CN110243953A - 一种用于水样中多种抗生素的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于水样中多种抗生素的检测方法，该方法的检测步骤包括：水样经抽滤后取适量，加入Na2EDTA并调节pH值，选用HLB小柱进行固相萃取，甲醇洗脱，洗脱液氮吹后复溶，采用高效液相色谱串联质谱法进样分析。本发明首次建立了同时对该多种抗生素定性及定量的检测方法，该方法的灵敏度高，检测结果准确，能满足地表水样中若干种目标抗生素在宽浓度范围内的准确定量测定，具有良好的实用性。

Description

一种用于水样中多种抗生素的检测方法
技术领域
本发明属于化合物检测技术领域，尤其涉及是一种抗生素的检测方法，该方法采用前处理、固相萃取及液质联用检测方法能实现水样中痕量抗生素的富集、准确定性及定量检测。
背景技术
抗生素也称为抗菌素，在低微浓度下能有选择地抑制或影响它种生物功能，主要用于治疗各种细菌感染或抑制致病微生物感染，其用量大，应用范围广。90％以上的抗生素用于医疗及农业，不可避免地给自然环境带来巨大压力：人类和动物使用的抗生素约80％会以原药、代谢产物等形式排出体外，由于污水截流不彻底等原因，其通过生活污水排放、养殖废水排放、农业粪肥灌溉径流等不同途径进入环境水体，残留的抗生素进入环境水体后，会给环境水体中的微生物带来巨大的选择性压力，对生态系统中各类生物产生危害，还可能在环境和生物体中累积或者通过食物链富集，诱发和传播各类抗生素耐药菌及抗生素抗性基因，严重威胁人类健康。
近年来，在国外的不同环境水体中均检测到抗生素残留，国内的抗生素污染情况也不乐观，多地地表水中检出抗生素：如在长三角地区城市生活污水，养猪场和甲鱼养殖场废水等样品中分别检出了磺胺类、四环素类、氯霉素类等多种抗生素污染；我国北方典型市政污水存在四环素类抗生素污染，环渤海地区检出14种磺胺类抗生素；我国的海河、长江入海口、黄浦江、珠江、辽河等河流的部分点位中均检出抗生素，部分地表水取样检测抗生素含量惊人，其中珠江广州段的污染尤为严重。但目前，我国关于抗生素污染监管力度较为薄弱，尚未开展水环境中抗生素污染状况的系统调查工作，尚无水中抗生素检测的法定标准。
因此，亟需一种应用于抗生素的污染情况的系统调查的检测方法，为抗生素检测标准方法的制定研究提供参考，来解决上述问题。
在发明专利申请号为CN201310247043.5的专利申请中，公开了一种水中痕量四环素类抗生素的检测方法，其步骤包括：水样过滤除去悬浮物，调节水样pH为2-4；依次利用丙酮、甲醇、含乙酸铵的甲酸水溶液、超纯水活化HLB固相萃取柱，取步骤1中的水样过柱，将HLB固相萃取柱在氮气保护下干燥，再用洗脱液洗脱HLB固相萃取柱，收集洗脱液在氮气流下吹干，加入乙腈溶解残留物；定量检测痕量四环素类抗生素的浓度。但是，上述发明专利公开的水中痕量四环素类抗生素的检测方法，只能检测固定范围的四环素类抗生素，无法解决复杂性水质中多种抗生素检测。
发明内容
为解决上述问题，本发明的首要目的在于针对水样中微量乃至痕量的抗生素污染物，提供一种用于水样中多种抗生素的检测方法，其检测结果专属、灵敏、准确，可用于地表水中18种抗生素的定性及定量检测分析。
发明的另一个目的在于提供一种用于水样中多种抗生素的检测方法，该方法可应用于抗生素的污染情况的系统调查，为抗生素检测标准方法的制定研究提供参考。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种用于水样中多种抗生素的检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
101、水样的前处理：使用微孔滤膜对水样进行过滤，取过滤后水样，向过滤后水样中加入Na2EDTA并使其溶解，再用稀酸调节pH值至2.5-3.5，得到前处理水样；
102、水样中抗生素的富集：将前处理的水样经自动固相萃取仪进行萃取，并选用经活化的HLB小柱进行痕量抗生素富集，后以甲醇洗脱，收集洗脱液，氮吹至干后复溶，滤过，作为待测液；
103、水样的检测：采用高效液相色谱串联质谱法，流动相梯度洗脱，待测液进样分析。
本发明的作用原理是：待测水样经加入重金属络合剂Na2EDTA及调节pH值等前处理令所含的抗生素保持稳定，再使用固相萃取法选用HLB小柱对目标抗生素进行富集，后用甲醇洗脱，浓缩定容，使各种抗生素得以稳定地被收集，避免其它因素的干扰；再采用高效液相色谱串联质谱法进行检测，以质量色谱峰的保留时间及特征离子对定性，以峰面积按标准曲线法定量计算水样中各目标抗生素的含量，能够清楚、准确地检测各种抗生素的含量。
具体地说，该用于水样中多种抗生素的检测方法，适用于头孢拉定、头孢克肟、头孢丙烯、头孢羟氨苄、头孢孟多酯、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、甲硝唑、替硝唑、氟康唑、酮康唑、克霉唑、诺氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、氟罗沙星、舒巴坦及氯霉素的测定，其具体步骤包括：
101、水样的前处理：使用微孔滤膜对水样进行过滤，取过滤后水样1000ml，加入0.5gNa2EDTA，超声振荡使溶解，再用稀酸调节pH值至3.0；
102、水样中抗生素的富集：前处理后的水样经自动固相萃取仪，并选用经活化的HLB小柱进行痕量抗生素富集，后以甲醇洗脱，收集洗脱液，氮吹至干后复溶滤过，作为待测液；
103、定量检测水样中抗生素的浓度，以抗生素目标物保留时间及特征离子对(m/z)进行定性，以峰面积按标准曲线法进行定量。
进一步的，水样的前处理中，所述的微孔滤膜材质为聚醚砜，内径为25mm，孔径为0.22μm或0.45μm。
更进一步，用于调节pH值的稀酸为质量体积浓度为7％～13％的盐酸水溶液、磷酸水溶液或硫酸水溶液，优选为10％盐酸水溶液；pH调节终点接受范围为3.0±0.1。
进一步的，水样中抗生素的富集中，所述HLB小柱规格为6cc/200mg或6cc/500mg，优选为6cc/500mg。
更进一步的，HLB小柱依次用10ml甲醇、5ml超纯水和5ml0.1％甲酸水溶液进行活化。HLB小柱以5～8ml/min的速度上样，优选为6ml/min，并以10～16ml超纯水淋洗，优选为12ml，最后用10ml甲醇以1ml/min速度洗脱；洗脱液在30～40℃水浴条件下氮气吹干，优选为35℃，再加1ml乙腈-水(10:90，含0.1％甲酸)溶解，并过0.22μm尼龙材质的微孔滤膜。
进一步的，水样检测中，所述的高效液相色谱串联质谱法液相色谱条件包括使用C18色谱柱(100mm×2.0mm×3μm)，进样体积为10μl，柱温为35℃，流速为0.2ml/min，流动相为乙腈和0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱程序如表1所示：
表1梯度洗脱程序
进一步的，所述的高效液相色谱串联质谱法质谱参数包括：喷雾管雾化气(Gas1)、辅助加热气(Gas2)流速均为50psi、气帘气(Curtain Gas)为25psi、辅助加热温度为550℃、电离电压(IS)分别为+5500V(正离子)及-4500V(负离子)，各化合物参数如表2所示：
表2各化合物质谱参数
进一步的，质谱扫描中包含正负离子两种模式，两者交替切换进行扫描。
进一步的，结果判断中，如样品中质量色谱峰的保留时间与目标抗生素对照品一致(±2.5％)，样品中特征离子对与对照品一致，且其相对丰度与对照品一致(偏差符合表3规定)，则可判断样品中存在该抗生素，若无，则表明样品不含该抗生素。
表3定性离子相对丰度的最大允许偏差
相对离子丰度 >50％ >20％至50％ >10％至20％ ≤10％
允许的相对偏差 ±20％ ±25％ ±30％ ±50％
进一步的，如检出抗生素，用标准曲线法分别计算样品中各抗生素的质量浓度，计算方法为：
式中：
ρi——水样中抗生素组分的含量，ng/l；
mi——标准曲线法计算水样中抗生素组分的质量浓度，ng/ml；
V——最终定容体积，ml；
Vs——水样取样体积，l。
本发明的有益效果是：
与现有技术相比，本发明检测的多种目标抗生素分属于β-内酰胺类、磺胺类、硝咪唑类、抗真菌类、喹诺酮类及氯霉素类等6个不同类别抗生素，它们结构及性质各有不同，本发明首次建立了同时对该18种抗生素定性及定量的检测方法；由于待测水样中干扰物质多，目标抗生素含量极低，本发明通过优化水样前处理及固相萃取富集条件，能够有效地排除了干扰成分，富集了目标抗生素，从而使得后续的检测灵敏度高，检测结果准确。
实践证明，本发明检测方法的线性范围可覆盖三个数量级，能满足地表水样中18种目标抗生素在宽浓度范围内的准确定量测定，具有良好的实用性。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及有益效果更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所实现的用于水样中多种抗生素的检测方法，适用于头孢拉定、头孢克肟、头孢丙烯、头孢羟氨苄、头孢孟多酯、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、甲硝唑、替硝唑、氟康唑、酮康唑、克霉唑、诺氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、氟罗沙星、舒巴坦及氯霉素的测定，其主要步骤包括有：
101、水样的前处理：使用微孔滤膜对水样进行过滤，取过滤后水样1000ml，加入0.5gNa2EDTA，超声振荡使溶解，再用稀酸调节pH值至3.0；
102、水样中抗生素的富集：前处理后的水样经自动固相萃取仪，并选用经活化的HLB小柱进行痕量抗生素富集，后以甲醇洗脱，收集洗脱液，氮吹至干后复溶滤过，作为待测液；
103、定量检测水样中抗生素的浓度：以抗生素目标物保留时间及特征离子对(m/z)进行定性，以峰面积按标准曲线法进行定量。
其中，103步骤中，采用高效液相色谱串联质谱法，流动相梯度洗脱，待测液进样分析。水样检测中液相色谱条件包括使用C18色谱柱(100mm×2.0mm×3μm)，进样体积为10μl，柱温为35℃，流速为0.2ml/min，流动相为乙腈和0.1％甲酸水溶液。质谱参数包括：喷雾管雾化气(Gas1)、辅助加热气(Gas2)流速均为50psi、气帘气(Curtain Gas)为25psi、辅助加热温度为550℃、电离电压(IS)分别为+5500V(正离子)及-4500V(负离子)，各抗生素参数如下表4：
表4各抗生素质谱参数
质谱扫描中包含正负离子两种模式，两者交替切换进行扫描，其中负离子模式检测舒巴坦及氯霉素，其余16种抗生素均为正离子模式检测。
具体实施方式如下：
实施例一。
以某水源水样A为例，利用本发明方法进行头孢拉定、头孢克肟、头孢丙烯、头孢羟氨苄、头孢孟多酯、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、甲硝唑、替硝唑、氟康唑、酮康唑、克霉唑、诺氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、氟罗沙星、舒巴坦及氯霉素这18种抗生素的定性及定量测定，使用睿科Fotector Plus自动固相萃取仪进行固相萃取，AB 3200 QTRAP液质联用仪检测，步骤如下：
水样的前处理：使用材质为聚醚砜的微孔滤膜(内径为25mm，孔径为0.45μm)对水样进行过滤，取过滤后水样1000ml置玻璃瓶(玻璃瓶须经重铬酸钾浸泡12小时以上，并经超纯水冲洗后烘干)中，准确加入0.5gNa2EDTA，超声振荡约5分钟使其溶解，再用10％盐酸水溶液调节水样pH值至2.5。
水样中抗生素的富集：使用睿科Fotector Plus自动固相萃取仪进行固相萃取操作。其中，HLB固相萃取小柱规格为6cc/500mg，HLB小柱上样前依次用10ml甲醇、5ml超纯水和5ml0.1％甲酸水溶液进行活化，再以6ml/min的速度上样，并以12ml超纯水淋洗，最后用10ml甲醇以1ml/min速度洗脱，步骤见下表5。
表5固相萃取富集条件
洗脱液在35℃水浴条件下氮气吹干，耗时约50分钟，再加1ml乙腈-水(10:90，含0.1％甲酸)溶解，并用尼龙材质的微孔滤膜(0.22μm)滤过。
水样的检测：
如上文所述，采用高效液相色谱串联质谱法，流动相梯度洗脱，待测液进样分析；以头孢拉定、头孢克肟、头孢丙烯、头孢羟氨苄、头孢孟多酯、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、甲硝唑、替硝唑、氟康唑、酮康唑、克霉唑、诺氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、氟罗沙星、舒巴坦及氯霉素等18种抗生素目标物保留时间及特征离子对(m/z)进行定性，以峰面积按标准曲线法进行定量。
水样检测中液相色谱条件包括使用C18色谱柱(100mm×2.0mm×3μm)，进样体积为10μl，柱温为35℃，流速为0.2ml/min，流动相为乙腈和0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱程序如下表6：
表6梯度洗脱程序
结果判断：样品中质量色谱峰的保留时间与目标抗生素对照品一致(±2.5％)，其特征离子对与对照品一致，且相对丰度与对照品一致(参加上文的对照标准)，则可判断样品中存在该抗生素，若无，则表明样品不含该抗生素。
如检出抗生素，以峰面积计，用标准曲线法分别计算样品中各抗生素的质量浓度。
本实施例中，样品及各浓度对照品溶液测定之间加空白样品测定，以确认仪器是否出现残留。本实施例中，分别对样品及空白(超纯水)进行加标回收考察(加标水平为200ng)，结果如表7，显示回收率保持稳定，方法的准确度可行。
表7 18种抗生素的平均加标回收率(n＝6)
本实施例中，水源水样A中检出头孢拉定、磺胺甲恶唑、甲硝唑、氟康唑、酮康唑、诺氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、舒巴坦及氯霉素十种抗生素，标准曲线法计算其质量浓度分别为8.65ng/l、1.39ng/l、2.41ng/l、11.5ng/l、1.92ng/l、4.19ng/l、3.24ng/l、3.55ng/l、1.98ng/l及1.20ng/l。
实施例二。
以某水源水样B为例，利用本发明方法进行头孢拉定、头孢克肟、头孢丙烯、头孢羟氨苄、头孢孟多酯、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、甲硝唑、替硝唑、氟康唑、酮康唑、克霉唑、诺氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、氟罗沙星、舒巴坦及氯霉素这18种抗生素的定性及定量测定，使用睿科Fotector Plus自动固相萃取仪进行固相萃取，AB 3200 QTRAP液质联用仪检测，步骤如下：
水样的前处理：使用材质为聚醚砜的微孔滤膜(内径为25mm，孔径为0.22μm)对水样进行过滤，取过滤后水样1000ml置玻璃瓶(玻璃瓶须经重铬酸钾浸泡12小时以上，并经超纯水冲洗后烘干)中，准确加入0.5gNa2EDTA，超声振荡约5分钟使其溶解，再用10％盐酸水溶液调节水样pH值至3.0。
水样中抗生素的富集：
使用睿科Fotector Plus自动固相萃取仪进行固相萃取操作。其中，HLB固相萃取小柱规格为6cc/200mg，HLB小柱上样前依次用10ml甲醇、5ml超纯水和5ml0.1％甲酸水溶液进行活化，再以5ml/min的速度上样，并以10ml超纯水淋洗，最后用10ml甲醇以1ml/min速度洗脱。
洗脱液在30℃水浴条件下氮气吹干，耗时约50分钟，再加1ml乙腈-水(10:90，含0.1％甲酸)溶解，并用尼龙材质的微孔滤膜(0.22μm)滤过。
水样的检测：
如上文所述，采用高效液相色谱串联质谱法，流动相梯度洗脱，待测液进样分析；以头孢拉定、头孢克肟、头孢丙烯、头孢羟氨苄、头孢孟多酯、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、甲硝唑、替硝唑、氟康唑、酮康唑、克霉唑、诺氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、氟罗沙星、舒巴坦及氯霉素等18种抗生素目标物保留时间及特征离子对(m/z)进行定性，以峰面积按标准曲线法进行定量。
水样检测中液相色谱条件包括使用C18色谱柱(100mm×2.0mm×3μm)，进样体积为10μl，柱温为35℃，流速为0.2ml/min，流动相为乙腈和0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱程序按照实施例一的方式进行。
结果判断：样品中质量色谱峰的保留时间与目标抗生素对照品一致，其特征离子对与对照品一致，且相对丰度与对照品一致(参加上文的对照标准)，则可判断样品中存在该抗生素，若无，则表明样品不含该抗生素。
如检出抗生素，以峰面积计，用标准曲线法分别计算样品中各抗生素的质量浓度。
本实施例中，样品及各浓度对照品溶液测定之间加空白样品测定，以确认仪器是否出现残留，并对空白(超纯水)进行加标回收考察(加标水平为200ng)，结果如表7所示。
本实施例中，水源水样B中检出头孢拉定、头孢丙烯、头孢羟氨苄、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶及氟康唑六种抗生素，标准曲线法计算其质量浓度分别为6.76ng/l、1.58ng/l、2.14ng/l、1.43ng/l、3.09ng/l及6.38ng/l。
实施例三。
以某水源水样C为例，利用本发明方法进行头孢拉定、头孢克肟、头孢丙烯、头孢羟氨苄、头孢孟多酯、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、甲硝唑、替硝唑、氟康唑、酮康唑、克霉唑、诺氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、氟罗沙星、舒巴坦及氯霉素这18种抗生素的定性及定量测定，使用睿科Fotector Plus自动固相萃取仪进行固相萃取，AB 3200 QTRAP液质联用仪检测，步骤如下：
水样的前处理：使用材质为聚醚砜的微孔滤膜(内径为25mm，孔径为0.22μm)对水样进行过滤，取过滤后水样1000ml置玻璃瓶(玻璃瓶须经重铬酸钾浸泡12小时以上，并经超纯水冲洗后烘干)中，准确加入0.5gNa2EDTA，超声振荡约5分钟使其溶解，再用10％盐酸水溶液调节水样pH值至3.0。
水样中抗生素的富集：
使用睿科Fotector Plus自动固相萃取仪进行固相萃取操作。其中，HLB固相萃取小柱规格为6cc/500mg，HLB小柱上样前依次用10ml甲醇、5ml超纯水和5ml0.1％甲酸水溶液进行活化，再以8ml/min的速度上样，并以16ml超纯水淋洗，最后用10ml甲醇以1ml/min速度洗脱。
洗脱液在40℃水浴条件下氮气吹干，耗时约40分钟，再加1ml乙腈-水(10:90，含0.1％甲酸)溶解，并用尼龙材质的微孔滤膜(0.22μm)滤过。
水样的检测：
如上文所述，采用高效液相色谱串联质谱法，流动相梯度洗脱，待测液进样分析；以头孢拉定、头孢克肟、头孢丙烯、头孢羟氨苄、头孢孟多酯、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、甲硝唑、替硝唑、氟康唑、酮康唑、克霉唑、诺氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、氟罗沙星、舒巴坦及氯霉素等18种抗生素目标物保留时间及特征离子对(m/z)进行定性，以峰面积按标准曲线法进行定量。
水样检测中液相色谱条件包括使用C18色谱柱(100mm×2.0mm×3μm)，进样体积为10μl，柱温为35℃，流速为0.2ml/min，流动相为乙腈和0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱程序按照实施例一的方式进行。
结果判断：样品中质量色谱峰的保留时间与目标抗生素对照品一致，其特征离子对与对照品一致，且相对丰度与对照品一致(参加上文的对照标准)，则可判断样品中存在该抗生素，若无，则表明样品不含该抗生素。
如检出抗生素，以峰面积计，用标准曲线法分别计算样品中各抗生素的质量浓度。
本实施例中，样品及各浓度对照品溶液测定之间加空白样品测定，以确认仪器是否出现残留，并对空白(超纯水)进行加标回收考察(加标水平为200ng)，结果如表7所示。
本实施例中，水源水样C中检出甲硝唑、氟康唑、诺氟沙星及氟罗沙星四种抗生素，标准曲线法计算其质量浓度分别为2.11ng/l、7.63ng/l、5.96ng/l、2.52ng/l。
实施例四。
以某水源水样D为例，利用本发明方法进行头孢拉定、头孢克肟、头孢丙烯、头孢羟氨苄、头孢孟多酯、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、甲硝唑、替硝唑、氟康唑、酮康唑、克霉唑、诺氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、氟罗沙星、舒巴坦及氯霉素这18种抗生素的定性及定量测定，使用睿科Fotector Plus自动固相萃取仪进行固相萃取，AB 3200 QTRAP液质联用仪检测，步骤如下：
水样的前处理：使用材质为聚醚砜的微孔滤膜(内径为25mm，孔径为0.22μm)对水样进行过滤，取过滤后水样1000ml置玻璃瓶(玻璃瓶须经重铬酸钾浸泡12小时以上，并经超纯水冲洗后烘干)中，准确加入0.5gNa2EDTA，超声振荡约5分钟使其溶解，再用10％盐酸水溶液调节水样pH值至3.0。
水样中抗生素的富集：
使用睿科Fotector Plus自动固相萃取仪进行固相萃取操作。其中，HLB固相萃取小柱规格为6cc/500mg，HLB小柱上样前依次用10ml甲醇、5ml超纯水和5ml0.1％甲酸水溶液进行活化，再以7ml/min的速度上样，并以14ml超纯水淋洗，最后用10ml甲醇以1ml/min速度洗脱。
洗脱液在37℃水浴条件下氮气吹干，耗时约45分钟，再加1ml乙腈-水(10:90，含0.1％甲酸)溶解，并用尼龙材质的微孔滤膜(0.22μm)滤过。
水样的检测：
如上文所述，采用高效液相色谱串联质谱法，流动相梯度洗脱，待测液进样分析；以头孢拉定、头孢克肟、头孢丙烯、头孢羟氨苄、头孢孟多酯、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、甲硝唑、替硝唑、氟康唑、酮康唑、克霉唑、诺氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、氟罗沙星、舒巴坦及氯霉素等18种抗生素目标物保留时间及特征离子对(m/z)进行定性，以峰面积按标准曲线法进行定量。
水样检测中液相色谱条件包括使用C18色谱柱(100mm×2.0mm×3μm)，进样体积为10μl，柱温为35℃，流速为0.2ml/min，流动相为乙腈和0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱程序按照实施例一的方式进行。
结果判断：样品中质量色谱峰的保留时间与目标抗生素对照品一致，其特征离子对与对照品一致，且相对丰度与对照品一致(参加上文的对照标准)，则可判断样品中存在该抗生素，若无，则表明样品不含该抗生素。
如检出抗生素，以峰面积计，用标准曲线法分别计算样品中各抗生素的质量浓度。
本实施例中，样品及各浓度对照品溶液测定之间加空白样品测定，以确认仪器是否出现残留，并对空白(超纯水)进行加标回收考察(加标水平为200ng)，结果如表7所示。
本实施例中，水源水样D中检出甲硝唑、替硝唑、氟康唑及克霉唑四种抗生素，标准曲线法计算其质量浓度分别为6.87ng/l、3.84ng/l、8.44ng/l及2.11ng/l。
实施例五。
以某水源水样E为例，利用本发明方法进行头孢拉定、头孢克肟、头孢丙烯、头孢羟氨苄、头孢孟多酯、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、甲硝唑、替硝唑、氟康唑、酮康唑、克霉唑、诺氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、氟罗沙星、舒巴坦及氯霉素这18种抗生素的定性及定量测定，使用睿科Fotector Plus自动固相萃取仪进行固相萃取，AB 3200 QTRAP液质联用仪检测，步骤如下：
水样的前处理：使用材质为聚醚砜的微孔滤膜(内径为25mm，孔径为0.22μm)对水样进行过滤，取过滤后水样1000ml置玻璃瓶(玻璃瓶须经重铬酸钾浸泡12小时以上，并经超纯水冲洗后烘干)中，准确加入0.5gNa2EDTA，超声振荡约5分钟使其溶解，再用10％盐酸水溶液调节水样pH值至3.0。
水样中抗生素的富集：
使用睿科Fotector Plus自动固相萃取仪进行固相萃取操作。其中，HLB固相萃取小柱规格为6cc/500mg，HLB小柱上样前依次用10ml甲醇、5ml超纯水和5ml0.1％甲酸水溶液进行活化，再以8ml/min的速度上样，并以16ml超纯水淋洗，最后用10ml甲醇以1ml/min速度洗脱。
洗脱液在40℃水浴条件下氮气吹干，耗时约40分钟，再加1ml乙腈-水(10:90，含0.1％甲酸)溶解，并用尼龙材质的微孔滤膜(0.22μm)滤过。
水样的检测：
如上文所述，采用高效液相色谱串联质谱法，流动相梯度洗脱，待测液进样分析；以头孢拉定、头孢克肟、头孢丙烯、头孢羟氨苄、头孢孟多酯、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、甲硝唑、替硝唑、氟康唑、酮康唑、克霉唑、诺氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、氟罗沙星、舒巴坦及氯霉素等18种抗生素目标物保留时间及特征离子对(m/z)进行定性，以峰面积按标准曲线法进行定量。
水样检测中液相色谱条件包括使用C18色谱柱(100mm×2.0mm×3μm)，进样体积为10μl，柱温为35℃，流速为0.2ml/min，流动相为乙腈和0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱程序按照实施例一的方式进行。
结果判断：样品中质量色谱峰的保留时间与目标抗生素对照品一致，其特征离子对与对照品一致，且相对丰度与对照品一致(参加上文的对照标准)，则可判断样品中存在该抗生素，若无，则表明样品不含该抗生素。
如检出抗生素，以峰面积计，用标准曲线法分别计算样品中各抗生素的质量浓度。
本实施例中，样品及各浓度对照品溶液测定之间加空白样品测定，以确认仪器是否出现残留，并对空白(超纯水)进行加标回收考察(加标水平为200ng)，结果如表7所示。
本实施例中，水源水样E中检出磺胺甲恶唑、甲硝唑及氟康唑三种抗生素，标准曲线法计算其质量浓度分别为1.79ng/l、1.73ng/l及6.83ng/l。
针对多种目标抗生素分属于β-内酰胺类、磺胺类、硝咪唑类、抗真菌类、喹诺酮类及氯霉素类等6个不同类别抗生素，它们结构及性质各有不同，同时由于待测水样中干扰物质多，目标抗生素含量极低，本发明所实现的检测方法，通过优化水样前处理及固相萃取富集条件，能够有效地排除了干扰成分，富集了目标抗生素，建立了同时对该18种抗生素定性及定量的检测方法，那个有效地对多种抗生素进行检测。
而且，通过上述方法，使得对抗生素的检测灵敏度高，检测结果准确。实践证明，本发明检测方法的线性范围可覆盖三个数量级，能满足地表水样中18种目标抗生素在宽浓度范围内的准确定量测定，具有良好的实用性。
以上实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于水样中多种抗生素的检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
101、水样的前处理：使用微孔滤膜对水样进行过滤，取过滤后水样，向过滤后水样中加入Na2EDTA并使其溶解，再用稀酸调节pH值至2.5-3.5，得到前处理水样；
102、水样中抗生素的富集：将前处理的水样经自动固相萃取仪进行萃取，并选用经活化的HLB小柱进行痕量抗生素富集，后以甲醇洗脱，收集洗脱液，氮吹至干后复溶，滤过，作为待测液；
103、水样的检测：采用高效液相色谱串联质谱法，流动相梯度洗脱，待测液进样分析。
2.根据权利要求1所述的用于水样中多种抗生素的检测方法，其特征在于所述的抗生素为头孢拉定、头孢克肟、头孢丙烯、头孢羟氨苄、头孢孟多酯、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、甲硝唑、替硝唑、氟康唑、酮康唑、克霉唑、诺氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、氟罗沙星、舒巴坦及氯霉素的任意一种。
3.根据权利要求1所述的用于水样中多种抗生素的检测方法，其特征在于所述101步骤中，取过滤后水样和Na2EDTA的用量为：1000ml水样加入0.5gNa2EDTA，并超声振荡使Na2EDTA溶解。
4.根据权利要求3所述的用于水样中多种抗生素的检测方法，其特征在于水样的前处理中，所述的微孔滤膜材质为聚醚砜，内径为25mm，孔径为0.22μm或0.45μm；pH调节终点可接受范围为3.0±0.1。
5.根据权利要求1所述的用于水样中多种抗生素的检测方法，其特征在于所述102步骤中，水样中抗生素的富集中，HLB小柱规格为6cc/200mg或6cc/500mg，依次用10ml甲醇、5ml超纯水和5ml0.1％甲酸水溶液进行活化，以5～8ml/min的速度上样，并以10～16ml超纯水淋洗，最后用10ml甲醇以1ml/min速度洗脱；且洗脱后的液体在30～40℃水浴条件下氮气吹干，再加1ml乙腈-水(10:90，含0.1％甲酸)溶解，并过0.22μm尼龙材质的微孔滤膜。
6.根据权利要求5所述的用于水样中多种抗生素的检测方法，其特征在于所述HLB小柱以6ml/min的速度上样，并以12ml超纯水淋洗，最后用10ml甲醇以1ml/min速度洗脱；洗脱液在35℃水浴条件下氮气吹干；乙腈-水的用量比例为10:90，且乙腈-水中含0.1％甲酸。
7.根据权利要求5所述的用于水样中多种抗生素的检测方法，其特征在于所述103步骤水样检测中，所述的高效液相色谱串联质谱法液相色谱条件包括使用C18色谱柱(100mm×2.0mm×3μm)，进样体积为10μl，柱温为35℃，流速为0.2ml/min，流动相为乙腈和0.1％甲酸水溶液，进行梯度洗脱。
8.根据权利要求7所述的所述的一种水样中18种抗生素的检测方法，其特征在于所述103步骤水样检测中，所述的高效液相色谱串联质谱法质谱参数包括：喷雾管雾化气(Gas1)、辅助加热气(Gas2)流速均为50psi、气帘气(Curtain Gas)为25psi、辅助加热温度为550℃、电离电压(IS)分别为+5500V(正离子)及-4500V(负离子)。
9.根据权利要求1所述的用于水样中多种抗生素的检测方法，其特征在于所述103步骤中，以抗生素目标物保留时间及特征离子对(m/z)进行定性，以峰面积按标准曲线法进行定量。
10.根据权利要求9所述的用于水样中多种抗生素的检测方法，其特征在于所述103步骤中，检出抗生素，用标准曲线法分别计算样品中各抗生素的质量浓度，计算方法为：
式中：
ρi——水样中抗生素组分的含量，ng/l；
mi——标准曲线法计算水样中抗生素组分的质量浓度，ng/ml；
V——最终定容体积，ml；
Vs——水样取样体积，l。
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