CN110632214B - 兽用硫酸庆大霉素中组胺含量的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种兽用硫酸庆大霉素中组胺含量的测定方法，属于分析化学技术领域，该测定方法使用盐酸‑甲醇溶液或盐酸‑乙腈溶液提取稀释后的兽用硫酸庆大霉素样品中的组胺，以C18粉净化提取液中的杂质，再经过氮吹和乙腈甲酸溶液复溶解，进行LC‑MS/MS测定。本发明提供的兽用硫酸庆大霉素中组胺含量的测定方法，通过对样品前处理，使得高效液相质谱联用仪可以更好排除基体的干扰，进而利用LC‑MS/MS快速准确地检测兽用硫酸庆大霉素中组胺并对其进行定量，克服了兽用硫酸庆大霉素中组胺提取困难的问题，弥补了现有技术中不能对兽用硫酸庆大霉素中组胺含量进行定量检测空缺。

Description

兽用硫酸庆大霉素中组胺含量的测定方法
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种兽用硫酸庆大霉素中组胺含量的测定方法。
背景技术
庆大霉素是由绛红小单孢菌(Micromons pra prppurea)发酵代谢而产生的一族氨基糖甙抗生素。它主要由庆大霉素C1、C2和C1a三种成份组成。主要用于治疗细菌感染，尤其是革兰氏阴性菌引起的感染。庆大霉素能与细菌核糖体30s亚基结合，阻断细菌蛋白质合成。庆大霉素是一种副作用小、杀菌力强并且是为数不多的、热稳定性的抗生素，因而广泛应用于培养基配置。但是由于庆大霉素发酵过程中(培养基为鱼虾牛羊肉下脚料等制成的蛋白胨)带入及细菌发酵等原因，庆大霉素中含有一定量的组胺。组胺是广泛存在于动植物体内的一种生物胺，是由组氨酸脱羧而形成的，通常贮存于组织的肥大细胞中。若注射含大量组胺的庆大霉素后，有可能1-5min即出现皮肤潮红、眩晕、头痛、恶心、心动过速、各种类型心律失常及低血压等不良反应，并可能发生荨麻疹、哮喘样发作、喉头痉挛及血管神经水肿等。还可引起应激性溃疡和消化道出血。偶致持续性低血压、呼吸困难等严重后果。
2016年下半年，欧盟部分国家的硫酸庆大霉素用户发现，给马匹静脉注射硫酸庆大霉素后出现了不良反应，动物实验测试中显示该不良反应可能与产品中含有组胺类物质相关，但国际上对硫酸庆大霉素等氨基糖甙类广谱抗生素中组胺含量没有相应的定量检测方法，无法对其进行准确定量检测，也没有限量规定和要求。因出口欧盟的硫酸庆大霉素曾经被质疑含有组胺造成马匹死亡，因此要继续在欧盟市场销售硫酸庆大霉素的前提是必须提供组胺含量的检测结果，需要开发定量检测方法，测定相关产品中组胺类物质含量，并建立相应的质量控制标准，确定限量规定和要求。但由于组胺与硫酸庆大霉素的多种性状相近，且硫酸根具有很强吸附性，提取困难，在经多种方法初步检测后发现检测结果受到硫酸庆大霉素的严重干扰，结果不准确且不具有可比性，检测方法的缺乏严重阻碍了我国兽用硫酸庆大霉素出口，因此建立可靠稳定的兽用硫酸庆大霉素中组胺含量检测方法迫在眉睫。
目前，在组胺含量现有的检测方法主要是应用在食品(鱼、肉等)和饲料等产品上，有紫外、液相、分子荧光分光光度计、试剂盒方法等检测技术。但前期通过加标检测发现，以上方法结果的敏感性、准确性、稳定性等指标均不满足要求，上述方法都不适用硫酸庆大霉素中组胺的检测。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种能够可靠地、稳定地检测兽用硫酸庆大霉素中组胺含量的测定方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种兽用硫酸庆大霉素中组胺含量的测定方法，包括以下步骤：
(1)提取：使用盐酸-甲醇溶液或盐酸-乙腈溶液提取稀释后的兽用硫酸庆大霉素样品中的组胺，得提取液；
(2)净化：以C18净化步骤(1)所得提取液中的杂质，得上清液；
(3)氮吹：取步骤(2)所得上清液氮吹至净干，得到固态样品；
(4)测定：取步骤(3)所得固态样品加入乙腈甲酸溶液复溶解，过滤后进行LC-MS/MS测定。
本发明的有益效果在于：本发明提供的兽用硫酸庆大霉素中组胺含量的测定方法，利用硫酸庆大霉素和组胺在特定溶剂中不同的溶解度对组胺进行提取，同时限定溶剂的浓度，使硫酸庆大霉素处于半结晶状态，降低结晶状态的硫酸庆大霉素对组胺的吸附作用，而后用吸附剂对组胺进一步进行纯化，得到较高回收率和较高纯度的组胺物质，通过对样品前处理(提取和净化)方法进行改进，使用盐酸-甲醇溶液或盐酸-乙腈溶液提取并以C18净化，使得高效液相质谱联用仪可以更好排除基体的干扰，进而利用LC-MS/MS快速准确地检测兽用硫酸庆大霉素中的组胺并对其进行定量，克服了兽用硫酸庆大霉素中组胺提取困难的问题，弥补了现有技术中不能对兽用硫酸庆大霉素中组胺含量进行定量检测空缺，本发明提供的检测方法具有净化操作简单、成本低廉、适应范围广，并且检测结果特异性强、定量准确，其稳定性、特异性、敏感性等获得了欧盟相关部门的认可，其组胺的检测结果与欧盟调查的临床不良反应批次相符，检测结果满足欧盟相关部门的要求，获得欧盟的认可，使相关企业产品顺利出口。
附图说明
图1所示为本发明具体实施方式实施例2的溶液稳定性的测试结果；
图2所示为本发明具体实施方式实施例2的专属性检测的测试结果。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：在进行LC-MS/MS前，对样品的前处理方法行改进，得到一种适合兽用硫酸庆大霉素中组胺提取的方法。
本发明提供了一种兽用硫酸庆大霉素中组胺含量的测定方法，包括以下步骤：
(1)提取：使用盐酸-甲醇溶液或盐酸-乙腈溶液提取稀释后的兽用硫酸庆大霉素样品中的组胺，得提取液；
(2)净化：以C18粉净化步骤(1)所得提取液中的杂质，得上清液；
(3)氮吹：取步骤(2)所得上清液氮吹至净干，得到固态样品；
(4)测定：取步骤(3)所得固态样品加入乙腈甲酸溶液复溶解，过滤后进行LC-MS/MS测定。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明提供的兽用硫酸庆大霉素中组胺含量的测定方法，通过对样品前处理(提取和净化)方法进行改进，通过硫酸庆大霉素和组胺在特定溶剂中不同的溶解度对组胺进行提取，同时限定溶剂的浓度，使硫酸庆大霉素处于半结晶状态，降低结晶状态的硫酸庆大霉素对组胺的吸附作用，而后用吸附剂对组胺进一步进行纯化，得到较高回收率和较高纯度的组胺物质，使得高效液相质谱联用仪可以更好排除基体的干扰，进而可利用LC-MS/MS快速准确地检测兽用硫酸庆大霉素中组胺并对其进行定量，克服了兽用硫酸庆大霉素中组胺提取困难的问题，弥补了现有技术中不能对兽用硫酸庆大霉素中组胺含量进行定量检测空白，本发明提供的检测方法具有净化操作简单、成本低廉、适应范围广的优点，并且检测结果特异性强、定量准确，其稳定性、特异性、敏感性等获得了欧盟相关部门的认可，通过对约1500份样品的检测，其组胺的检测结果与欧盟调查的临床不良反应批次相符，结果满足欧盟相关部门的要求，获欧盟的认可，使产品顺利出口。
进一步的，所述步骤1中的稀释具体为：兽用硫酸庆大霉素样品中加入1％的乙酸溶液和乙腈，超声5min后振荡混匀3min，再加入100g/mL的磷酸酯酶溶液，涡旋1min，于恒温烘箱中37℃培养2h。
进一步的，所述步骤1中的提取具体为：在稀释后的兽用硫酸庆大霉素样品中加入0.2mol/L盐酸-甲醇溶液或0.2mol/L盐酸-乙腈溶液，振荡混匀3min，于冷冻高速离心机中在15000r/min下冷冻离心5min，其中，所述盐酸-甲醇溶液中盐酸和甲醇的体积比为1:9，盐酸-乙腈溶液中盐酸和乙腈的体积比为1:4。
进一步的，所述步骤(2)具体为：向提取液中依次加入C18粉和无水硫酸镁，震荡1min，于5000r/min下离心5min，取上清液；其中，所述C18粉和无水硫酸镁的质量比为1:4。
进一步的，所述步骤(3)的氮吹的温度为45℃。
进一步的，所述步骤(4)中乙腈甲酸溶液为40％乙腈溶液和0.1％甲酸溶液配置而成，其中乙腈溶液和甲酸溶液的体积比为4:6，所述过滤为使用0.22μm的有机滤膜进行过滤。
进一步的，所述步骤(4)中进行LC-MS/MS测定的条件为：
色谱柱：离子交换柱；
柱温：30-35℃；
流动相：A：乙酸铵溶液或乙酸溶液，B：乙腈；
流速：0.3mL/min或0.45mL/min。
实施例1：
兽用硫酸庆大霉素样品的前处理方法的确定：
(一)组胺提取
取2g兽用硫酸庆大霉素，加水定容至20mL，分两管装取，每管各10mL，其中一管中加入组胺标准品100μg，得样本溶液1和样本溶液2。
1乙酸-甲醇提取
将100μL乙酸和10mL甲醇混合得提取液，分别取0.1mL样本溶液1和样本溶液2，分别加入0.9mL提取液，振荡混匀10min，12000r/min离心10min，取上清液，0.22μm有机滤膜过滤，加入1％乙酸溶液二倍稀释，取1mL上机。
2乙酸-乙腈提取
将100μL乙酸和10mL乙腈混合得提取液，分别取0.1mL样本溶液1和样本溶液2，分别加入0.9mL提取液，振荡混匀10min，12000r/min离心10min，取上清液，0.22μm有机滤膜过滤，加入1％乙酸溶液二倍稀释，取1mL上机。
3七氟丁酸+C18柱提取
3.1用1mol/L的盐酸分别调整样品溶液1和样品溶液2的pH值为3.5±0.2，加入2mL的100mmol/L七氟丁酸溶液，涡旋混匀，得混合液；
3.2 C18固相萃取柱用3mL甲醇和3mL的20mmol/L七氟丁酸溶液淋洗后，将3.1所得混合液加载在固相萃取柱上，控制流速约1滴/s，收集淋洗液，再用3mL的20mmol/L的七氟丁酸淋洗，收集淋洗液，抽干5min，用5mL乙腈-七氟丁酸溶液(乙腈-七氟丁酸溶液为体积比为8：2的乙腈和七氟丁酸配置而成)洗脱，收集洗脱液于精密刻度试管中，40℃氮气流挥去部分溶剂，用乙酸定容至1.0mL，涡旋混匀后，上机测定。
4乙酸-乙腈+C18柱提取
4.1将100μL乙酸和10mL乙腈混合得提取液，分别取0.1mL样本溶液1和样本溶液2，分别加入0.8mL提取液和0.2mL水，振荡混匀10min，12000r/min离心10min，取上清液加入2mL的100mmol/L七氟丁酸，得混合液；
4.2 C18固相萃取柱用3mL甲醇和3mL的20mmol/L七氟丁酸溶液淋洗后，将4.1所得混合液加载在固相萃取柱上，控制流速约1滴/s，收集淋洗液，再用3mL的20mmol/L七氟丁酸淋洗三重复，收集淋洗液，抽干5min，用5mL乙腈-七氟丁酸溶液(乙腈-七氟丁酸溶液为体积比为8：2的乙腈和七氟丁酸配置而成)洗脱，收集洗脱液于精密刻度试管中，取1mL洗脱液，上机测定。
5乙酸-甲醇+C18柱提取
5.1将100μL乙酸和10mL甲醇混合得提取液，分别取0.1mL样本溶液1和样本溶液2，分别加入0.9mL提取液和0.1mL水，振荡混匀10min，12000r/min离心10min，取上清液加入2mL的100mmol/L七氟丁酸，得混合液；
5.2 C18固相萃取柱用3.0mL甲醇和3mL的20mmol/L七氟丁酸溶液淋洗后，将5.1所得混合液加载在固相萃取柱上，控制流速约1滴/s，收集淋洗液再用3mL的20mmol/L七氟丁酸淋洗三重复，收集淋洗液，抽干5min；用5mL乙腈-七氟丁酸溶液(乙腈-七氟丁酸溶液为体积比为8：2的乙腈和七氟丁酸配置而成)洗脱，收集洗脱液于精密刻度试管中，取1mL洗脱液，上机测定。
6乙酸-乙腈+C18粉提取
6.1将100μL乙酸和10mL乙腈混合得提取液，分别取0.1mL样本溶液1和样本溶液2，分别加入0.8mL提取液和0.2mL水，振荡混匀10min，12000r/min离心10min，取上清液加入2mL的100mmol/L七氟丁酸，得混合液；
6.2C18粉加入0.5mL甲醇和0.5mL的20mmol/L七氟丁酸溶液，振荡混合10min后，12000r/min离心10min，去除上清液，然后加入1mL 6.1所得混合液，振荡混匀10min，12000r/min离心10min，取1mL上清液上机检测。
7乙酸-甲醇+C18粉提取
7.1将100μL乙酸和10mL甲醇混合得提取液，分别取0.1mL样本溶液1和样本溶液2，分别加入0.9mL提取液和0.1mL水，振荡混匀10min，12000r/min离心10min，取上清液加入2mL的100mmol/L七氟丁酸，得到混合液；
7.2 C18粉加入0.5mL甲醇和0.5mL的20mmol/L七氟丁酸溶液，振荡混合10min后，12000r/min离心10min，去除上清液，然后加入1mL 7.1所得混合液，振荡混匀10min，随后12000r/min离心1 0min，取1mL上清液上机检测。
8、水+C18粉提取
8.1分别取0.1mL样本溶液1和样本溶液2，分别加水稀释到10000倍，得稀释液；
8.2 C18粉加入0.5mL甲醇和0.5mL的20mmol/L七氟丁酸溶液，振荡混合10min后，12000r/min离心10min，去除上清液，然后加入1mL 8.1所得稀释液，振荡混匀10min，12000r/min离心10min，取1mL上清液上机检测。
(二)检测方法的建立
根据组胺提取的实验数据建立检测方法，实验中使用的所有溶液现配现用。测试溶液：精密称取硫酸庆大霉素样品，稀释至100至500倍。
标准工作溶液：用标准样品稀释，建立标准曲线，标准曲线不少于6个点，分别为0mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg。
色谱柱：离子交换柱。
柱温：约30℃-35℃。
流动相：A：乙酸铵或乙酸溶液，B：乙腈。
程序：采用梯度程序(表1)。
表1
Time Event Parameter
0.50 Left valve 1
3.00 Pump b conc. 50
4.00 Left valve 0
4.50 Pump b conc. 50
5.00 Pump b conc. 5
6.00 Stop
检测离子(表2)：
表2
母离子 子离子 能量(CE)
121.1 94.9 21
121.1 82.8 23
流速：0.3mL/min或0.45mL/min。
进样：测试溶液、标准工作溶液各5μl。
鉴别：以定量离子峰面积Y为纵坐标，化合物含量(ng/mL)为横坐标X，绘制标准工作曲线。用该标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中化合物的响应值应均在仪器测定的线性范围内。
回收率要求：70％-130％。
定量限要求：以峰值不低于杂质峰10倍计算。
实施例2：
一种兽用硫酸庆大霉素中组胺含量的测定方法，具体包括以下步骤：
(1)稀释：兽用硫酸庆大霉素样品FG1406171和FG1611323中加入1％的乙酸溶液和乙腈，超声5min后振荡混匀3min，再加入100g/mL的磷酸酯酶溶液，涡旋1min，于恒温烘箱中37℃培养2h，得到稀释后的兽用硫酸庆大霉素样品；
(2)提取：使用盐酸-甲醇溶液或盐酸-乙腈溶液提取稀释后的兽用硫酸庆大霉素样品中的组胺，得提取液；
(2)净化：向提取液中依次加入C18粉和无水硫酸镁，震荡1min，于5 000r/min下离心5min，得上清液；其中，所述C18粉和无水硫酸镁的质量比为1:1:4；
(3)氮吹：取步骤(2)所得上清液45℃氮吹至净干，得到固态样品；
(4)测定：取步骤(3)所得固态样品加入乙腈甲酸溶液复溶解，经0.22μm有机滤膜过滤后进行LC-MS/MS测定，所述乙腈甲酸溶液为40％乙腈溶液和0.1％甲酸溶液配置而成；
LC-MS/MS测定的条件为：
色谱柱：离子交换柱；
柱温：35℃；
流动相：A：乙酸铵溶液，B：乙腈；
流速：0.3mL/min。
1、精密度验证(标准为不超过15％)
将样品FG1406171测试6次(mg/kg)，结果见表3所示。
表3
批号 第1次 第2次 第3次 第4次 第5次 第6次 RSD
FG1406171 7.0 8.1 9.0 7.0 7.3 7.6 10.1％
2、线性验证(标准为相关系数绝对值要求大于0.99，截距绝对值不大于3mg/kg)
在硫酸庆大霉素FG1406171中加入以下组胺增量，配制系列溶液，根据增加浓度与相应增加测出量，作线性曲线并计算相应相关系数，结果见表4所示。
表4
Figure BDA0002254566980000091
3、回收率
将样品FG1406171加入组胺标准品，测定其回收情况，结果见表5所示。
表5
Figure BDA0002254566980000092
4、检测限
按照FG1611323(组胺未检出)加入2.5mg/kg(相当于产品含量组胺)组胺，分别检测3次，结果见表6所示。
表6
加标浓度(mg/kg) 测定值(mg/kg)
2.5 2.95
2.5 3.36
2.5 2.75
平均 3.02
检测限为3mg/kg,量限计算值为3*3.3＝10mg/kg，同时根据精密度检测结果平行测试故将定量限定为10mg/kg。
5、溶液稳定性
在FG1611323(组胺未检出)产品中，分别加入2.5mg/kg(1-3)、5mg/kg(4-6)、10mg/kg(7-9)、20mg/kg(10-12)、40mg/kg(13-15)、100mg/kg(16-18)的组胺，分别进行2次测试，间隔时间为72小时(贮存温度4℃)测试结果见表7和图1所示。
表7
加标浓度(mg/kg) 数据一(mg/kg) 数据二(mg/kg隔72h)
2.5 2.95 2.23
2.5 3.36 2.38
2.5 2.75 2.43
5 4.42 6.65
5 4.1 5.72
5 4.67 6.09
10 9.4 11.2
10 8.73 11.9
10 9.35 10.5
20 17.2 20.3
20 17.1 20
20 18.1 19.5
40 42.7 37.1
40 43.3 37.6
40 43 37.2
100 102 92
100 102 92.3
100 101 93.9
成对T检验P值为0.175，二组数据没有显著性差异，硫酸庆大霉素中组胺在贮存温度4℃环境下，数据基本上没有发生变异。
6、专属性检测
样品FG1611323(组胺未检出)，加入20mg/kg组胺，从质谱图分析，专属性好，谱峰单一，谱峰中信号均专属组胺相关碎片信号，没有其它因素干扰；表示该方法专属性较好，结果见图2所示。
7、耐用性(初始测试与条件改变后测试数值相对偏差应在不超过±20％)
在原有测试条件下，改变柱温，流量测试4个测试样(每个测试样测3次)，其结果如表8所示，其中，单位为mg/kg，条件1的柱温35℃，流速0.3mL/min；条件2的柱温30℃，流速0.45mL/min。
表8
Figure BDA0002254566980000111
从表中分析测试条件微小改变后，测试数据相应相对偏差符合验证要求，方法耐用性良好。
可以看出，通过建立的方法对兽用庆大霉素中的组胺进行检测，结果表明，该方法能满足现有限量(含量不得超过16mg/kg)的需求。
综上所述，本发明提供的兽用硫酸庆大霉素中组胺含量的测定方法，通过对样品前处理(提取和净化)方法进行改进，使用盐酸-甲醇溶液或盐酸-乙腈溶液提取并以C18粉净化，使得高效液相质谱联用仪可以更好排除基体的干扰，进而利用LC-MS/MS快速准确地检测兽用硫酸庆大霉素中组胺并对其进行定量，克服了兽用硫酸庆大霉素中组胺提取困难的问题，弥补了现有技术中不能对兽用硫酸庆大霉素中组胺含量进行定量检测空缺，同时，相比于传统的固相萃取小柱(SPE)净化方式，本发明提供的净化方法操作更为简单、成本更加低廉、适应范围更广。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (6)

1.一种兽用硫酸庆大霉素中组胺含量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取：兽用硫酸庆大霉素样品中加入1%的乙酸溶液和乙腈，超声5 min后振荡混匀3min，再加入100 g/mL的磷酸酯酶溶液，涡旋1 min，于恒温烘箱中37 ℃培养2 h，得到稀释后的兽用硫酸庆大霉素样品；使用盐酸-甲醇溶液或盐酸-乙腈溶液提取稀释后的兽用硫酸庆大霉素样品中的组胺，得提取液；
其中，所述盐酸-甲醇溶液中盐酸和甲醇的体积比为1:9，所述盐酸-乙腈溶液中盐酸和乙腈的体积比为1:4；
（2）净化：以C18净化步骤（1）所得提取液中的杂质，得上清液；
（3）氮吹：取步骤（2）所得上清液氮吹至净干，得到固态样品；
（4）测定：取步骤（3）所得固态样品加入乙腈甲酸溶液复溶解，过滤后进行LC-MS/MS测定。
2.根据权利要求1所述的兽用硫酸庆大霉素中组胺含量的测定方法，其特征在于，所述步骤（1）中的提取具体为：在稀释后的兽用硫酸庆大霉素样品中加入0.2 mol/L的盐酸-甲醇溶液或0.2 mol/L盐酸-乙腈溶液，振荡混匀3 min，于冷冻高速离心机中在15 000 r/min下冷冻离心5 min。
3.根据权利要求1所述的兽用硫酸庆大霉素中组胺含量的测定方法，其特征在于，所述步骤（2）具体为：向提取液中依次加入C18粉和无水硫酸镁，震荡1 min，于5000 r/min下离心5 min，取上清液；其中，所述C18粉和无水硫酸镁的质量比为1:4。
4.根据权利要求1所述的兽用硫酸庆大霉素中组胺含量的测定方法，其特征在于，所述步骤（3）的氮吹的温度为45 ℃。
5.根据权利要求1所述的兽用硫酸庆大霉素中组胺含量的测定方法，其特征在于，所述步骤（4）中乙腈甲酸溶液为40%乙腈溶液和0.1%甲酸溶液配置而成，其中乙腈溶液和甲酸溶液的体积比为4:6，所述过滤为使用0.22 μm的有机滤膜进行过滤。
6.根据权利要求1所述的兽用硫酸庆大霉素中组胺含量的测定方法，其特征在于，所述步骤（4）中进行LC-MS/MS测定的条件为：
色谱柱：离子交换柱；
柱温：30 ℃-35 ℃；
流动相：A：乙酸铵溶液或乙酸溶液，B：乙腈；
流速：0.3 mL/min或0.45 mL/min。
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