水处理厂进出水，沉积物和污泥作为典型环境基质。水样中药物活性成分检出限、定量限和方法回收率参见表3，固体中药物活性成分检出限、定量限和方法回收率参见表4。

表1为液相色谱与三重四级杆质谱串联(LC/MS/MS)，电喷雾离子化源(ESI)、多重反应监测模式(MRM)下的液相条件

表2正负模式下质谱参数优化设置

表3水样中药物活性成分检出限、定量限和方法回收率；检测目标污染物在水体中的浓度单位为ng L^-1

表4固体中药物活性成分检出限、定量限和方法回收率；检测出目标污染物在固体样品中的浓度单位为μg kg^-1dw

本发明建立了适用于多种环境基质(包括地表水、污水处理厂进出水、悬浮颗粒物和污泥)中37种药物(抗生素和非甾体类消炎药)的同步提取和分析方法。仪器分析是在LC-MS/MS多重反应监测模式(MRM)下进行的，其中6种化合物在负模式下(ESI-) 进行监测，其余化合物在正模式(ESI+)下进行监测。化合物的提取方法均采用固相萃取，大部分化合物在多种环境基质中的回收率均在50-150％之间，且对37种药物均具有较高的选择性、灵敏度和分辨率，适用于环境多介质种多种药物的同步检测，为全面普查复杂环境中药物的含量水平及分布特征提供可靠的分析手段。

上述仅为本发明优选的实施例，并不限制于本发明。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施例来举例说明。而由此方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种环境多介质中多种药物同步提取和检测分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将污水经过离心过滤得到水样和固体样品；

2）水样中和固体样品中的药物萃取：在步骤1）得到的水样中加入内标混合溶液过玻璃纤维滤膜，调节pH至3.0后加入Na₂EDTA，混匀至溶解，然后过活化后的Oasis HLB固相萃取柱；同时，将步骤1）得到的固体样品加入内标混合溶液涡旋混匀平衡后，加入一定体积的乙腈和pH为3的醋酸缓冲溶液，涡旋混匀后超声离心得到萃取液，将萃取液倒入圆底烧瓶中，重复萃取多次，合并萃取液，将萃取液于45°C水浴条件下旋蒸至近干，用超纯水稀释放至顶空瓶中，加入Na₂EDTA，过玻璃纤维滤膜，然后过活化后的Oasis HLB固相萃取柱；

3）水样中和固体样品中药物提取：步骤2）的水样和固体样品分别经过Oasis HLB固相萃取柱萃取后加入甲醇洗脱得到洗脱液，将洗脱液于45°C水浴条件下用氮吹仪温和氮吹至近干，用甲醇：超纯水=20:80体积比的溶剂定容，离心，取上清液于进样瓶中；

4）环境多介质中多种药物的定性分析：然后采用液相色谱与三重四级杆质谱串联、电喷雾离子化源、多重反应监测模式进行定性分析；

5）环境多介质中多种药物的定量分析：步骤3）得到的洗脱液同时用内标法定量分析，方法检出限和方法定量限分别采用3倍和10倍信噪比进行计算，信噪比采用Masshunter软件对添加较低浓度目标化合物的样品进行计算从而对药物进行定量分析。

2.根据权利要求1所述的一种环境多介质中多种药物同步提取和检测分析方法，其特征在于，所述环境多介质中多种药物包括地表水、污水处理厂进出水、污泥和沉积物中的29种抗生素和8种非甾体类消炎药。

3.根据权利要求1所述的一种环境多介质中多种药物同步提取和检测分析方法，其特征在于，所述步骤2）中水样以5-10 mL min^-1的流速过活化后的Oasis HLB固相萃取柱。

4.根据权利要求1所述的一种环境多介质中多种药物同步提取和检测分析方法，其特征在于，所述步骤2）的玻璃纤维滤膜使用之前在马弗炉中450℃烘烧5 h。

5.根据权利要求1所述的一种环境多介质中多种药物同步提取和检测分析方法，其特征在于，所述Oasis HLB固相萃取柱预先活化程序为2 × 3 mL甲醇活化，2 × 3mL超纯水，调节pH至3平衡。

6.根据权利要求1所述的一种环境多介质中多种药物同步提取和检测分析方法，其特征在于，所述Oasis HLB固相萃取柱为德国CNW的200 mg、6 cc和美国Waters 的60 mg、3 cc两种规格。

7.根据权利要求2所述的一种环境多介质中多种药物同步提取和检测分析方法，其特征在于，所述的29种抗生素为环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、双氟沙星、培氟沙星、氟甲喹、四环素、金霉素、土霉素、多西环素、林可霉素、阿莫西林、头孢噻肟、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、泰乐菌素、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、罗红霉素；磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹喔啉、磺胺嘧啶和甲氧苄氨嘧啶。

8.根据权利要求2所述的一种环境多介质中多种药物同步提取和检测分析方法，其特征在于，所述8种非甾体类消炎药为布洛芬、双氟沙星、甲灭酸、扑热息痛、萘普生、酮洛芬、消炎痛和安替比林。

9.根据权利要求1所述的一种环境多介质中多种药物同步提取和检测分析方法，其特征在于，所述步骤4）中的色谱柱采用Agilent 公司Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18，保护柱采用Poroshell 120 EC-C18，进样量为5 μL，柱温保持在30℃，离子源温度350℃，干燥气流速8 mL min^-1，雾化气压力30 psi。

10.根据权利要求1所述的一种环境多介质中多种药物同步提取和检测分析方法，其特征在于，所述步骤4）中的离子模式选择如下，六种化合物：氯霉素，甲砜霉素，氟苯尼考，布洛芬，双氯芬酸和甲灭酸在负模式下进行分析，其余化合物均在正模式下进行分析，正模式流动相A相为含0.1%甲酸的超纯水，B相为甲醇，流速为0.2 mL min^-1，负模式流动相A相为含0.01%氨水的超纯水，B相为甲醇，流速为0.3 mL min^-1，进样量为5μL，柱温保持在30℃。