CN107907620A - 超声萃取‑固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中六类24种抗生素的方法 - Google Patents

超声萃取‑固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中六类24种抗生素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种超声萃取‑固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中六类24种抗生素的方法。该方法为：(1)提前加入内标物指示回收率，超声萃取；(2)固相萃取富集净化目标抗生素；(3)液质联用检测24种抗生素的含量。本发明可一次性同时检出畜禽粪便中六类24种抗生素的残留情况，检测过程耗时少，检测高精密度、高灵敏度、高稳定性、高选择性和检出限低。提取溶剂的优化能有效减少抗生素与粪便中金属离子的螯合，使目标抗生素从样品中分离，提高回收率，且操作简便，富集倍数高，重现性好。将指示回收率的内标物加在整个前处理过程前，能够很好地表示前处理过程中目标物质的损失，使最终结果更加真实可靠。

Description

超声萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽 粪便中六类24种抗生素的方法
技术领域
本发明属于畜禽粪便中微量有机污染物质残留检测技术领域，涉及一种用于畜禽粪便中抗生素检测的方法，特别涉及一种超声萃取-固相萃取前处理结合液相色谱串联质谱技术(LC-MS/MS，简称液质联用技术)，能够高效处理并同时检测畜禽粪便(鸡粪、牛粪、猪粪)中六类多达24种抗生素类物质的方法。
技术背景
随着畜禽养殖业现代化、规模化、集约化的发展，抗生素被大量应用于畜禽养殖过程。然而，抗生素大多不能被完全吸收，大约有40％-90％以母体或代谢物的形式排出动物体外，进入土壤和水体环境，对土壤生态系统、水体生态系统产生毒害，并通过食物链最终对人体健康产生危害。畜禽粪便基质本身是一种复杂的环境样品，有效的样品提取和净化是准确测定其中抗生素含量的前提。因此，畜禽粪便中残留的多种抗生素的同时测定方法研究尤为重要。
目前，传统的提取方法主要是索氏提取法，其过程耗时、费力。LLE(液液提取)根据被测物的性质在酸或碱性条件下分别提取净化，需要两三种溶剂平衡，操作费时较多，且容易引入新的干扰，溶剂的大量挥发会造成健康风险，样品多次转移浓缩易造成较大分析误差而影响回收率。由于养殖业中环境样品的基质相当复杂，对测试干扰较大，尤其是提取和分离步骤。而且检测的抗生素种类繁多，物理、化学性质各不相同，所用的提取溶剂和提取方法也各有差别。对于整个提取过程来说，提取剂的选择对微量残留分析是至关重要的，回收率的高低差异可能归因于不同介质组成和理化性质的不同。另外，畜禽粪便的含水率等性状差异较大，如一些集约化养鸡场为保持干燥，而铺设大量稻壳作为鸡粪垫料，使稻壳与鸡粪混合在一起不易分离，与未铺设垫料时差异很大。上述因素在一定程度上制约了粪便中抗生素残留研究的进展。
超声萃取、HLB固相萃取柱净化前处理结合液相色谱串联质谱技术(LC-MS/MS)具有应用范围广、分离能力强、灵敏度高和分析速度快等特点，目前已成为有机物预处理和分析的重要方法之一。但现有的超声萃取、HLB固相萃取柱净化前处理结合液相色谱串联质谱用于畜禽粪便中抗生素的检测时，大多由于提取方法、提取溶剂选用不合适，或固相萃取前处理条件、液相色谱条件和/或质谱条件选择不当，或多或少存在着检测结果不稳定、干扰多、检测抗生素数量和回收率有限等问题。
发明内容
本发明的目的旨在克服现有方法中存在的不稳定、干扰多、检测抗生素数量和回收率有限等问题，提供一种检测结果准确、稳定，干扰少，检测过程快速、高效的，采用超声萃取、HLB固相萃取柱净化前处理结合液相色谱串联质谱技术(LC-MS/MS)能同时测定畜禽粪便(鸡粪、牛粪、猪粪等)中六类(磺胺类、四环素类、氟喹诺酮类、大环内酯类、酰胺醇类和青霉素类)24种不同结构抗生素(24种抗生素分别为磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、环丙沙星盐酸盐、氟罗沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、盐酸土霉素、金霉素盐酸盐、阿莫西林三水合物、青霉素G甲盐、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素、盐酸氯苯胍)的方法，即一种超声萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中六类24种抗生素的方法。该方法通过对提取溶剂、固相萃取前处理条件的优化，最终能够实现灵敏度高、选择性好、准确度高，该方法适合实际畜禽粪便中抗生素的检测。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明一种超声萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中六类24种抗生素的方法，按以下步骤进行：
(1)畜禽粪便的预处理，抗生素类物质的提取：超声萃取
称取经冷冻干燥、粉碎、过筛后的畜禽粪便，加入指示回收率的内标物，再加入提取溶剂，经超声萃取、离心后收集上清液即提取液，多次提取，合并提取液；用超纯水稀释合并后的提取液，过滤除去颗粒悬浮物后待用；
(2)固相萃取前处理，即富集净化过程
依次用甲醇和等体积的超纯水活化固相萃取小柱，将经步骤(1)处理过的样品过柱即富集，控制水样流速；富集完成后依次用超纯水和等体积的低浓度甲醇淋洗，并在真空下干燥固相萃取柱；之后，再用甲醇洗脱，甲醇洗脱后用氮气吹干收集的洗脱液，得到残渣；将残渣用一定浓度的甲醇重新溶解，定容，经超声、过滤后转移至进样瓶中，待测；
(3)液相色谱串联质谱法测定畜禽粪便中六类24种抗生素的含量
采用内标法，在液相色谱-串联质谱仪上，定量检测进样瓶内的畜禽粪便样品中六类24种抗生素的含量；所述的六类24种抗生素是指磺胺类、四环素类、氟喹诺酮类、大环内酯类、酰胺醇类和青霉素类这六类的24种抗生素；24种抗生素分别为磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、环丙沙星盐酸盐、氟罗沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、盐酸土霉素、金霉素盐酸盐、阿莫西林三水合物、青霉素G甲盐、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素、盐酸氯苯胍。
进一步地，超声萃取前分别加入13C1D3-红霉素、D5-诺氟沙星、13C6-磺胺甲恶唑这三种内标物指示回收率。
更进一步地，超声萃取前分别加入10μL，5mg/L的13C1D3-红霉素、D5-诺氟沙星、13C6-磺胺甲恶唑这三种内标物指示回收率。
进一步地，步骤(1)中，提取溶剂为甲醇混合EDTA-Mcllvaine缓冲液，甲醇:EDTA-Mcllvaine缓冲液体积比为1:1。步骤(1)中，过滤所用的滤膜是孔径为0.45μm或0.47μm的Whatman GF/F系列玻璃纤维滤膜。
进一步地，步骤(2)中，所述的固相萃取柱为Waters公司Oasis HLB小柱，它是一种亲水-亲脂性聚合物填料柱，其吸附剂(填料)是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂。步骤(2)中，过柱时水样流速控制在1-4mL/min；洗脱HLB固相萃取柱的洗脱液流速小于1.0mL/min。
进一步地，步骤(2)中，淋洗所用的低浓度甲醇为体积浓度小于10％的甲醇-水溶液；洗脱所用的甲醇为HPLC级甲醇；定容残渣所用的甲醇是体积浓度为70％的甲醇-水溶液；用甲醇定容后，超声5-15min，再用针式滤器过滤；针式滤器选用孔径小于0.22μm的聚四氟乙烯针式滤头。
进一步地，步骤(3)中，采用Waters Xevo TQ-Smicro型液相色谱-串联质谱仪定量检测水样中抗生素的浓度。
进一步地，上述超声萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中六类24种抗生素的方法，具体检测过程如下：
(1)畜禽粪便样品的提取
将采集的新鲜鸡粪、牛粪或猪粪冷冻干燥后，粉碎并过0.25mm筛。准确称取1.000g样品于30mL玻璃离心管内，分别加入10μL，5mg/L的13C1D3-红霉素、D5-诺氟沙星、13C6-磺胺甲恶唑这三种指示回收率的内标物，与粪便样品混合均匀。再加入20mL甲醇混合EDTA-Mcllvaine缓冲液(V:V＝1:1)作为提取溶剂，涡旋30s后超声萃取20min，并以3000r/min离心15min，将上清液转入500mL玻璃烧杯中，再加入20mL甲醇混合EDTA-Mcllvaine缓冲液(V:V＝1:1)重复提取2次，合并3次提取液。
将上述合并后的提取液用超纯水稀释到500mL或1000mL，用玻璃棒搅拌混合均匀后，经玻璃纤维滤膜过滤除去细小颗粒状悬浮物后待用。其中，超纯水稀释的体积可根据具体情况选择500、1000mL，但要保证其中有机溶剂的含量不超过总体积的10％。其中，过滤所用的玻璃纤维滤膜选用Whatman GF/F系列玻璃纤维滤膜，其孔径可为0.45μm或0.47μm。其目的是过滤去除颗粒悬浮物质，防止后续对富集净化和检测的影响。
(2)固相萃取(SPE)前处理：富集净化过程
依次用甲醇和等体积的超纯水活化固相萃取柱，将经步骤(1)处理过的水样过柱(即富集)，控制水样流速；富集完成后依次用超纯水和等体积的低浓度甲醇淋洗，并在真空条件下干燥固相萃取柱；之后，再用甲醇洗脱，甲醇洗脱后用氮气吹干收集的洗脱液(甲醇溶液)，得到残渣；将残渣用一定浓度的甲醇重新溶解，定容，经超声、过滤后转移至进样瓶中，待测。
其中，浓缩富集水样所用的固相萃取柱是Waters公司Oasis HLB小柱，其吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂。
其中，活化固相萃取小柱所用等体积甲醇和超纯水的体积，非限定性地可举例5mL、8mL或10mL。但考虑活化时间或有机溶剂用量问题，体积一般不超过10mL。
其中，水样流经固相萃取小柱的流速，非限定性地可举例2mL/min或4mL/min。但为了保证目标物质能充分接触并富集于固相萃取小柱，水样流经速度最好不超过10mL/min。一般地，过柱时水样流速控制在1-4mL/min；洗脱HLB固相萃取柱的洗脱液流速小于1.0mL/min。
其中，萃取完成后淋洗小柱所用一定比例甲醇的水溶液中甲醇比例，非限定性地可举例3％、5％或10％。其目的是洗去固相萃取小柱上的杂质干扰，但为了防止淋洗时目标物质流失的可能，淋洗所用水溶液中甲醇的体积比例最好不超过10％(即淋洗所用的低浓度甲醇应为体积浓度小于10％的甲醇-水溶液)。
其中，淋洗过后固相萃取小柱真空干燥的时间为10-20min，非限定性地可举例10min、15min或20min。其目的是除去淋洗剂中的水分，避免其进入洗脱液中。
其中，洗脱所用的甲醇为HPLC级甲醇(即高效液相色谱法级别的甲醇)。洗脱萃取柱所用的甲醇用量为萃取柱体积的2倍。
其中，定容氮吹后残渣的有机溶剂，考虑到目标物中部分抗生素含盐，采用体积浓度为70％的甲醇-水溶液。
其中，用甲醇重新溶解，定容后，超声5-15min，再用针式滤器过滤后转移至棕色进样瓶中，待测。其中，过滤所使用针式滤器的有机相膜，考虑到后期进样时不会造成色谱柱堵塞，选取孔径为0.22μm或以下的PTFE(聚四氟乙烯)针式滤头。
(3)液相色谱串联质谱法测定畜禽粪便中六类24种抗生素的含量
采用内标法，在液相色谱-串联质谱仪上，定量检测进样瓶内的畜禽粪便样品中六类24种抗生素的含量。
质谱检测条件优选：锥孔电压范围为10-30V，碰撞能范围为13-40eV。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种超声萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便(鸡粪、牛粪、猪粪等)中六类24种抗生素的方法。该方法通过对提取溶剂的优化，有效减少了抗生素与粪便中金属离子的螯合，使目标抗生素与样品中腐植酸及小分子蛋白质类有效分离。该方法能有效提高回收率，且操作简便，富集倍数高，重现性好。该方法将指示回收率内标物加在整个前处理过程前，能够很好地表示前处理过程中目标物质的损失，使最终结果更加真实可靠。
与现有技术相比，本发明的优点如下：
1、本发明采用甲醇混合EDTA-Mcllvaine缓冲液(V:V＝1:1)作为提取溶剂，能有效减少抗生素与粪便中金属离子的螯合，也能有效地使目标抗生素与样品中腐植酸及小分子蛋白质类分离，与传统方法相比，具有高精密度、高灵敏度、高稳定性、高选择性和高回收率等优点。
2、本发明的方法选择Waters公司Oasis HLB固相萃取柱对六类24种抗生素进行富集净化，去除了干扰杂质，降低了基质效应，提高了选择性和富集倍数；回收率高而稳定，选择性强，吸附容量大，达到了对目标物有效分离富集的目的。前处理操作过程简单，处理时间短，有机试剂使用量少，环境毒性低，节约了大量人力物力，避免接触化学品时造成的不必要伤害。
3、本发明的方法将内标物质(指示回收率替代物)加在提取过程前，能够很好地表示前处理过程中目标物质的损失，同时，考虑不同类别的抗生素结构和性质存在很大的差别，前处理过程中会有不同程度的损失，所以，分别选用13C6-磺胺甲恶唑、13C1D3-红霉素、D5-诺氟沙星作为磺胺类、大环内酯类和喹诺酮类抗生素的的内标物(即：选用13C6-磺胺甲恶唑作为磺胺类抗生素的内标物，选用13C1D3-红霉素作为大环内酯类抗生素的内标物，选用D5-诺氟沙星作为喹诺酮类抗生素的内标物；四环素类、酰胺醇类和青霉素类因没有这一类对应的内标物质，统一选用D5-诺氟沙星作为内标物质)，由于内标物选用得好，使得最终结果更加真实可靠。
具体实施方式
为了对发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现结合实施案例具体说明本发明。
实施例1：加标回收率实验
本发明采用内标法测定，该前处理方法对畜禽粪便中六类24种抗生素回收率的影响。加标回收率实验分为低水平添加量和高水平添加量两种：低水平添加量为分别向三类粪便中添加0.2mL 10mg/L的混合标准溶液(混合标准溶液为含有24种抗生素的混合标准溶液)；高水平添加量为分别向三类粪便中添加2mL 10mg/L的混合标准溶液。具体按以下步骤实施：
步骤一、畜禽粪便的提取
将采集的新鲜鸡粪、牛粪、猪粪，分别冷冻干燥、粉碎并过0.25mm筛。每种粪便设立三组样品，共9组样品。每组样品，准确称取1.000g样品于30mL玻璃离心管内。在每种粪便的三组样品中，两组样品分别按上述高水平添加量、低水平添加量两种添加量加入混合标准溶液，使添加到粪便中抗生素的最终浓度为20mg/kg和2mg/kg，第三组样品设为空白组(空白组不添加任何抗生素)。
再分别向高水平添加量、低水平添加量和空白三组样品中加入10μL，5mg/L的13C1D3-红霉素、D5-诺氟沙星、13C6-磺胺甲恶唑这三种指示回收率的内标物，并充分混合均匀。加入20mL甲醇混合EDTA-Mcllvaine缓冲液(V:V＝1:1)作为提取溶剂，涡旋30s后超声萃取20min，并以3000r/min离心15min，将上清液转入500mL玻璃烧杯中，再加入20mL甲醇混合EDTA-Mcllvaine缓冲液(V:V＝1:1)重复提取2次，合并3次提取液。将上述步骤中的提取液用超纯水稀释到500mL，用玻璃棒搅拌混合均匀后，经0.47μm玻璃纤维滤纸(滤膜)过滤除去细小颗粒状悬浮物，待固相萃取。
步骤二、固相萃取(SPE)前处理：富集净化过程
使用前将Supelco24管、固相萃取装置、Oasis HLB固相萃取小柱、缓冲装置和真空泵按顺序连接好。依次用5mL甲醇和等体积的超纯水活化固相萃取小柱。预处理后的500mL水样以3mL/min的速度过柱，上样完毕后依次用5mL超纯水和等体积体积浓度为5％的甲醇淋洗萃取柱，再将小柱置于真空状态下干燥10min，最后用10mL的甲醇(HPLC级甲醇)，以1mL/min的流速洗脱目标物至具塞玻璃离心管中，洗脱液在水浴条件下(水浴加热不得超过30℃)，用氮气吹干，得到残渣(残渣)。用体积浓度为70％的甲醇定容至1mL，超声5min后，经0.22μm PTFE针式滤器过滤后转移至棕色进样瓶中，待测。
步骤三、液相色谱串联质谱法测定畜禽粪便中六类24种抗生素的含量
采用内标法，在液相色谱-串联质谱仪上，定量检测进样瓶内的畜禽粪便样品中六类24种抗生素的含量(浓度)。检测条件如下：
液相色谱分离：色谱柱为C18液相色谱柱2.1mm×50mm×5μm，柱温35℃；流动相A即有机相为乙腈，流动相B即水相为含有0.5％甲酸的超纯水溶液(0.5％是体积浓度)；采取梯度洗脱程序：初始流动相中有机相比例为20％，1.5min前一直保持此比例；到4min时有机相升至95％，并维持此比例2min；后迅速回到初始比例，总的流动相时间为10min；流速为0.25mL/min。
质谱检测：离子源为电喷雾离子化源(ESI+)，源温度为150℃，锥孔电压：30V，毛细管电压为3.5kV，脱溶剂气温度：500℃，脱溶剂气流速为1000L/h，扫描时间：0.1s，检测方式选择多反应离子检测模式(MRM)。
考虑不同类别的抗生素结构和性质存在很大的差别，前处理过程中会有不同的程度的损失，所以，分别选用13C6-磺胺甲恶唑、13C1D3-红霉素、D5-诺氟沙星作为磺胺类、大环内酯类和喹诺酮类抗生素的内标物指示回收率(即：选用13C6-磺胺甲恶唑作为磺胺类抗生素的内标物，选用13C1D3-红霉素作为大环内酯类抗生素的内标物，选用D5-诺氟沙星作为喹诺酮类抗生素的内标物；四环素类、酰胺醇类和青霉素类因没有这一类对应的内标物质，统一选用D5-诺氟沙星作为内标物质)。考虑内标物质本身性质比较稳定，在正电喷雾电离源(ESI+)模式下响应良好且无明显基质干扰。
回收率计算
采用步骤一至步骤二的前处理方法进行前处理，采用步骤三的方法进行定量检测，分别对鸡粪、牛粪、猪粪进行加标回收率计算(加标的最终浓度为：0，2，20mg/kg，n＝3)，计算结果见表1至表3。
加标回收率(RE％)的计算公式为：
其中，RE：加标回收率，％；
C0：混合标准液的浓度，ng/mL；
C1：未加入混合标准液的粪便样品的检测浓度，ng/mL；
C2：加入混合标准溶液的粪便样品的检测浓度，ng/mL；
V0：混合标准液的体积，mL；
V1：未加入混合标准液的粪便样品上机前定容体积，mL；
V2：加入混合标准溶液的粪便样品上机前定容体积，mL。
由此可见，本发明的方法对24种目标物质的加标回收率在60.00-117.00％之间(其中鸡粪的加标回收率在60.00-115.00％，牛粪的加标回收率在62.50-117.00％，猪粪的加标回收率在62.50-113.00％)，相对标准偏差均低于5％，加标回收率存在差异，说明存在基质干扰；通过添加内标物质计算加标回收率，并用其对检测结果进行校正，可以在一定程度上降低基质干扰带来的影响。
表1.鸡粪样品中抗生素的实测浓度及不同加标浓度的加标回收率
表2.牛粪样品中抗生素的实测浓度及不同加标浓度的加标回收率
表3.猪粪样品中抗生素的实测浓度及不同加标浓度的加标回收率
实施例2-3：实际粪便样品中抗生素含量测定
采集上海市某鸡场、猪场和奶牛场的粪便(鸡粪、猪粪和牛粪)，先采用本发明步骤一的方法(超声萃取)进行样品预处理，再采用本发明步骤二的固相萃取方法进行富集净化前处理，之后采用本发明步骤三的液质联用检测方法对样品的实际浓度进行检测分析。具体检测过程如下：
(1)畜禽粪便样品的提取
将采集的新鲜鸡粪、牛粪、猪粪，分别冷冻干燥、粉碎并过0.25mm筛。每种粪便准确称取1.000g样品于30mL玻璃离心管内。每种粪便分别加入10μL，5mg/L的13C1D3-红霉素、D5-诺氟沙星、13C6-磺胺甲恶唑这三种指示回收率的内标物，与粪便样品混合均匀。即：分别选用13C6-磺胺甲恶唑、13C1D3-红霉素、D5-诺氟沙星作为磺胺类、大环内酯类和喹诺酮类抗生素的内标物指示回收率(选用13C6-磺胺甲恶唑作为磺胺类抗生素的内标物，选用13C1D3-红霉素作为大环内酯类抗生素的内标物，选用D5-诺氟沙星作为喹诺酮类抗生素的内标物；四环素类、酰胺醇类和青霉素类因没有这一类对应的内标物质，统一选用D5-诺氟沙星作为内标物质)。
再加入20mL甲醇混合EDTA-Mcllvaine缓冲液(V:V＝1:1)作为提取溶剂(EDTA-Mcllvaine缓冲溶液的配制：称取柠檬酸12.9g，磷酸氢二钠27.5g，乙二胺四乙酸二钠37.2g，用超纯水定容至1L，用0.1mol/L的硫酸或氢氧化钠调节pH值至4±0.05，需当天配制)。涡旋30s后超声萃取20min，并以3000r/min离心15min，将上清液即提取液转入500mL玻璃烧杯中，再加入20mL提取溶剂甲醇混合EDTA-Mcllvaine缓冲液(V:V＝1:1)重复提取2次，合并3次提取液。
将上述合并后的提取液用超纯水稀释到500mL或1000mL，用玻璃棒搅拌混合均匀后，经玻璃纤维滤纸过滤除去细小颗粒状悬浮物后待用。其中，超纯水稀释的体积根据具体情况可选择500或1000mL，但要保证其中有机溶剂的含量不超过总体积的10％。水样过滤所用的玻璃纤维滤膜选择Whatman GF/F系列玻璃纤维滤膜，其孔径可为0.45μm或0.47μm。
(2)固相萃取(SPE)前处理：富集净化过程
依次用甲醇和等体积的超纯水活化固相萃取小柱，将步骤(1)中处理过的水样过柱(即富集)，控制水样流速；富集完成后依次用超纯水和等体积的低浓度甲醇淋洗，并在真空条件下干燥固相萃取小柱；之后，再用甲醇洗脱，甲醇洗脱后用氮气吹干收集的洗脱液(甲醇溶液)，得到残渣；将残渣用一定浓度的甲醇重新溶解，定容，经超声、过滤后转移至进样瓶中，待测。
其中，浓缩富集水样采用的固相萃取小柱为Waters公司Oasis HLB小柱，其吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物。活化固相萃取小柱所用等体积甲醇和超纯水的体积，不超过10mL。水样流经固相萃取小柱的流速，不超过10mL/min，过柱时水样流速控制在1-4mL/min；洗脱HLB固相萃取柱的洗脱液流速小于1.0mL/min。淋洗所用的低浓度甲醇应为体积浓度小于10％的甲醇-水溶液。淋洗过后固相萃取小柱真空干燥的时间为10-20min。洗脱所用的甲醇为HPLC级甲醇(即高效液相色谱法级别的甲醇)。洗脱萃取柱所用的甲醇用量为萃取柱体积的2倍。定容氮吹后残渣的有机溶剂，采用体积浓度为70％的甲醇-水溶液。用甲醇重新溶解，定容后，超声5-15min，再用针式滤器过滤后转移至棕色进样瓶中，待测。过滤所使用针式滤器的有机相膜，选取孔径为0.22μm或以下的PTFE(聚四氟乙烯)针式滤头。
(3)液相色谱串联质谱法测定畜禽粪便样品中六类24种抗生素的含量
采用内标法，在液相色谱-串联质谱仪上，定量检测进样瓶内的畜禽粪便样品中六类24种抗生素的含量。检测条件如下：
液相色谱分离：色谱柱为C18液相色谱柱2.1mm×50mm×5μm，柱温35℃；流动相A即有机相为乙腈，流动相B即水相为含有0.5％甲酸的超纯水溶液(0.5％是体积浓度)；采取梯度洗脱程序：初始流动相中有机相比例为20％，1.5min前一直保持此比例；到4min时有机相升至95％，并维持此比例2min；后迅速回到初始比例，总的流动相时间为10min；流速为0.25mL/min。
质谱检测：离子源为电喷雾离子化源(ESI+)，源温度为150℃，锥孔电压：30V，毛细管电压为3.5kV，脱溶剂气温度：500℃，脱溶剂气流速为1000L/h，扫描时间：0.1s，检测方式选择多反应离子检测模式(MRM)。
鸡粪、牛粪、猪粪三类畜禽粪便样品中六类24种抗生素的实测浓度检测结果见表4。实验结果表明，本发明的方法可以用于鸡粪、牛粪和猪粪中抗生素含量的测定，检测准确度高，该方法具有良好的适用性。
表4.三类畜禽粪便样品中六类24种抗生素的实测浓度

Claims (10)

1.一种超声萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中六类24种抗生素的方法，其特征在于，按以下步骤进行：
(1)抗生素类物质的提取：超声萃取
称取经冷冻干燥、粉碎、过筛后的畜禽粪便，加入指示回收率的内标物，再加入提取溶剂，经超声萃取、离心后收集上清液即提取液，多次提取，合并提取液；用超纯水稀释合并后的提取液，过滤后待用；
(2)固相萃取前处理，即富集净化过程
依次用甲醇和等体积的超纯水活化固相萃取小柱，将经步骤(1)处理过的样品过柱即富集，控制水样流速；富集完成后依次用超纯水和等体积的低浓度甲醇淋洗，并在真空下干燥固相萃取柱；之后，再用甲醇洗脱，甲醇洗脱后用氮气吹干收集的洗脱液，得到残渣；将残渣用一定浓度的甲醇重新溶解，定容，经超声、过滤后转移至进样瓶中，待测；
(3)液相色谱串联质谱法测定粪便中六类24种抗生素的含量
采用内标法，在液相色谱-串联质谱仪上，定量检测进样瓶内的畜禽粪便样品中六类24种抗生素的含量；所述的六类24种抗生素是指磺胺类、四环素类、氟喹诺酮类、大环内酯类、酰胺醇类和青霉素类这六类的24种抗生素；24种抗生素分别为磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、环丙沙星盐酸盐、氟罗沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、盐酸土霉素、金霉素盐酸盐、阿莫西林三水合物、青霉素G甲盐、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素、盐酸氯苯胍。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，超声萃取前分别加入13C1D3-红霉素、D5-诺氟沙星、13C6-磺胺甲恶唑这三种内标物指示回收率。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，超声萃取前分别加入10μL，5mg/L的13C1D3-红霉素、D5-诺氟沙星、13C6-磺胺甲恶唑这三种内标物指示回收率。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，提取溶剂为甲醇混合EDTA-Mcllvaine缓冲液，甲醇:EDTA-Mcllvaine缓冲液体积比为1:1。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的EDTA-Mcllvaine缓冲液的配制方法如下：称取柠檬酸12.9g，磷酸氢二钠27.5g，乙二胺四乙酸二钠37.2g，用超纯水定容至1L，用0.1mol/L的硫酸或氢氧化钠调节pH值至4±0.05，当天配制。
6.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，过滤所用的滤膜是孔径为0.45μm或0.47μm的Whatman GF/F系列玻璃纤维滤膜。
7.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的固相萃取柱是Waters公司Oasis HLB小柱，它是一种亲水-亲脂性聚合物填料柱，其吸附剂是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂；步骤(2)中，过柱时水样流速控制在1-4mL/min；洗脱HLB固相萃取柱的洗脱液流速小于1.0mL/min。
8.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，淋洗所用的低浓度甲醇为体积浓度小于10％的甲醇-水溶液；洗脱所用的甲醇为HPLC级甲醇；定容残渣所用的甲醇是体积浓度为70％的甲醇-水溶液；用甲醇定容后，超声5-15min，再用针式滤器过滤；针式滤器选用孔径小于0.22μm的聚四氟乙烯针式滤头。
9.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，采用Waters Xevo TQ-Smicro型液相色谱-串联质谱仪定量检测粪便中抗生素的浓度；液相色谱的检测条件为：色谱柱为C18液相色谱柱2.1mm×50mm×5μm，柱温35℃；采取梯度洗脱程序：流动相A即有机相为乙腈，流动相B即水相为含有0.5％甲酸的超纯水溶液；初始流动相中有机相比例为20％，1.5min前一直保持此比例；到4min时有机相升至95％，并维持此比例2min；后迅速回到初始比例，总的流动相时间即洗脱总时间为10min，进样体积为5μL；流速为0.25mL/min；质谱的检测条件为：离子源为电喷雾离子化源ESI+；扫描方式：多反应离子检测MRM；锥孔电压范围为10-30V，碰撞能范围为13-40eV。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，质谱的检测条件为：源温度为150℃，锥孔电压：30V，毛细管电压为3.5kV，脱溶剂气温度：500℃，脱溶剂气流速为1000L/h，扫描时间：0.1s。
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