CN107543877A - 一种固相萃取‑液相色谱串联质谱法同时测定水体中六类24种抗生素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种固相萃取‑液相色谱串联质谱法同时检测水体中六类24种抗生素的方法。该检测方法为：(1)水样预处理；固相萃取前加入指示回收率内标物；(2)使用固相萃取小柱富集净化目标抗生素；(3)用液相色谱串联质谱仪检测水体中六类24种抗生素含量。本发明可以一次性同时检测出水体中六类24种抗生素的残留情况，检测过程耗时少，检测具有高精密度、高灵敏度、高稳定性、高选择性和检出限低等优点。同时，水样预处理中有机试剂使用量少，环境友好，操作简便，富集倍数高，且重现性好。该方法将指示回收率内标物加在固相萃取前，能够很好地表示前处理过程中目标物质的损失，使最终结果更加真实可靠。

Description

一种固相萃取-液相色谱串联质谱法同时测定水体中六类24 种抗生素的方法

技术领域

本发明属于水环境中微量有机污染物质残留检测技术领域，涉及一种水中微量有机污染物的检测方法，特别涉及一种以固相萃取(SPE)前处理结合液相色谱串联质谱技术(HPLC-MS/MS)，能够高效、同时检测出水体中六类多达24种抗生素的分析检测方法。

技术背景

抗生素因其具有抗菌性能而被大量用于人类、动物的疾病治疗，促进农作物的生长和水产养殖业。全球范围内，每年抗生素使用情况约为200万吨，仅在中国每年就有25万吨。而这些抗生素只有少部分在生物体中，高达80％以上会通过尿液和粪便排泄进入自然环境中。抗生素在动物体内残留后有积累效应，达到一定量时会产生毒害作用，若长期摄入抗生素，药物在体内缓慢蓄积达到一定浓度时可导致急慢性中毒甚至是器官的病变。此外，抗生素可以直接杀死某些环境介质中的微生物或抑制微生物的生长，从而影响微生物群落结构和活性。同时，抗生素由水体进入土壤环境后可被植物吸收富集，通过食物链进入人体。因此，在准确测定水环境中抗生素含量的基础上，采取相应的控制措施已成为重中之重。

目前，有关水体环境中抗生素检测的分析方法已经引起了广泛关注，研究进展如下：中国专利公开号CN101639466A公开了一种针对水环境中磺胺类抗生素的 SPE-HPLC方法；中国专利公开号CN101696964A公开了一种测定水环境中氟喹诺酮的SPE-HPLC-荧光方法；中国专利公开号CN103336080A公开了一种同时检测水中四环素类的HLB-HPLC-MS/MS方法。中国专利公开号CN103344715A公开了一种采用液相色谱串联质谱法定量检测水中青霉素类抗生素的方法。中国专利公开号CN103278587A公开了一种针对水环境中三种头孢类抗生素的HLB-HPLC-MS 方法。中国专利公开号CN102269747A公开了一种一次性测定养殖场动物粪便、土壤、水体等环境样本中四环素类、氯霉素类和磺胺类共6种抗生素含量的方法。

但上述这些方法仍存在一些缺陷，由于实际环境中污染物的种类多、浓度较低，不同抗生素的理化性质和存在形态差异性较大，环境基质较为复杂，准确地测定环境中抗生素含量具有很大的挑战。之前多数研究仅针对几种或某一类抗生素的共检测，但环境中抗生素的种类繁多，人们对饮用水安全标准的要求日益提高，拥有高效、快速、准确富集净化和同步分析水环境中抗生素的技术是必不可少的。固相萃取(SPE)结合液相色谱-质谱法(HPLC-MS/MS)具有应用范围广、分离能力强、灵敏度高和分析速度快等特点，目前已成为有机物预处理和分析的重要方法之一。但现有的固相萃取结合液相色谱-质谱法用于水环境中抗生素的检测时，大多由于预处理不好，或固相萃取前处理条件、液相色谱条件和/或质谱条件选得不好，或多或少存在着检测结果不够准确、不稳定、干扰多、有机试剂消耗大、检测抗生素数量和范围有限等问题。

发明内容

本发明的目的旨在克服现有方法中存在的有机试剂消耗大、耗时久、干扰多以及检测抗生素数量和范围有限等问题，提供一种检测结果准确、稳定，干扰少，有机试剂用量少，检测过程耗时少，能同时测定水环境(饮用水、自来水、地表水、污水处理厂进出水)中六类(磺胺类、四环素类、氟喹诺酮类、大环内酯类、酰胺醇类和青霉素类)24种不同结构抗生素的方法，即一种固相萃取前处理技术结合液质联用测定水体中24种抗生素的方法。它通过对固相萃取前处理、液相色谱条件和质谱条件的优化，最终能够实现快速检测，适用对象广，测定结果准确，稳定，灵敏，干扰少，从而为水体中微量有机物的安全检测提供了一种新型可靠的方法。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种固相萃取-液相色谱串联质谱法同时检测水体中六类24种抗生素的方法，即一种富集净化并同时检测水中磺胺类、四环素类、氟喹诺酮类、大环内酯类、酰胺醇类和青霉素类这六类24种抗生素的方法(24种抗生素分别为磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、环丙沙星盐酸盐、氟罗沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、盐酸土霉素、金霉素盐酸盐、阿莫西林三水合物、青霉素G甲盐、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素、盐酸氯苯胍)，按以下步骤实施：

(1)水样的预处理

采集水样，水样过滤除去悬浮颗粒物，用酸调节pH至3.0-4.0；固相萃取前加入内标物指示回收率；

进一步地，上述步骤(1)中，经玻璃纤维滤纸过滤除去细小颗粒状悬浮物后，用体积浓度为10％的稀硫酸调节水样pH，固相萃取前分别加入10μL，5mg/L的¹³C₁D₃-红霉素、D₅-诺氟沙星、¹³C₆-磺胺甲恶唑这三种内标物指示回收率(内标物用 HPLC级甲醇稀释为5mg/L，加入10uL；对应1L水样时是加50ng/L)；分别选用¹³C₆- 磺胺甲恶唑、¹³C₁D₃-红霉素、D₅-诺氟沙星作为磺胺类、大环内酯类和喹诺酮类抗生素的内标物指示回收率(即：选用¹³C₆-磺胺甲恶唑作为磺胺类抗生素的内标物，选用¹³C₁D₃-红霉素作为大环内酯类抗生素的内标物，选用D₅-诺氟沙星作为喹诺酮类抗生素的内标物)。

其中，水样过滤所用的过滤膜选择Whatman GF/F系列玻璃纤维滤膜，其孔径可为0.45μm、0.47μm。其目的是过滤去除颗粒悬浮物质，防止后续对富集和检测的影响。

其中，残渣量的选取可根据水质情况选择100、500、1000mL，一般纯水或者地表水选择1000mL，污染程度较高的污水选择500或者100mL。

(2)固相萃取(SPE)前处理：富集净化过程

依次用甲醇和等体积的超纯水活化固相萃取小柱，将步骤(1)中处理过的水样过柱(富集)，控制水样流速；富集完成后依次用超纯水和等体积的低浓度甲醇淋洗，并在真空条件下干燥固相萃取小柱；之后，再用甲醇洗脱，甲醇洗脱后用氮气吹干收集的洗脱液(甲醇溶液)，得到残渣；将残渣用一定浓度的甲醇重新溶解，定容，经超声、过滤后转移至进样瓶中，待测；

其中，浓缩富集水样采用的固相萃取小柱简称为Waters公司Oasis HLB小柱，是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂。

其中，活化固相萃取小柱所用等体积甲醇和超纯水的体积，非限定性地可举例5mL、8mL或10mL。但考虑活化时间或有机溶剂用量问题，体积一般不超过10mL。

其中，水样流经固相萃取小柱的流速，非限定性地可举例2mL/min或4mL/min。但为了保证目标物质能充分接触并富集于固相萃取小柱，水样流经速度最好不超过 10mL/min。一般地，过柱时水样流速控制在1-4mL/min；洗脱HLB固相萃取柱的洗脱液流速小于1.0mL/min。

其中，萃取完成后淋洗小柱所用一定比例甲醇的水溶液中甲醇比例，非限定性地可举例3％、5％或10％。其目的是洗去固相萃取小柱上的杂质干扰，但为了防止淋洗时目标物质流失的可能，淋洗所用水溶液中甲醇的体积比例最好不超过10％ (即淋洗所用的低浓度甲醇应为体积浓度小于10％的甲醇-水溶液)。

其中，淋洗过后固相萃取小柱真空干燥的时间为10-20min，非限定性地可举例10min、15min或20min。其目的是除去淋洗剂中的水分，避免其进入洗脱液中。

其中，洗脱所用的甲醇为HPLC级甲醇(即高效液相色谱法级别的甲醇)。洗脱萃取柱所用的甲醇用量为萃取柱体积的2倍。

其中，定容氮吹后残渣的有机溶剂，考虑到目标物中部分抗生素含盐，采用体积浓度为70％的甲醇-水溶液。

用甲醇重新溶解，定容后，超声5-15min，再用针式滤器过滤后转移至棕色进样瓶中，待测。其中，过滤所使用针式滤器的有机相膜，考虑到后期进样时不会造成色谱柱堵塞，选取孔径为0.22μm或以下的PTFE(聚四氟乙烯)针式滤头。

(3)液相色谱串联质谱法测定水环境中24种抗生素的含量

采用内标法，在液相色谱-串联质谱仪上，定量检测水样中24种抗生素的含量 (浓度)。

质谱检测条件优选：锥孔电压范围为10-30V，碰撞能范围为13-40eV。

具体的检测条件可为：

液相色谱分离：色谱柱为C18液相色谱柱2.1mm×50mm×5μm，柱温35℃；流动相A即有机相为乙腈，流动相B即水相为含有0.5％甲酸的超纯水溶液(0.5％是体积浓度)；采取梯度洗脱程序：初始流动相中有机相比例为20％，1.5min前一直保持此比例；到4min时有机相升至95％，并维持此比例2min；后迅速回到初始比例，总的流动相时间为10min；流速为0.25mL/min。

质谱检测：离子源为电喷雾离子化源(ESI+)，源温度为150℃，锥孔电压：30V，毛细管电压为3.5kV，脱溶剂气温度：500℃，脱溶剂气流速为1000L/h，扫描时间： 0.1s，检测方式选择多反应离子检测模式(MRM)。

本发明的有益效果：

本发明的优点如下：

1.本发明采用固相萃取-液相色谱串联质谱法可以同时检测出水体(饮用水、自来水、地表水、污水处理厂进出水)中六类24种抗生素进行检测，检测过程耗时少 (耗时10min)，与传统方法相比具有高精密度、高灵敏度、高稳定性、高选择性和检出限低等优点；

2.本发明的方法选择Waters公司Oasis HLB固相萃取柱对六类24种抗生素进行富集净化，去除了干扰杂质，降低了基质效应，提高了选择性和富集倍数；回收率高而稳定，选择性强，吸附容量大，达到了对目标物有效分离富集的目的。前处理操作过程简单，处理时间短，有机试剂使用量少，环境毒性低，节约了大量人力物力，避免接触化学品时造成的不必要伤害。

3.本发明的方法将内标物质(指示回收率替代物)加在固相萃取前，能够很好地表示前处理过程中目标物质的损失，同时，考虑不同类别的抗生素结构和性质存在很大的差别，前处理过程中会有不同程度的损失，所以，分别选用¹³C₆-磺胺甲恶唑、¹³C₁D₃-红霉素、D₅-诺氟沙星作为磺胺类、大环内酯类和喹诺酮类抗生素的的内标物(即：选用¹³C₆-磺胺甲恶唑作为磺胺类抗生素的内标物，选用¹³C₁D₃-红霉素作为大环内酯类抗生素的内标物，选用D₅-诺氟沙星作为喹诺酮类抗生素的内标物；四环素类、酰胺醇类和青霉素类因没有这一类对应的内标物质，统一选用D5-诺氟沙星作为内标物质)，由于内标物选用得好，使得最终结果更加真实可靠。

附图说明

图1为123μg/L浓度的24种抗生素混合标准品溶液的总离子流图TIC(其中横坐标为保留时间min，纵坐标为信号强度)。

图2为环境水样中的主要残留磺胺类、四环素类、氟喹诺酮类、大环内酯类、酰胺醇类和青霉素类24种抗生素的浓度-峰面积标准曲线(其中横坐标为抗生素浓度，纵坐标为抗生素峰面积与内标峰面积的比值乘以50)。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的方法进行具体详细的说明。

实施例1

本发明一种固相萃取-液相色谱串联质谱法同时检测水体中六类24种抗生素的方法，具体按以下步骤实施：

步骤一、水样的预处理

分别收集饮用水、自来水、地表水、污水处理厂进出水，水样经0.45μm玻璃纤维滤膜过滤除去悬浮物后用量筒准确量取1L。用体积浓度为10％的稀硫酸调节水样pH至3.0-4.0(若采集地表水时为了抑制微生物对抗生素的降解作用，会加入一定量的稀盐酸，此时可省略pH调节步骤)。固相萃取前分别加入10μL，5mg/L的¹³C₁D₃-红霉素、D₅-诺氟沙星、¹³C₆-磺胺甲恶唑这三种内标物指示回收率(三种内标物预先分别用HPLC级甲醇稀释为5mg/L)。

步骤二、固相萃取(SPE)前处理：富集净化过程

使用前将Supelco24管固相萃取装置、Oasis HLB小柱、缓冲装置和真空泵按顺序连接好。依次用5mL甲醇和等体积的超纯水活化固相萃取小柱。预处理后的1 L水样以3mL/min的速度过柱，上样完毕后依次用5mL超纯水和等体积体积浓度为5％的甲醇淋洗萃取柱，再将小柱置于真空状态下干燥10min，最后用10mL的甲醇(HPLC级甲醇)，以1mL/min的流速洗脱目标物至具塞玻璃离心管中，洗脱液在水浴条件下(水浴加热不得超过30℃)，用氮气吹干，得到残渣(残渣)。用体积浓度为70％的甲醇定容至1mL，超声5min后，经0.22μm PTFE针式滤器过滤后转移至棕色进样瓶中，待测。

步骤三、液相色谱串联质谱法测定水环境中24种抗生素的含量

采用内标法，在液相色谱-串联质谱仪上，定量检测水样中24种抗生素的含量 (浓度)。

(一)液相色谱串联质谱法检测方法的建立

(1)液相色谱条件的优化

为了实现色谱峰分离、峰型完好、提高信号强度，本发明对流动相、流速、进样量及洗脱梯度程序等影响液相色谱分离的关键因素分别做了优化。本发明经优化后采用的液相色谱检测条件见表1。

表1.HPLC-MS/MS检测条件

(2)质谱条件的优化

液相色谱串联质谱仪可根据离子碎片准确定量，因而需要优化锥孔电压和碰撞能，以获得最佳的母离子-子离子对，使其在实际水样的检测中更加精准。表2中列出了24种抗生素的离子对分布、保留时间、电压、碰撞能以及选取的内标物质(其中，锥孔电压范围为10-30V，碰撞能范围为13-40eV)。

本发明经优化后选用的质谱检测条件如下：离子源为电喷雾离子化源(ESI+)，源温度为150℃，锥孔电压：30V，毛细管电压为3.5kV，脱溶剂气温度：500℃，脱溶剂气流速为1000L/h，扫描时间：0.1s，扫描方式：多反应离子检测(MRM)。

表2.六类24种抗生素的特征离子分布

其中，#表示为定量离子，根据信号响应强度最大的特征碎片离子作为定量离子。

(3)定量方法

本发明采用内标法定量，考虑不同类别的抗生素结构和性质存在很大的差别，前处理过程中会有不同的程度的损失，所以，分别选用¹³C₆-磺胺甲恶唑、¹³C₁D₃-红霉素、D₅-诺氟沙星作为磺胺类、大环内酯类和喹诺酮类抗生素的内标物指示回收率 (即：选用¹³C₆-磺胺甲恶唑作为磺胺类抗生素的内标物，选用¹³C₁D₃-红霉素作为大环内酯类抗生素的内标物，选用D₅-诺氟沙星作为喹诺酮类抗生素的内标物；四环素类、酰胺醇类和青霉素类因没有这一类对应的内标物质，统一选用D5-诺氟沙星作为内标物质)。考虑内标物质本身性质比较稳定，在正电喷雾电离源(ESI+)模式下响应良好且无明显基质干扰。24种抗生素混合标准溶液及内标溶液的总离子流图见图2。总离子流图即总离子流随时间变化的图谱，亦称为总离子流色谱图(TIC)。在图2的总离子流图TIC中，纵坐标表示收集存储离子的电流总强度，横坐标表示离子的生成时间(min)。

(二)灵敏度与线性范围

用体积浓度为70％的色谱级甲醇-水溶解混合标准溶液，并稀释成不同系列的浓度(0.002-1110μg/L)，按上述色谱条件进行测定。以浓度为横坐标，响应值( 50为SPE浓缩后内标物质在待测水样中的理论浓度，单位μg/L)为纵坐标进行回归，得到浓度-峰面积标准曲线。

各待测物的标准曲线范围、相关系数、检测限等结果见表3。以3倍信噪比为方法的检测限，本发明的方法对24种抗生素的检出限在0.68-8.52ng/L之间，灵敏度高，线性相关系数大部分在0.99以上，相对标准偏差RSD％小于5％，说明线性关系良好，能够满足对水源水中痕量抗生素的检测要求。

表3.灵敏度与线性范围结果

(三)回收率计算

采用步骤一的前处理方法和上述检测方法，分别对纯水和地表水水样进行加标回收率计算(加标终浓度：0，10，100μg/L，n＝3)，计算结果见表4和表5。

回收率(RE％)的计算公式为：

其中，RE：回收率，％；

C₀：混合标准液的浓度，ng/mL；

C₁：未加入混合标准液的水样的检测浓度，ng/mL；

C₂：加入混合标准溶液的水样的检测浓度，ng/mL；

V₀：混合标准液的体积，mL；

V₁：未加入混合标准液的水样上机前定容体积，mL；

V₂：加入混合标准溶液的水样上机前定容体积，mL。

由此可见，本发明方法对24种目标物质的回收率在71-120％之间，相对标准偏差均低于5％，回收率存在差异，说明存在基质干扰，通过添加内标物质计算回收率，并用其对检测结果进行校正，可以在一定程度上降低基质干扰带来的影响。

表4.纯水水样不同加标浓度回收率

表5.地表水水样不同加标浓度回收率

实施例2-3 24种抗生素在两种不同实际水体中的浓度的测定

实施例2和实施例3分别以地表水、畜禽养殖场污水为例，先采用步骤一的方法进行预处理，再采用步骤二的方法进行固相萃取富集净化前处理，之后采用步骤三所建立的检测方法进行检测分析，以考察本发明步骤三所建立的检测方法的适用性。

实施例2和实施例3所述的本发明一种固相萃取-液相色谱串联质谱法同时检测水体中六类24种抗生素的方法，具体按以下步骤实施：

步骤一、水样的预处理

分别收集地表水、畜禽养殖场污水水样经0.47μm的玻璃纤维滤膜过滤除去悬浮物后，用量筒准确量取1L。用体积浓度为10％的稀硫酸调节水样pH至3.0-4.0(若采集地表水时为了抑制微生物对抗生素的降解作用，会加入一定量的稀盐酸，此时可省略pH调节步骤)。固相萃取前分别加入10μL，5mg/L内标物¹³C₁D₃-红霉素、 D₅-诺氟沙星、¹³C₆-磺胺甲恶唑指示回收率。

步骤二、固相萃取(SPE)前处理：富集净化过程

使用前将Supelco24管固相萃取装置、Oasis HLB小柱、缓冲装置和真空泵按顺序连接好。依次用5mL甲醇和等体积的超纯水活化固相萃取小柱。预处理后的1L 水样以4mL/min的速度过柱，上样完毕后依次用5mL超纯水和等体积体积浓度为 5％的甲醇淋洗萃取柱，再将小柱置于真空状态下干燥15min，最后用10mL的甲醇，以1mL/min的流速洗脱目标物至具塞玻璃离心管中，洗脱液在水浴条件下(水浴加热不得超过30℃)，用氮气吹干，得残渣。用体积浓度为70％的甲醇定容至1mL，超声5min后，经0.22μm PTFE针式滤器过滤后转移至棕色进样瓶中，待测。

步骤三、液相色谱串联质谱法测定水环境中六类24种抗生素的含量

采用TQ-Smicro型液相色谱-串联质谱仪定量检测水样中24种抗生素的浓度。

(一)对液相色谱、质谱检测条件的优化

本发明经优化后采用的液相色谱(HPLC)检测条件见表1。

本发明经优化后选用的质谱(MS)检测条件如下：离子源为电喷雾离子化源 (ESI+)，源温度为150℃，锥孔电压：30V，毛细管电压为3.5kV，脱溶剂气温度：500℃，脱溶剂气流速为1000L/h，扫描时间：0.1s，扫描方式：多反应离子检测 (MRM)。

(二)采用内标法，在液相色谱-串联质谱仪上，分别定量检测地表水、畜禽养殖场污水这两种水样中24种抗生素的含量(浓度)。检测结果见表6。

表6.两种环境水样中24种抗生素的测定结果(ng/L)

上面的结果验证了本发明的检测方法可以同时检测出水体中六类24种抗生素，检测过程耗时少，精确度、灵敏度高，检出限低，相对标准偏差小，可以同时检测出环境水体中多种抗生素的残留情况。

Claims (10)

1.一种固相萃取-液相色谱串联质谱法同时检测水体中六类24种抗生素的方法，其特征在于，按以下步骤进行：

(1)水样的预处理

水样过滤除去悬浮颗粒物，加酸调节水样pH至3.0-4.0，固相萃取前加入内标物指示回收率；

(2)固相萃取前处理，即富集净化过程

依次用甲醇和等体积的超纯水活化固相萃取小柱，将步骤(1)中处理过的水样过柱即富集，控制水样流速；富集完成后依次用超纯水和等体积的低浓度甲醇淋洗，并在真空下干燥固相萃取小柱；之后，再用甲醇洗脱，甲醇洗脱后用氮气吹干收集的洗脱液，得到残渣；将残渣用一定浓度的甲醇重新溶解，定容，经超声、过滤后转移至进样瓶中，待测；

(3)液相色谱串联质谱法测定水环境中六类24种抗生素的含量

采用内标法，在液相色谱-串联质谱仪上，定量检测水样中六类24种抗生素的含量；所述的六类24种抗生素是指磺胺类、四环素类、氟喹诺酮类、大环内酯类、酰胺醇类和青霉素类这六类的24种抗生素；24种抗生素分别为磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、环丙沙星盐酸盐、氟罗沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、盐酸土霉素、金霉素盐酸盐、阿莫西林三水合物、青霉素G甲盐、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素、盐酸氯苯胍。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，固相萃取前分别加入50ng/L的¹³C₁D₃-红霉素、D₅-诺氟沙星、¹³C₆-磺胺甲恶唑这三种内标物指示回收率。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述三种内标物分别用HPLC级甲醇稀释为5mg/L；固相萃取前分别加入10μL，5mg/L的¹³C₁D₃-红霉素、D₅-诺氟沙星、¹³C₆-磺胺甲恶唑这三种内标物。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，水样过滤所用的过滤膜是孔径为0.45μm或0.47μm的Whatman GF/F系列玻璃纤维滤膜；加酸调节水样pH，是指加入体积浓度为10％的稀硫酸调节水样pH。

5.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的固相萃取小柱为Waters公司Oasis HLB小柱，是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂；步骤(2)中，过柱时水样流速控制在1-4mL/min；洗脱HLB固相萃取柱的洗脱液流速小于1.0mL/min。

6.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，淋洗所用的低浓度甲醇为体积浓度小于10％的甲醇-水溶液；洗脱所用的甲醇为HPLC级甲醇；定容残渣所用的甲醇是体积浓度为70％的甲醇-水溶液；用甲醇定容后，超声5-15min，再用针式滤器过滤；针式滤器选用孔径小于0.22μm的聚四氟乙烯针式滤头。

7.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，采用Waters Xevo TQ-Smicro型液相色谱-串联质谱仪定量检测水样中抗生素的浓度。

8.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，液相色谱的检测条件为：色谱柱为C18液相色谱柱2.1mm×50mm×5μm，柱温35℃；采取梯度洗脱程序：流动相A即有机相为乙腈，流动相B即水相为含有0.5％甲酸的超纯水溶液；初始流动相中有机相比例为20％，1.5min前一直保持此比例；到4min时有机相升至95％，并维持此比例2min；后迅速回到初始比例，总的流动相时间即洗脱总时间为10min，进样体积为5μL；流速为0.25mL/min。

9.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，质谱的检测条件为：离子源为电喷雾离子化源ESI+；扫描方式：多反应离子检测MRM；锥孔电压范围为10-30V，碰撞能范围为13-40eV。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，质谱的检测条件为：源温度为150℃，锥孔电压：30V，毛细管电压为3.5kV，脱溶剂气温度：500℃，脱溶剂气流速为1000L/h，扫描时间：0.1s。