CN109342632A - 微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测水产养殖底泥中15种抗生素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微波萃取‑固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测水产养殖底泥中15种抗生素的方法。该方法为：(1)底泥样品预处理，加入指示回收率的内标物磺胺甲噁唑‑¹³C₆、诺氟沙星‑D₅、青霉素G钾盐‑D₅、四环素‑D₆、喹乙醇‑D₄、阿莫西林‑¹³C₆和甲氧苄啶‑D₃；加入乙腈:磷酸盐缓冲溶液作提取液微波萃取；(2)固相萃取富集净化目标抗生素；(3)液质联用仪定量检测底泥中七类15种抗生素。该方法通过优选内标物，筛选合适的前处理方法，优化检测条件，可一次性同时检测出水产养殖底泥中含八种新增抗生素的15种抗生素的残留情况，具有高回收率、高灵敏度、高稳定性、低检测限、检测结果更真实可靠等优点。

Description

微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测水产 养殖底泥中15种抗生素的方法

技术领域

本发明属于有机污染物质残留检测技术领域，涉及一种水产养殖底泥中微量抗生素的检测方法，特别涉及一种微波萃取-固相萃取前处理结合液相色谱串联质谱技术同时检测水产养殖底泥中15种抗生素含量的方法。

技术背景

近年来，我国的水产养殖业发展迅速，规模化与集约化成为养殖的趋势，而水生动物疾病发生的频率也在提高。为了防治鱼类疾病和加快鱼类生长、繁殖,水产养殖业广泛而大量地使用抗生素。抗生素主要通过添加到饲料和直接投入的方式应用于水产养殖过程中，研究表明，仅有20％-30％的抗生素被水生动物吸收，其它则以原形或者代谢物形式被排入环境。这些抗生素可通过范德华力、氢键、疏水分配作用等吸附在底泥上。底泥中大量的微生物经抗生素诱导产生抗性基因，进而产生耐药性，从而导致一些能够抵抗强力抗生素的病原菌出现。

底泥样品中抗生素的含量较低，而且底泥样品基质复杂，干扰物多，这些干扰成分的存在对准确高效地测定底泥中抗生素含量具有较大的挑战。因此，建立一种有效的分离富集方法对准确测定底泥中抗生素的含量尤为重要。底泥样品中抗生素的分析方法主要包括样品的前处理方法和检测方法。目前样品前处理中常用的提取方法主要有索式萃取法、加速溶剂萃取法、超声萃取法、微波萃取法等。其中，微波萃取法对容器中的溶剂和样品直接进行加热，样品与溶剂可在很短的时间内升高到很高的温度，提高了加热速率，强化了溶剂萃取效率，具有时间短、节省试剂、回收率高等优点，尤其适用于底泥等复杂基质。同时，抗生素的种类多，物化性质差异大，提取剂的选择对回收率高低有着直接的影响。理想的环境样品前处理方法是不破坏待测组分的形态，减少污染，并且能使待测组分与基质有效分离。目前常用的检测方法主要有高效液相色谱法(HLPC)和高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)。HPLC-MS/MS兼具HLPC强的分离能力，同时又具有MS高灵敏度和极强的定性鉴定能力，是目前检测环境复杂基质痕量抗生素残留最有效的手段之一，具有分析范围广、分离能力强、定性分析结果可靠、检测限低、分析时间快和自动化程度高等优点。可准确地定性、定量测定复杂混合物的组分。

随着抗生素在水产养殖过程中大量使用，对于能够快速、灵敏、准确地测定各种环境介质中尽可能多的抗生素残留存在迫切需要。然而，目前针对水产养殖底泥中多种抗生素的分离富集和共检测尚无一套完整可靠的检测方法，现有的检测方法普遍存在不稳定、干扰多、检测抗生素的种类和数量有限、回收率有限等问题，因此，急需一种检测结果稳定、干扰小，能够快速、高效、灵敏、准确，同时检测出水产养殖底泥中尽可能多的抗生素残留的包括分离富集和共检测的完整可靠的检测方法。

发明内容

本发明的目的旨在克服现有技术的不足，提供了一种检测结果稳定、干扰小、快速、高效的同时测定水产养殖底泥中15种目标抗生素的方法，即一种微波萃取- 固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测水产养殖底泥中15种抗生素的方法。

本发明的技术构思如下：

本发明的方法采用微波萃取结合固相萃取作为水产养殖底泥样品的前处理，并以高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)作为检测器，同时测定样品中15种目标抗生素的含量。选择水产养殖中常见的15种抗生素(磺胺嘧啶SD、磺胺甲基嘧啶SM1、磺胺二甲基嘧啶SM2、磺胺间二甲氧基嘧啶SDM、磺胺甲噁唑SMX、甲氧苄啶TMP、恩诺沙星ENR、环丙沙星CIP、诺氟沙星NOR、呋喃唑酮AOZ、金霉素CTC、土霉素OTC、盐酸多西环素DOX、阿莫西林AMZ、喹乙醇OLA)，采用单因素试验，选择最优的条件，得到最优条件下抗生素的最大萃取率。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测水产养殖底泥中15种抗生素的方法，其具体步骤如下：

(1)抗生素的提取：微波萃取

称取经冷冻干燥、粉碎、过筛后的底泥样品，加入指示回收率的内标物，再加入提取溶剂，经微波萃取、过滤后收集提取液，用超纯水稀释，调节pH值；

所述的指示回收率的内标物为磺胺甲噁唑-¹³C₆、诺氟沙星-D₅、青霉素G钾盐 -D₅、四环素-D₆、喹乙醇-D₄、阿莫西林-¹³C₆和甲氧苄啶-D₃；

(2)富集净化：固相萃取(SPE)

依次用甲醇和等体积的超纯水活化固相萃取柱，将经步骤(1)处理过的样品过柱，控制样品过柱流速；富集完后，依次用超纯水和低浓度的甲醇淋洗固相萃取柱，并真空干燥固相萃取柱；最后用甲醇洗脱固相萃取柱，经氮吹仪吹干，获得残渣；将残渣用一定浓度的有机溶剂溶解、定容、超声、过滤后转移至小瓶，待测；

(3)高效液相色谱串联质谱法测定水产养殖底泥中七类15种抗生素的含量

采用内标法，用高效液相色谱串联质谱仪，定量检测水产养殖底泥中七类15种抗生素；所述的15种抗生素包括磺胺类、喹诺酮类、四环素类、β-内酰胺类、硝基呋喃类、甲氧苄啶、喹乙醇这七类抗生素；15种抗生素分别为磺胺嘧啶SD、磺胺甲基嘧啶SM1、磺胺二甲基嘧啶SM2、磺胺间二甲氧基嘧啶SDM、磺胺甲噁唑SMX、甲氧苄啶TMP、恩诺沙星ENR、环丙沙星CIP、诺氟沙星NOR、呋喃唑酮AOZ、金霉素CTC、土霉素OTC、盐酸多西环素DOX、阿莫西林AMZ、喹乙醇OLA。

进一步的技术方案如下：

步骤(1)中，微波萃取前分别加入100ng的磺胺甲噁唑-¹³C₆、诺氟沙星-D₅、青霉素G钾盐-D₅、四环素-D₆、喹乙醇-D₄、阿莫西林-¹³C₆和甲氧苄啶-D₃这7种内标物指示回收率。

步骤(1)中，所述的提取溶剂，是乙腈:磷酸盐缓冲溶液(V:V＝1:1)，即乙腈:磷酸盐缓冲液体积比为1:1的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液；采用CEM MARS CLASSIC型微波萃取仪进行萃取，提取底泥中的抗生素。

步骤(1)中，底泥样品过筛所用的筛网为孔径0.25mm的筛网。微波萃取后过滤提取液所用的玻璃纤维滤膜并没有特别的限定，例如孔径可为0.45μm、0.47μm或 0.7μm，其目的是去除提取液中残留的底泥，防止后续对富集和检测的影响。

步骤(1)中，稀释后的样品pH值调至3-4，并没有特定的数值要求。

步骤(2)中，富集净化所用的固相萃取柱为Waters公司Oasis HLB小柱，它是一种亲水-亲脂性聚合物填料柱，其吸附剂(填料)是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N- 乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂。

步骤(2)中，样品经过固相萃取柱的流速并没有特别的限定。为了保证目标物质在固相萃取柱上充分吸附，样品流经速度(即样品过柱流速)最好不要超过5mL/min。

步骤(2)中，活化固相萃取柱所用的甲醇和超纯水用量为5-10mL，水样以较慢的速度过柱，水样流速最好不要超过5mL/min；淋洗固相萃取柱所用的超纯水和低浓度甲醇水溶液各为5-10mL；真空干燥的时间在5-10min；洗脱固相萃取柱时的流速低于10mL/min。

步骤(2)中，淋洗固相萃取柱所用的低浓度甲醇为体积浓度小于10％的甲醇-水溶液；残渣用有机溶剂定容后，超声5-10min；用针式滤器过滤至棕色进样瓶(小瓶)；针式滤器选用孔径小于0.22μm的聚四氟乙烯针式滤头。

其中，淋洗固相萃取柱所用的低浓度甲醇中，甲醇与水的比例并没有特别的限定。其目的是洗去固相萃取柱中多余的杂质，但为了防止目标物质同时被洗出的可能，淋洗所用水溶液中甲醇的比例不要超过10％。

步骤(2)中，用于溶解氮吹后残留物质的有机溶剂，没有特别的限定，可选用甲醇、或乙腈，或体积浓度为70-80％的甲醇-水溶液，或体积浓度为70-80％的乙腈- 水溶液，如：甲醇:水体积比为7:3的甲醇-水溶液，或乙腈:水体积比为8:2的乙腈- 水溶液等。

步骤(3)中，选用Waters公司的Acquity HPLC^@Hclass-Xevo TQ-S micro高效液相色谱串联质谱仪进行检测；色谱柱选用Acquity HPLC^@ BEH-C18柱 (1.7μm,2.1×100mm)。

步骤(3)中，液相色谱分离参数为：流动相流速0.3mL/min；进样量2.0μL；柱温 40℃；流动相A是体积浓度为0.5％的甲酸-水溶液(其中的水为Milli-Q超纯水)；流动相B为分析级乙腈；梯度洗脱程序为：0-2.2min,20％B；2.5-5min，95％B；6-9min,20％B。

步骤(3)中，质谱检测条件为：电喷雾离子源正离子模式ESI+，三重四级杆质量分析器，扫描方式为多反应监测模式MRM，碰撞气为氩气，脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流量为1000L/Hr，锥孔电压为3500V，扫描时间为0.1s。

本发明的有益效果：

本发明的检测方法通过微波萃取-固相萃取-高效液相色谱串联质谱技术，能够实现快速、高效、灵敏、准确地同时检测出水产养殖底泥中七类15种抗生素，大大提高了检测效率，降低了检测成本，并且，检测结果稳定、干扰小。

与现有技术相比，本发明存在的优势是：

1.本发明采用微波萃取法对底泥中的抗生素进行提取。相比于振荡提取，可有效提高萃取效率，减少萃取剂用量，降低萃取时间，提高回收率，达到对目标抗生素提取的目的。

2.本发明选择Oasis HLB固相萃取柱对七类15种抗生素进行富集纯化，回收率高而稳定，选择性强，吸附容量大，达到了对目标物有效分离富集的目的。

3.本方法采用内标标准曲线法对抗生素定量，测定结果线性关系好，相对偏差小，提高了分析的精密度。

4.本发明采用高效液相色谱串联质谱仪进行定量分析检测，灵敏度高，15种抗生素的检测限均低于2ng/L，能够满足对底泥中痕量抗生素的检测要求。此外，串联三重四级杆质谱仪根据对应母离子碰撞产生的特征碎片离子进行定性分析，选择性强，排除了样品中其他杂质信号的干扰。

5.本发明的方法将指示回收率的内标物质加在微波萃取前，能够更准确地表示整个前处理过程中抗生素的损失，同时，考虑不同种类的抗生素在前处理过程中有不同程度的损失，对结构相似的抗生素选用同种内标物质指示回收率；本发明中分别选用磺胺甲噁唑-¹³C₆作为磺胺类抗生素(磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间二甲氧基嘧啶、磺胺甲噁唑)的内标物，选用诺氟沙星-D₅作为喹诺酮类抗生素(恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星)的内标物，选用四环素-D₆作为四环素类抗生素(金霉素、土霉素、盐酸多西环素)的内标物，选用青霉素G钾盐-D₅作为硝基呋喃类抗生素呋喃唑酮的内标物，选用阿莫西林-¹³C₆作为β-内酰胺类抗生素阿莫西林的内标物，选用甲氧苄啶-D₃作为甲氧苄啶的内标物，选用喹乙醇-D₄作为喹乙醇的内标物，由于内标物选用得好，使得最终检测结果更加真实可靠。

而现有的有机污染物质残留微量抗生素检测方法中，四环素类和β-内酰胺类抗生素并没有对应的内标物质，一般是选用诺氟沙星-D₅作为内标物质，这样检测出的结果会有一些偏差。现有的微量抗生素检测方法中，喹乙醇的检测，通常以乙酰苯胺作为内标物质，其检测结果不如本发明中以喹乙醇-D₄作为喹乙醇的内标物的检测结果准确。

6.本发明中有机试剂使用量少，环境友好。一次进样可以检测出底泥中的15 种抗生素检测过程耗时少，节约人力物力成本。

7.本发明的检测方法，在现有的固相萃取-液相色谱串联质谱法同时检测粪便中多种类抗生素的检测方法的基础上，针对水产养殖底泥中常用或禁用的15种抗生素作为目标(这15种抗生素中包含了新增的磺胺甲基嘧啶、甲氧苄啶、喹乙醇、呋喃唑酮、诺氟沙星、金霉素、土霉素和盐酸多西环素这八种抗生素)，该检测方法通过优选内标物，以及优化检测条件，能够一次性同时检测出水产养殖底泥中包含了新增的八种抗生素在内的15种抗生素，并且，该检测方法内标物回收率更高，数据结果更真实可靠。

附图说明

图1是使用五种不同提取溶剂测得水产养殖底泥中15种抗生素的加标回收率。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，以下提供一种分离富集并同时检测水产养殖底泥中15种抗生素的方法和具体实施方式和内容。

实施例1：样品的前处理

目标抗生素种类多，物化性质差异大，为了实现底泥中多种抗生素提取效率的最大化，本发明采用单因素试验研究了五种不同提取液对目标物质的提取效果。

具体按以下步骤实施：

将采集的底泥冷冻干燥后，研磨并过孔径0.25mm的筛网。设立两组用于对比试验的底泥样品，一组为标准样品组，另一组为空白样品组，每组设两个平行。分别准确称取2.00g的底泥样品于100mL的烧杯中。向标准样品组中分别加入低、中、高三个浓度的抗生素混合标准溶液(即15种抗生素的混合标准溶液)，即分别向底泥样品中添加40ng、100ng、200ng的抗生素混合标准溶液，使添加到底泥中的抗生素最终浓度为20μg/kg、50μg/kg、100μg/kg。空白样品组不添加任何抗生素。

每种底泥样品中分别加入100ng的磺胺甲噁唑-¹³C₆、诺氟沙星-D₅、青霉素G钾盐-D₅、四环素-D₆、喹乙醇-D₄、阿莫西林-¹³C₆和甲氧苄啶-D₃这七种指示回收率的内标物，与底泥样品充分混合均匀后，放置在通风橱干燥30min。

将烧杯中的底泥样品转移至微波萃取罐中，加入50mL乙腈:磷酸盐缓冲溶液 (V:V＝1:1)作为提取溶剂，进行微波萃取，萃取温度为65℃，萃取功率为1200W，萃取时间梯度设置为：温度爬升10min、保持35min、降温20min。萃取结束后过滤，收集提取液，用蒸馏水稀释至500mL，调节pH值至3。

使用Reeko Fotector Plus全自动固相萃取仪、Oasis HLB固相萃取柱对抗生素富集净化。固相萃取程序如下：甲醇活化(5mL/min，6mL)，H₂O活化(5mL/min，6mL)，大体积上样(5mL/min，500mL)；上样结束后，超纯水淋洗(5mL/min,6mL)，体积浓度为5％的甲醇-水溶液淋洗(5mL/min,6mL)；之后，将萃取柱置于真空状态下干燥 5min；甲醇洗脱(5mL/min,10mL)，洗脱液用氮气吹干，得到残渣；用体积浓度为80％的甲醇溶解、定容至1mL，超声5min后，经0.22μmPTFE针式滤器过滤，然后，将溶液样品转移至棕色进样瓶中，待测。

考虑到不同种类的抗生素结构和性质存在很大的差别，前处理过程中会有不同程度的损失，所以，分别选用磺胺甲噁唑-¹³C₆作为SD、SM1、SM2、SDM、SMX 的内标物，选用诺氟沙星-D₅作为ENR、CIP、NOR的内标物，选用四环素-D₆作为 CTC、OTC、DOX的内标物，选用青霉素G钾盐-D₅作为AOZ的内标物，选用阿莫西林-¹³C₆作为AMZ的内标物，选用甲氧苄啶-D₃作为TMP，选用喹乙醇-D₄作为喹乙醇的内标物。

采用5种不同的提取溶剂(①甲醇:磷酸盐缓冲溶液(V:V＝1:1)，即甲醇:磷酸盐缓冲液的体积比为1:1的甲醇与磷酸盐缓冲液的混合溶液；②乙腈:磷酸盐缓冲溶液(V:V＝1:1)，即乙腈:磷酸盐缓冲液的体积比为1:1的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液；③丙酮:磷酸盐缓冲溶液(V:V＝1:1)，即丙酮:磷酸盐缓冲液的体积比为1:1 的丙酮与磷酸盐缓冲液的混合溶液；④乙腈:柠檬酸缓冲溶液(V:V＝1:1)，即乙腈:柠檬酸缓冲液的体积比为1:1的乙腈与柠檬酸缓冲液的混合溶液；⑤乙腈:EDTA-Mcllvaine缓冲溶液(V:V＝1:1)，即乙腈:EDTA-Mcllvaine缓冲液的体积比为1:1的乙腈与EDTA-Mcllvaine缓冲液的混合溶液)，分别按上述方法进行试验，测得底泥中15种抗生素的加标回收率，见图1。从图1可看出，采用乙腈:磷酸盐缓冲溶液(V:V＝1:1)作提取溶剂，回收率最高，效果最好。因此，在对水产养殖底泥中抗生素的实际检测中，可选用乙腈:磷酸盐缓冲溶液(V:V＝1:1)作提取溶剂。

实施例2：检测方法的建立

(一)质谱条件的优化

液相色谱-串联质谱仪能够利用特征碎片离子准确定量。因此，需要优化破碎电压和碰撞能，以获得最佳分子离子-碎片离子对，使后续对实际水样的检测分析更加精确。

采用直接进样法，将每种含100μg/L的目标抗生素的溶液样品分别注入离子源中，在正离子检测方式下进行母离子全扫描，得到每种抗生素最大响应值的母离子，然后进行二级质谱扫描，得到定性离子与定量离子。表1中列出了多反应模式下 (MRM)下15种抗生素的质谱分析参数。

表1.多反应模式下(MRM)下15种抗生素的质谱分析参数

(二)液相条件的优化

在色谱条件中，流动相和洗脱程序是抗生素分离效果的重要影响因素。为了实现色谱峰分离并提高信号强度，本发明对流动相、流速、进样量及梯度洗脱程序等因素分别做了优化。本发明采用的液相检测条件如表2所示。

表2.液相检测条件

(三)标准曲线、检测限和定量限

检测限(LOD)和定量限(LOQ)是表示分析方法好坏的重要指标。采用信噪比法 (S/N)确定检测限和定量限。以3倍信噪比估算出检测限，10倍信噪比估算出定量限。

将抗生素混合标准溶液用色谱级甲醇稀释，配制成1mL一系列不同浓度的抗生素混合标准工作液，浓度分别为1.37μg/L，3.14μg/L，12.35μg/L，37.04μg/L， 111.11μg/L，333.33μg/L和500μg/L,再向其中加入100ng的磺胺甲噁唑-¹³C₆、诺氟沙星-D₅、青霉素G钾盐-D₅、四环素-D₆、喹乙醇-D₄、阿莫西林-¹³C₆和甲氧苄啶 -D₃这七种内标物。用上述HPLC-MS/MS方法进行检测分析。各抗生素的相关系数、检测限、定量限如表3所示。

表3.各抗生素的相关系数、检测限、定量限

(四)回收率

采用实施例1的前处理方法和实施例2的检测方法，对底泥样品进行加标回收率计算(加标最终浓度为100μg/kg)，计算结果如4表所示。

加标回收率(RE％)的计算公式为：

其中，RE：加标回收率，％；

C0：混合标准液的浓度，ng/mL；

C1：未加入混合标准液的底泥样品的检测浓度，ng/mL；

C2：加入混合标准溶液的底泥样品的检测浓度，ng/mL；

V0：混合标准液的体积，mL；

V1：未加入混合标准液的底泥样品上机前定容体积，mL；

V2：加入混合标准溶液的底泥样品上机前定容体积，mL。

本方法考察了15种抗生素3个浓度的加标回收率，结果如4表所示，各抗生素的回收率在69.7％-109.4％，相对标准偏差均低于10％。通过添加内标物可一定程度上降低机制干扰带来的影响。

表4.底泥样品中不同加标浓度的加标回收率及相对标准偏差

实施例3：实际样品的测定

采集上海某水产养殖区鱼塘、虾塘、蟹塘的底泥，先采用本发明的前处理方法对样品进行提取及富集净化，再采用本发明的检测方法对样品的实际浓度进行检测分析，以考察本方法对不同种类底泥样品的适用性。

具体按以下步骤实施：

(1)抗生素的提取：微波萃取

将采集的底泥冷冻干燥后，研磨并过孔径0.25mm的筛网。在过筛后的底泥样品中分别加入100ng的磺胺甲噁唑-¹³C₆、诺氟沙星-D₅、青霉素G钾盐-D₅、四环素 -D₆、喹乙醇-D₄、阿莫西林-¹³C₆和甲氧苄啶-D₃这七种指示回收率的内标物，与底泥样品充分混合均匀后，放置在通风橱干燥30min。

将烧杯中的底泥样品转移至微波萃取罐中，加入50mL乙腈:磷酸盐缓冲溶液 (V:V＝1:1)作为提取溶剂，进行微波萃取，萃取温度为65℃，萃取功率为1200W，萃取时间梯度设置为：温度爬升10min、保持35min、降温20min。萃取结束后过滤，收集提取液，用蒸馏水稀释至500mL，调节pH值至3。

(2)富集净化：固相萃取(SPE)

使用Reeko Fotector Plus全自动固相萃取仪、Oasis HLB固相萃取柱对抗生素富集净化。固相萃取程序如下：甲醇活化(5mL/min，6mL)，H₂O活化(5mL/min，6mL)，大体积上样(5mL/min，500mL)；上样结束即富集完后，超纯水淋洗(5mL/min，6mL)，体积浓度为5％的甲醇-水溶液淋洗(5mL/min，6mL)；之后，将萃取柱置于真空状态下干燥5min；甲醇洗脱(5mL/min，10mL)，洗脱液用氮气吹干，得到残渣；用体积浓度为80％的甲醇溶解、定容至1mL，超声5min后，经0.22μmPTFE针式滤器过滤，然后，将溶液样品转移至棕色进样瓶中，待测。

(3)高效液相色谱串联质谱法测定水产养殖底泥中15种抗生素的含量

采用内标法，用高效液相色谱串联质谱仪，定量检测水产养殖底泥中七类15种抗生素。

选用美国沃特斯公司的Acquity HPLC^@Hclass-Xevo TQ-S micro高效液相色谱串联质谱仪进行检测；色谱柱选用Acquity HPLC^@BEH-C18柱(1.7μm,2.1×100mm)。

液相色谱分离参数为：流动相流速0.3mL/min；进样量2.0μL；柱温40℃；流动相A是体积浓度为0.5％的甲酸-水溶液(其中的水为Milli-Q超纯水)；流动相B为分析级乙腈；梯度洗脱程序为：0-2.2min,20％B；2.5-5min,95％B；6-9min,20％B。

质谱检测条件为：电喷雾离子源正离子模式ESI+，三重四级杆质量分析器，扫描方式为多反应监测模式MRM，碰撞气为氩气，脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流量为1000L/Hr，锥孔电压为3500V，扫描时间为0.1s。

实际检测得到的鱼塘、虾塘、蟹塘底泥中15种抗生素检测含量如5表所示。

表5.鱼塘、蟹塘、虾塘底泥样品中15种抗生素的检测含量

实验结果表明，本方法可以应用于水产养殖底泥中抗生素含量的测定，具有良好的适用性。

Claims (10)

1.一种微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测水产养殖底泥中15种抗生素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)抗生素的提取：微波萃取

称取经冷冻干燥、粉碎、过筛后的底泥样品，加入指示回收率的内标物，再加入提取溶剂，经微波萃取、过滤后收集提取液，用超纯水稀释，调节pH值；

所述的指示回收率的内标物为磺胺甲噁唑-¹³C₆、诺氟沙星-D₅、青霉素G钾盐-D₅、四环素-D₆、喹乙醇-D₄、阿莫西林-¹³C₆和甲氧苄啶-D₃；

(2)富集净化：固相萃取

依次用甲醇和等体积的超纯水活化固相萃取柱，将经步骤(1)处理过的样品过柱，控制样品过柱流速；富集完后，依次用超纯水和低浓度的甲醇淋洗固相萃取柱，并真空干燥固相萃取柱；最后用甲醇洗脱固相萃取柱，经氮吹仪吹干，获得残渣；将残渣用一定浓度的有机溶剂溶解、定容、超声、过滤后转移至小瓶，待测；

(3)高效液相色谱串联质谱法测定水产养殖底泥中七类15种抗生素的含量

采用内标法，用高效液相色谱串联质谱仪，定量检测水产养殖底泥中七类15种抗生素；所述的15种抗生素包括磺胺类、喹诺酮类、四环素类、β-内酰胺类、硝基呋喃类、甲氧苄啶、喹乙醇这七类抗生素；15种抗生素分别为磺胺嘧啶SD、磺胺甲基嘧啶SM1、磺胺二甲基嘧啶SM2、磺胺间二甲氧基嘧啶SDM、磺胺甲噁唑SMX、甲氧苄啶TMP、恩诺沙星ENR、环丙沙星CIP、诺氟沙星NOR、呋喃唑酮AOZ、金霉素CTC、土霉素OTC、盐酸多西环素DOX、阿莫西林AMZ、喹乙醇OLA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，微波萃取前分别加入100ng的磺胺甲噁唑-¹³C₆、诺氟沙星-D₅、青霉素G钾盐-D₅、四环素-D₆、喹乙醇-D₄、阿莫西林-¹³C₆和甲氧苄啶-D₃这七种内标物指示回收率。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的提取溶剂，是乙腈:磷酸盐缓冲液体积比为1:1的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液；采用CEM MARS CLASSIC型微波萃取仪进行萃取，提取底泥中的抗生素；底泥样品过滤所用的筛网为孔径0.25mm的筛网；微波萃取后过滤提取液所用的玻璃纤维滤膜孔径为0.45μm、0.47μm或0.7μm；稀释后的样品pH值调至3-4。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，活化固相萃取柱所用的甲醇和超纯水用量为5-10mL；淋洗固相萃取柱所用的超纯水和低浓度甲醇水溶液各为5-10mL；真空干燥的时间在20-30min；洗脱固相萃取柱时的流速低于10mL/min。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，富集净化所用的固相萃取柱为Waters公司Oasis HLB小柱，它是一种亲水-亲脂性聚合物填料柱，其吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂；样品过柱流速不超过5mL/min；活化固相萃取柱的流速不超过5mL/min。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，淋洗固相萃取柱所用的低浓度甲醇为体积浓度小于10％的甲醇-水溶液；残渣用有机溶剂溶解、定容后，超声5-10min；用针式滤器过滤至棕色进样小瓶；针式滤器选用孔径小于0.22μm的聚四氟乙烯针式滤头。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，溶解氮吹后残留物质的有机溶剂为甲醇或乙腈，或体积浓度为70-80％的甲醇-水溶液，或体积浓度为70-80％的乙腈-水溶液。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，选用Waters公司的AcquityHPLC^@Hclass-Xevo TQ-S micro高效液相色谱串联质谱仪进行检测；色谱柱选用AcquityHPLC^@BEH-C18柱，1.7μm,2.1×100mm。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，液相色谱分离参数为：流动相流速0.3mL/min；进样量2.0μL；柱温40℃；流动相A是体积浓度为0.5％的甲酸-水溶液，其中的水为Milli-Q超纯水；流动相B为分析级乙腈；梯度洗脱程序为：0-2.2min,20％B；2.5-5min,95％B；6-9min,20％B。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，质谱检测条件为：电喷雾离子源正离子模式ESI+，三重四级杆质量分析器，扫描方式为多反应监测模式MRM，碰撞气为氩气，脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流量为1000L/Hr，锥孔电压为3500V，扫描时间为0.1s。