CN103913426B - 一种评估废水中抗生素的残留生物效能的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种评估废水中抗生素的综合生物效能（效价当量）的方法，包括对废水采用比浊法测定吸光度，计算废水中抗生素的残留生物效能。本发明方法能够对废水中的不同抗生素及其具有抗菌活性基团的代谢产物进行准确测定，操作简便，从而能够对不同类型抗生素废水进行比较或是对含有多种抗生素的混合废水进行综合评价，而且对不同类抗生素废水的残留生物效能的评价具有普适性。

Description

一种评估废水中抗生素的残留生物效能的方法

技术领域

本发明属于抗生素的检测领域，特别涉及抗生素生产废水中残留抗生素及其相关物质的生物效能的评估方法。

背景技术

抗生素的污染问题受到越来越多的重视，抗生素已经成为环境中普遍存在的污染物，不仅在土壤和地表水中被频繁检出，在地下水甚至饮用水源中也有发现。其中，抗生素生产废水是抗生素进入环境的重要来源之一。1995年Holm等人分析了一个废弃制药厂废物填埋场的地下水，结果磺胺类药物浓度达到5mg/L；2008年我国一个调查发现土霉素生产废水经过处理后出水土霉素浓度达到50mg/L。抗生素生产废水中残留抗生素及相关物质（主要是某些具有抑菌效应的异构体或水解与降解中间产物等）含量高，对废水生物处理系统的影响也相当显著。因此抗生素生产废水的研究受到广泛的关注。

目前国内外对废水中抗生素的检测主要采用的是色谱法及其联用技术、毛细管电泳法等理化检测方法。理化检测方法是利用抗生素分子中的官能团所具有的特殊反应或由其性质来测定含量，使用最广泛的是相对成熟的液相色谱法及其联用技术。但是此方法适用于已知结构的抗生素及其代谢产物，需要有相应的抗生素标准品才能进行定量，而抗生素生产废水在处理过程中会发生一系列的变化，产生不同的异构体或水解与降解中间产物，这些产物中仍有部分会保留一定的抗菌活性甚至可能具有更高的抗菌活性，例如，土霉素在弱酸条件下（pH值3-6.5），土霉素能够降解成为去水土霉素（Anhydrooxytetracycline）和差向异构土霉素（Epimeric-Oxytetracycline），去水土霉素能够迅速不可逆地降解成为α-Apo-OTC和β-Apo-OTC，强酸条件下，α-Apo-OTC和β-Apo-OTC能够进一步不可逆降解成为Ter-OTC；同时在较温和的中性和弱碱条件下，土霉素可能产生更为复杂的降解过程，形成iso-OTC，N-DM-OTC，以及N-DDM-OTC等降解产物；在碱性溶液中，土霉素的主要降解产物是Terranoicacid。差向异构土霉素、α-Apo-OTC和β-Apo-OTC往往是土霉素的主要降解产物，而差向异构土霉素与土霉素的比例在0.4到0.6之间。这三种主要的降解产物仍然具有部分抗菌作用，最低抑菌浓度（MIC）分别为1.0、32和>32mg/L，同时也有实验表明这三种降解产物的生物毒性超过土霉素的生物毒性。

例如申请号为200810110955.7的发明专利申请公开了一种乳及乳制品中四环素类抗生素残留量的检测方法。该方法利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪测定四环素类抗生素残留量。试样经Na₂EDTA-McIlvaine缓冲液(pH4.0)提取，三氯乙酸除蛋白，经HLB固相提取小柱净化和富集，采用色谱柱分离，以标准品土霉素、四环素和金霉素配制含量为100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0ng/ml的标准溶液，在柱温30℃，以含有0.1％甲酸的水溶液(v/v)和乙腈为流动相进行梯度洗脱，采用多反应监测方式进行定量。此法虽然快速、准确、灵敏度高，但是其适用范围仅用于测定土霉素、四环素和金霉素三种四环素类抗生素的含量，对于其中可能出现的其他类抗生素以及相关的代谢中间产物则不能进行检测。

本发明主要针对此问题，以抗生素中具有抑菌活性的有效成分即“效价”作为对象，检测废水中抗生素的残留生物效能（抗生素及其相关物质的生物效能）。根据药典，抗生素效价常采用微生物检定法，是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理，如管碟法、比浊法、稀释法等，其中，管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和待检品两者对试验菌的抑菌圈的大小来测定供试品的效价。2005年版《中国药典》正式收录比浊法，与管碟法并列成为抗生素效价测定的标准方法之一。比浊法是利用抗生素在液体培养基中对实验革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对实验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。国内已有基于比浊法的抗生素效价测定仪，但是主要用于药品、制剂的纯度检验，还没有针对废水进行应用。

我国现行的药典中采用比浊法对部分药品或制剂进行效价纯度检测，但是其测定对象仍然是比较单纯的某一抗生素药品或制剂，即药典中的效价方法的对象是单一抗生素药品制剂的检验，不涉及混合抗生素。具体是针对某一种抗生素供试品与其标准品的对照来计算供试品的效价（供试品与标准品种类一致），而混合抗生素的效价由于没有比较的标准，因此还未见采用比浊法测定废水等环境样品的效价。

发明内容

本发明的目的是针对现有抗生素残留生物效价测定存在的技术的问题，提供一种具有普适性的废水中抗生素的生物效能的评估方法，本发明方法能够对含有不同种类抗生素及具有抗菌活性基团的抗生素代谢产物的废水的残留生物效能进行准确测定，操作简便，对不同类抗生素废水的残留生物效能的评价具有普适性和通用性。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种评估废水中抗生素的残留生物效能的方法，包括如下顺序进行的步骤：

1）采用比浊法筛选针对革兰氏阳性菌（G⁺）的标准参照抗生素，并获得革兰氏阳性菌-标准参照抗生素标准曲线；

2）富集和纯化废水中的抗生素类物质，获得抗生素类富集物；

3）用无菌水溶解抗生素类富集物后加入革兰氏阳性菌菌液，混合均匀，采用比浊法测定吸光度；

4）将测定得到的吸光度值代入革兰氏阳性菌-标准参照抗生素的标准曲线中，获得废水中抗生素类物质的综合生物效能。

其中，所述革兰氏阳性菌选择金黄色葡萄球菌。

特别是，以抗生素浓度的对数值为横坐标，以革兰氏阳性菌与抗生素的混合溶液在波长为530nm处的吸光度值为纵坐标绘制获得所述革兰氏阳性菌-标准参照抗生素标准曲线。

其中，步骤1）中所述标准参照抗生素的筛选包括如下顺序进行的步骤：

1A）将革兰氏阳性菌（G⁺）接种于抗生素Ⅲ号培养基中，摇匀，培养，制得革兰氏阳性菌标准菌液，备用；

1B）精确称取抗生素标准品，溶解，配制成不同浓度的抗生素溶液，接着加入革兰氏阳性菌菌液（G⁺），混合均匀后在530nm波长下进行比浊测定，测定革兰氏阳性菌与不同浓度的抗生素溶液的混合液的浊度吸光度值；

1C）以抗生素浓度的对数值为横坐标，以革兰氏阳性菌与抗生素的混合液的吸光度值为纵坐标绘制所述革兰氏阳性菌-抗生素的标准曲线；

1D）根据得到的革兰氏阳性菌-抗生素的标准曲线，以标准曲线的斜率以及综合因子作为筛选依据，筛选得到针对革兰氏阳性菌的标准参照抗生素为红霉素，其中所述综合因子为革兰氏阳性菌-抗生素的标准曲线的线性浓度范围内的高浓度与低浓度比值与标准曲线的斜率之积。

其中，步骤1A）中所述培养的温度为35-37℃。

特别是，所述革兰氏阳性菌标准菌液在波长530nm处的吸光度达到0.3-0.7。

特别是，还包括将冷冻保藏的革兰氏阳性菌（G⁺）进行复活培养之后再接种到抗生素Ⅲ号培养基中，培养制成所述的革兰氏阳性菌标准菌液。

尤其是，所述复活培养温度为35-37℃；培养时间为4-5h。

其中，步骤1B）中所述抗生素溶液的配制方法如下：首先将抗生素标准品按照表1所述方法配制成抗生素标准储备液，然后再加入磷酸盐缓冲液，配制成相应的不同浓度的抗生素溶液。

表1抗生素储备液的配制方法

特别是，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.8或6.0。

其中，步骤1C）中所述革兰氏阳性菌与抗生素的混合液的吸光度值选择向抗生素溶液中加入革兰氏阳性菌菌液后在温度为37±1℃条件下培养150-210min的浊度吸光度值。

特别是，所述培养时间优选为200min。

其中，在步骤2）中采用固相萃取法（SPE）对废水进行富集和纯化，得到所述抗生素类富集物。

特别是，步骤2）中所述抗生素类富集物按照如下顺序进行的步骤制备而成：

2A）将废水通过固相萃取柱，使废水中抗生素类物质吸附在固相萃取柱上；

2B）对固相萃取柱进行洗脱，合并洗脱液；

2C）对洗脱液进行干燥，即得。

特别是，所述的固相萃取柱选择HLB柱。

尤其是，所述HLB柱选择用于萃取极性和非极性类化合物的WatersOasisHLB、Strata-X固相柱；对非极性和碱性化合物有专属性保留作用的WatersOasisMCX、Strata-X-C固相柱；对非极性和强碱性化合物有专属性保留作用的WatersOasisWCX、Strata-X-CW固相柱；对非极性和弱酸性化合物有专属性保留作用的WatersOasisWAX、Strata-X-AW固相柱；对高极性化合物有非常好的保留作用，常用于吸附各类样品的杂质和色素，pH范围0-14的Strata固相柱。

特别是，所述步骤2A）的废水过固相萃取柱之前，还包括将废水进行除杂处理，去除废水中的悬浮物、金属离子等杂质；步骤2B）中采用二氯甲烷与丙酮的混合溶液洗脱四环素类抗生素；采用甲醇/乙酸乙酯混合溶液或含有氨水的甲醇溶液洗脱大环内酯类抗生素；采用甲醇洗脱磺胺类抗生素。

其中，所述二氯甲烷与丙酮的混合溶液中二氯甲烷与丙酮的体积之比为3：2；其中所述甲醇/乙酸乙酯混合溶剂中甲醇与乙酸乙酯的体积之比为1：1；所述含有氨水的甲醇溶液中氨水与甲醇的体积之比为1：100。

尤其是，所述悬浮物采用GF/F滤纸过滤去除；所述金属离子采用Na₂-EDTA去除。

本发明另一方面提供一种评估废水中抗生素的残留生物效能的方法，包括如下顺序进行的步骤：

（1）采用比浊法筛选针对革兰氏阴性菌（G^-）的标准参照抗生素，并获得革兰氏阴性菌-标准参照抗生素标准曲线；

（2）富集和纯化废水中的抗生素类物质，获得抗生素类富集物；

（3）用无菌水溶解抗生素类富集物后加入革兰氏阴性菌菌液，混合均匀，采用比浊法测定吸光度；

（4）将测定得到的吸光度值代入革兰氏阴性菌-标准参照抗生素的标准曲线中，获得废水中抗生素类物质的综合生物效能。

其中，步骤（1）中所述革兰氏阴性菌（G^-）选择大肠杆菌。

特别是，以抗生素浓度的对数值为横坐标，以革兰氏阴性菌与抗生素的混合溶液在波长为530nm处的吸光度值为纵坐标绘制获得所述革兰氏阴性菌-标准参照抗生素标准曲线。

其中，步骤（1）中所述标准参照抗生素的筛选包括如下顺序进行的步骤：

（1-A）将革兰氏阴性菌（G^-）接种于抗生素Ⅲ号培养基中，摇匀，培养，制得革兰氏阴性菌标准菌液，备用；

（1-B）精确称取抗生素标准品，溶解，配制成不同浓度的抗生素溶液，接着加入革兰氏阴性菌，混合均匀后在530nm波长下进行比浊测定，测定革兰氏阴性菌与不同浓度的抗生素溶液的混合液的浊度吸光度值；

（1-C）以抗生素浓度的对数值为横坐标，以革兰氏阴性菌与抗生素的混合液的吸光度值为纵坐标绘制所述革兰氏阴性菌-抗生素的标准曲线；

（1-D）根据得到的革兰氏阴性菌-抗生素的标准曲线，以标准曲线的斜率以及综合因子作为筛选依据，筛选得到针对革兰氏阴性菌的标准参照抗生素为四环素，其中，所述综合因子为革兰氏阴性菌-抗生素的标准曲线的线性浓度范围内的高浓度与低浓度比值与标准曲线的斜率之积。

其中，步骤（1-A）中所述培养的温度为35-37℃。

特别是，所述革兰氏阴性菌标准菌液在波长530nm处的吸光度达到0.3-0.7。

特别是，还包括将冷冻保藏的革兰氏阴性菌（G^-）进行复活培养之后再接种到抗生素Ⅲ号培养基中，培养制成所述的革兰氏阴性菌标准菌液。

尤其是，所述复活培养温度为35-37℃；培养时间为4-5h。

其中，步骤（1-B）中所述抗生素溶液的配制方法如下：首先将抗生素标准品按照表1所述方法进行配制成抗生素标准储备液，然后再加入磷酸盐缓冲液，配制成相应的不同浓度的抗生素溶液。

特别是，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.8或6.0。

其中，步骤（1-C）中所述革兰氏阴性菌与抗生素的混合液的吸光度值选择向抗生素溶液中加入革兰氏阴性菌菌液后在温度为37±1℃条件下培养150-210min的浊度吸光度值。

特别是，所述培养时间优选为200min。

其中，在步骤（2）中采用固相萃取法对废水进行富集和纯化，得到所述抗生素类富集物。

特别是，步骤（2）中所述抗生素类富集物按照如下顺序进行的步骤制备而成：

（2-A）将废水过固相萃取柱，使废水中抗生素类物质吸附在固相萃取柱上；

（2-B）对固相萃取柱进行洗脱，合并洗脱液；

（2-C）对洗脱液进行干燥，即得。

特别是，所述步骤（2-A）的废水过固相萃取柱之前，还包括将废水进行除杂处理，去除废水中的悬浮物、金属离子等杂质；步骤（2-B）中采用二氯甲烷与丙酮的混合溶液洗脱四环素类抗生素；采用甲醇/乙酸乙酯混合溶液或含有氨水的甲醇溶液洗脱大环内酯类抗生素；采用甲醇洗脱磺胺类抗生素。

其中，所述二氯甲烷与丙酮的混合溶液中二氯甲烷与丙酮的体积之比为3:2；其中所述甲醇/乙酸乙酯混合溶剂中甲醇与乙酸乙酯的体积之比为1:1；所述含有氨水的甲醇溶液中氨水与甲醇的体积之比为1:100。

尤其是，所述悬浮物采用GF/F滤纸过滤去除；所述金属离子采用Na₂-EDTA去除。

本发明的有益效果是：

1、本发明方法能够测定废水中具有抗菌活性的抗生素及其具有药效官能团的代谢产物的总的生物效能，包含未知结构的中间产物。

2、本发明方法具有普适性，能够对不同类型的抗生素废水以及含有多种抗生素的混合废水中的残留生物效能进行统一的综合评价。

3、本发明方法中的标准抗生素对细菌传代不敏感、耐药菌少、不易受到外界环境影响，标准抗生素的效价线性范围宽、重复性好，适用于对含有不同类型抗生素废水或含多种抗生素的混合废水的抗菌活性进行综合评价。

4、本发明方法采用固相萃取技术对废水中的抗生素及其具有药效官能团的代谢产物进行富集、纯化，去除其他能够促进或抑制微生物生长的物质，提高了评估的稳定性和准确性，准确反映废水的抗菌活性。

5、本发明方法简单易行，操作条件温和，操作步骤简单，常规检测设备均适用于本发明。

附图说明：

图1是本发明的废水中抗生素生物效能的评估方法的流程示意图；

图2是本发明实施例2-11螺旋霉素生产废水处理和废水取样流程图；

图3是本发明实施例12-19土霉素生产废水处理和废水取样流程图；

图4是本发明实施例20-27螺旋霉素-巴龙霉素生产废水处理和废水取样流程图。

具体实施方式

下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明中培养基、缓冲溶液的组成和配制：

1、抗生素Ⅲ号培养基：胨5g/L、磷酸氢二钾3.68g/L、牛肉浸出粉1.5g/L、磷酸二氢钾1.32g/L、酵母浸出粉3g/L、氯化钠3.5g/L、葡萄糖1g/L，水；

除葡萄糖外，其余组成成分混合，加入无菌水，加热溶解后，再加入葡萄糖溶解后，加水定容至培养基最终体积，用pH计测试培养基酸碱度，用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl将pH值调整至7.0-7.2，在115℃灭菌30min。

2、营养琼脂斜面培养基：胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂15g/L、牛肉浸出粉3g/L，水；

除琼脂外，混合其余组成成分，加入无菌水，加热溶解，加水定容至培养基最终体积，用pH计测试培养基酸碱度，用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl将pH值调整至7.2-7.4，在115℃灭菌30min。

将经过高温高压灭菌后的营养琼脂培养基，趁热分装至具塞试管（例如具塞试管的体积为10ml）中，塞上塞子，将试管倾斜放置，使营养琼脂培养基的最上端距离试管口约1/3试管长度，室温放置，冷却凝固即得。

3、磷酸盐缓冲溶液（pH=6.0）：取磷酸氢二钾2g、磷酸二氢钾8g，加水定容至1000ml，过滤，在115℃灭菌30分钟。

4、磷酸盐缓冲液（pH=7.8)：取磷酸氢二钾5.59g、磷酸二氢钾0.41g，加水定容至1000ml，过滤，在115℃灭菌30分钟。

利用本发明对抗生素废水中残留生物效能（即效价）进行测定，具体实施如下：

实施例1标准抗生素筛选

1、制备标准菌液

从-80℃冰箱中取出冻存的革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）和革兰氏阴性菌大肠杆菌（Escherichiacoli），于4℃冰箱中融化，摇匀，分别加入到抗生素Ⅲ号培养基中。放入37℃振荡培养箱中振荡培养至培养液在波长530nm处的吸光度在0.3-0.7之间，分别得到复活金黄色葡萄球菌和复活大肠杆菌。

本发明中革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌的复活培养温度为35-37℃均适用于本发明；培养时间为4-5h。

将接种环灭菌后，分别蘸取复活金黄色葡萄菌标准菌液、复活大肠杆菌标准菌液，分别涂布到营养琼脂斜面培养基上，接着于37℃生化培养箱中培养16-18h，然后存放在4℃条件下，备用，贮存有效期为10天，最多不超过两周；

用灭菌水（或抗生素Ⅲ号培养基）10ml分别洗下斜面培养基上的金黄色葡萄球菌菌苔、大肠杆菌菌苔，然后分别加入到抗生素Ⅲ号培养基中，摇匀，（在35-37℃下振荡培养3-4小时，培养液在波长530nm处的吸光度达到0.3-0.7，制得金黄色葡萄球菌标准菌液、大肠杆菌标准菌液，备用。

2、配制标准抗生素溶液

1）红霉素标准溶液配制

精确称取标准效价为938u/mL的红霉素标准品，每10mg红霉素标准品加入到4.0ml乙醇，然后加入灭菌水定容至50ml，配制成500u/mL的红霉素标准贮备液；

待实验时用PBS（磷酸盐缓冲液，pH7.8）稀释到0.15-1u/mL线性范围内的不同浓度梯度，即稀释成0.15、0.20、0.30、0.45、0.75、1.00u/mL的6个浓度梯度的红霉素标准溶液A；用PBS（磷酸盐缓冲液，pH7.8）稀释到6-20u/mL线性范围内的不同浓度梯度，即稀释成6、7.5、10、12、15、20u/mL的6个浓度梯度的红霉素标准溶液B。

2）螺旋霉素标准溶液配制

精确称取标准效价为1348u/mL的螺旋霉素标准品，每10mg螺旋霉素标准品加入到4.0ml乙醇，然后加入灭菌水定容至50ml，配制成500u/mL的螺旋霉素标准贮备液；

待实验时用PBS（pH7.8）稀释到4.5-17u/mL线性范围内的不同浓度梯度，即稀释成4.5、6.7、10、12、14、17u/mL的6个浓度梯度的螺旋霉素标准溶液A。

3）巴龙霉素标准溶液配制

精确称取标准效价为718u/mL的巴龙霉素标准品，每10mg巴龙霉素标准品加入到灭菌水定容至50ml，配制成500u/mL的巴龙霉素标准贮备液；

待实验时用PBS（pH7.8）稀释到0.8-3u/mL线性范围内的不同浓度梯度，即稀释成0.8、1.2、1.6、2.0、2.5、3u/mL的6个浓度梯度的巴龙霉素标准溶液A；用PBS（pH7.8）稀释到7.5-15u/mL线性范围内的不同浓度梯度，即稀释成7.5、8、10、12、15u/mL的5个浓度梯度的巴龙霉素标准溶液B。

4）核糖霉素标准溶液配制

精确称取标准效价为695u/mL的核糖霉素标准品，每10mg核糖霉素标准品加入到灭菌水定容至50ml，配制成500u/mL的核糖霉素标准贮备液；

待实验时用PBS（pH7.8）稀释到6.0-18.0u/mL线性范围内的不同浓度梯度，即稀释成6、9、12、15、18u/mL的5个浓度梯度的核糖霉素标准溶液A；用PBS（pH7.8）稀释到7.5-18.0u/mL线性范围内的不同浓度梯度，即稀释成7.5、10、12、15、18u/mL的5个浓度梯度的核糖霉素标准溶液B。

5）土霉素标准溶液配制

精确称取标准效价为874u/mL的土霉素标准品，每10mg土霉素标准品加入到1.0mlHCl，然后加入灭菌水定容至50ml，配制成500u/mL的土霉素标准贮备液；

待实验时用PBS（pH6.0）稀释到0.1-0.4u/mL线性范围内的不同浓度梯度，即稀释成0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.4u/mL的7个浓度梯度的土霉素标准溶液A；用PBS（pH6.0）稀释到2-15u/mL线性范围内的不同浓度梯度，即稀释成2、4、6、8、12、15u/mL的6个浓度梯度的土霉素标准溶液。

6）四环素标准溶液配制

精确称取标准效价为971u/mL的四环素标准品，每10mg四环素标准品加入到1.0mlHCl，然后加入灭菌水定容至50ml，配制成500u/mL的四环素标准贮备液；

待实验时用PBS（pH6.0）稀释到0.05-0.3u/mL线性范围内的不同浓度梯度，即稀释成0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.3u/mL的6个浓度梯度的四环素标准溶液A；用PBS（pH6.0）稀释到10-20u/mL线性范围内的不同浓度梯度，即稀释成10、12、14、15、18、20u/mL的6个浓度梯度的四环素标准溶液B。

7）链霉素标准溶液配制

精确称取标准效价为711u/mL的链霉素标准品，每10mg链霉素标准品加入到灭菌水定容至50ml，配制成500u/mL的链霉素标准贮备液；

待实验时用PBS（pH7.8）稀释到5-30u/mL线性范围内的不同浓度梯度，即稀释成5、10、15、20、25、30u/mL的6个浓度梯度的链霉素标准溶液A。

8）卡那霉素标准溶液配制

精确称取标准效价为694u/mL的卡那霉素标准品，每10mg卡那霉素标准品加入到灭菌水定容至50ml，配制成500u/mL的卡那霉素标准贮备液。

待实验时用PBS（pH7.8）稀释到4-18u/mL线性范围内的不同浓度梯度，即稀释成4、6、8、12、18u/mL的5个浓度梯度的卡那霉素标准溶液A；用PBS（pH7.8）稀释到4-10u/mL线性范围内的不同浓度梯度，即稀释成4、5、6、7.5、10u/mL的5个浓度梯度的卡那霉素标准溶液B。

3、配制测定混合液

分别取上述不同抗生素的不同浓度的标准溶液各1ml，然后向不同浓度的红霉素标准溶液A、螺旋霉素标准溶液A、巴龙霉素标准溶液A、核糖霉素标准溶液A、土霉素标准溶液A、四环素标准溶液A、链霉素标准溶液A、卡那霉素标准溶液A中分别加入9ml制备的金黄色葡萄球菌标准菌液；向不同浓度的红霉素标准溶液B、巴龙霉素标准溶液B、核糖霉素标准溶液B、土霉素标准溶液B、四环素标准溶液B、卡那霉素标准溶液B中分别加入9ml制备的大肠杆菌标准菌液，每个浓度的抗生素标准溶液设5个平行，即每个浓度的抗生素标准溶液取10ml，分成10份，每份1ml，向其中5份中分别加入9ml的金黄色葡萄球菌标准菌液，向另外5份中分别加入9ml的大肠杆菌标准菌液；

4、配制阳性、阴性对照液

阳性对照液A：取1mlPBS（pH7.8或6.0）溶液，加入9ml金黄色葡萄球菌标准菌液；

阳性对照液B：取1mlPBS（pH7.8或6.0）溶液，加入9ml大肠杆菌标准菌液；

阴性对照液A：取1mlPBS(pH7.8或6.0)溶液加入9ml不含任何试验菌的抗生素Ⅲ号培养基；

阴性对照液B：取1mlPBS（pH7.8或6.0）溶液加入9ml不含任何试验菌的抗生素Ⅲ号培养基。

5、比浊测定

将配制的不同浓度的抗生素的测定混合液、对应的阳性对照液、阴性对照液加入到比色皿中，塞上塞子后一同放入已预热并保持为37℃的微生物比浊测量仪（北京先驱威锋技术开发公司）中，同时进行比浊测定，其中，设定测定参数：培养温度37℃，振摇间隔时间5min，单次振摇时间20s，振摇频率0.2HZ，监测开始时间45min（从开始试验后第45min进行监测吸光度），监测间隔时间10min。振摇20s，清除本底值，开始实验，总实验时间4h；监测波长为530nm。

6、数据处理

用仪器相应的工作站软件查看数据结果，一次实验给出20组不同时间的监测数据，一般选择抗生素标准溶液浓度梯度中的中间浓度抗生素溶液在530nm处的吸光度值为0.3左右时的测定结果进行标准曲线的绘制。本发明中添加金黄色葡萄球菌、大肠杆菌后的抗生素标准溶液浓度梯度中的中间浓度抗生素溶液在530nm处的吸光度值达到0.3左右时的培养时间为150-210min，本发明实施例中选择200min时测定的数据绘制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌与抗生素的标准曲线。

以抗生素浓度对数值为横坐标，以混合液在波长为530nm处的吸光度值为纵坐标分别绘制抗生素与金黄色葡萄球菌或大肠杆菌工作曲线，其中：抗生素-金黄色葡萄球菌工作曲线的线性特征如表2所示；抗生素-大肠杆菌工作曲线的线性特征如表3所示。

本发明从常见抗生素中筛选出效价线性范围宽、重复性好、耐药菌少、对细菌传代不敏感、不易受到外界环境影响的抗生素分别作为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的残留生物效能标准物，从而能够对不同类型抗生素废水进行比较或是对含有多种抗生素的混合废水进行综合评价。

针对革兰氏阳性菌代表菌株金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性菌代表菌株大肠杆菌，分别得到不同抗生素的效价线性范围（抗生素在液体培养基中对试验菌生长具有抑制作用，抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与吸光度呈线性关系），综合考虑斜率、抗生素综合指标因子（F，即斜率与相应抗生素的标准曲线线性范围所处的标准抗生素的最高浓度、最低浓度之比的乘积），选择两个值均较高的抗生素作为本发明抗生素效价测定的标准抗生素。

综合指标因子（F）=相应抗生素标准曲线的斜率×标准曲线线性范围内的（高浓度/低浓度）

综合指标因子的数值越大表示相应抗生素的线性范围宽，斜率高表明测试灵敏度高，这样的抗生素品种试验重复性较好，不易受到外界环境的影响。

表2金黄色葡萄球菌为受试菌株的抗生素比浊法线性特征

从表2的比较结果可以得知：红霉素的效价标准曲线的综合指标因子最大（达到3.14），也就是说红霉素的效价线性范围宽、重复性好、耐药菌少、对细菌传代不敏感、不易受到外界环境影响，因此选择红霉素作为针对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）的标准抗生素。

表3大肠杆菌为受试菌株的抗生素比浊法线性特征

从表3的比较结果可以得知：四环素的效价标准曲线的综合指标因子最高（达到3.08），并且斜率高（达到1.541），也就是说四环素的效价线性范围宽、重复性好、耐药菌少、对细菌传代不敏感、不易受到外界环境影响，因此选择四环素作为针对革兰氏阴性菌（大肠杆菌）的标准抗生素。

本发明方法测定含有任何抗生素以及具有抗菌活性的代谢中间产物的废水时，以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌为标准菌株、分别以红霉素、四环素为标准抗生素，采用比浊法进行测定任何所述废水的生物活性。

实施例2螺旋霉素生产废水残留综合生物效能的测定

本发明实施例以螺旋霉素生产废水为例进行详细说明，螺旋霉素生产废水的处理流程如图1所示，螺旋霉素生产废水依次通过调节池、上流式厌氧污泥床（UASB，Up-flowAnaerobicSludgeBed/Blanket）、缺氧池、好氧池、二沉池后，达到《发酵类制药工业水污染物排放标准GB21903-2008》，直接排放，其中：SPM-1为进入调节池之前的进水；SPM-2为经过厌氧污泥床处理后的厌氧出水；SPM-3为经过缺氧池处理后的出水；SPM-4为经过好氧池处理的出水；SPM-5为经过二沉出处理的出水。采用自动采样器采集废水水样。

1、采集废水水样

将从螺旋霉素生产工厂的废水处理车间的进水口，即在螺旋霉素废水进入调节池时采集的废水水样（SPM-1），通过GF/F滤纸（47mm），去除废水中的悬浮物，得到过滤废水水样。

2、富集抗生素类物质

依次向HLB固相萃取柱（WatersOasisHLB固相萃取小柱500mg/6cc）中通入2*3ml的甲醇/乙酸乙酯混合溶剂（V/V=1/1）（即采用体积比为1：1的甲醇/乙酸乙酯混合溶剂分两次洗脱HLB固相萃取柱2次，每次使用甲醇/乙酸乙酯混合溶剂3ml）；2*3ml含有1%氨水的甲醇（v/v）；2*3mlpH为4的超纯水（将超纯水的pH调节至4后洗脱HLB固相萃取柱2次，每次洗脱用超纯水3ml），对HLB固相萃取柱进行活化处理，制得活化HLB固相萃取柱，备用；

通过固相萃取技术（SPE）对抗生素及其相关物质进行富集和纯化，去除能够促进或抑制微生物生长的其他基质物质，然后利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理，在微生物浊度法测定仪的基础上，对废水中的残留生物效能进行测定。

取过滤后的SPM-1废水水样20ml加入到活化HLB固相萃取柱中，待样品全部吸附后，依次以2*3ml甲醇/乙酸乙酯混合溶剂（V/V=1/1）、2*3ml含有1%氨水的甲醇（v/v）进行洗脱，合并洗脱液，用氮气吹干洗脱液，得到抗生素类富集物；

加入超纯水溶解抗生素类富集物，振荡、混匀，定容至1ml，制得抗生素类富集物浓缩液，备用。

3、标准菌液配制

革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）标准菌液的配制与实施例1相同。

4、绘制标准参照抗生素的工作曲线

1）螺旋霉素标准溶液配制

螺旋霉素标准溶液配制方法与实施例1的相同，用PBS（磷酸盐缓冲液，pH7.8）稀释得到浓度为4.5-17u/mL线性范围内的不同浓度梯度的螺旋霉素标准溶液，即稀释成4.5、6.7、10、12、14、17u/mL的6个浓度的螺旋霉素标准溶液。

2）配制测定混合液

分别取上述6个不同浓度的螺旋霉素标准溶液各1ml，然后向6个不同浓度的螺旋霉素标准溶液中分别加入9ml制备的金黄色葡萄球菌标准菌液，每个浓度的螺旋霉素标准溶液设5个平行，即浓度为4.5u/mL的螺旋霉素标准溶液取5ml，分成5份，每份1ml，向其中5份中分别加入9ml的金黄色葡萄球菌标准菌液，其他浓度的螺旋霉素标准溶液按照上述方法分别加入金黄色葡萄球菌标准菌液；

3）配制阳性、阴性对照液

阳性对照液A：向1mlPBS（pH7.8）溶液中加入9ml金黄色葡萄球菌标准菌液；

阴性对照液A：向1mlPBS（pH7.8）溶液加入9ml不含任何试验菌抗生素Ⅲ号培养基。

4）比浊测定

将配制的测定混合液、阳性对照液、阴性对照液加入到比色皿中，塞上塞子后放入已预热并保持温度为37℃的微生物比浊测量仪（北京先驱威锋技术开发公司）中进行比浊测定，测定记录530nm处的吸光度值，其中，设定测定参数：培养温度37℃，振摇间隔时间5min，单次振摇时间20s，振摇频率0.2HZ，监测开始时间45min，监测间隔时间10min。振摇20s，清除本底值，开始实验，总实验时间4h。

5）数据处理

用仪器相应的工作站软件查看数据结果，一次实验给出20组不同时间的监测数据，选择200min时的数据（本发明实施例中选择培养200min时测定的数据绘制标准曲线，在微生物培养150-210min之间测定的数据均可用于绘制标准曲线，在培养150-210min时间段微生物均处于对数生长期，活性最好，其测定结果稳定性好），分别测得浓度为4.5-17u/mL线性范围内的不同浓度梯度的螺旋霉素标准溶液的吸光度值为：0.526、0.437、0.339、0.2935、0.264、0.207，以螺旋霉素浓度的对数值为横坐标，以金黄色葡萄球菌与螺旋霉素的混合液的吸光度值为纵坐标绘制述葡萄球菌-螺旋霉素的标准曲线，螺旋霉素-金黄色葡萄球菌标准曲线如式（Ⅰ）所示，

y=-0.5495x+0.8881（Ⅰ）

其中：式（Ⅰ）的斜率为0.5495；综合指标因子F为2.34；x为lnC，C为螺旋霉素的浓度；y为吸光度。

5、废水中抗生素类物质的生物效能（生物活性效能）测定

将抗生素类富集物浓缩液稀释10倍、50倍、100倍，制成3个浓度系列；

分别取上述3个不同浓度的废水稀释液各1ml，然后向3个不同浓度的废水稀释液中分别加入9ml制备的金黄色葡萄菌标准菌液，每个浓度的废水稀释液设5个平行，即稀释10倍的废水稀释液取5ml，分成5份，每份1ml，向其中分别加入9ml的金黄色葡萄菌标准菌液；其他浓度的废水稀释液按照上述方法分别加入金黄色葡萄菌标准菌液；

将配制的测定混合液加入到比色皿中，塞上塞子后放入已预热至37℃的微生物比浊测量仪中进行比浊测定，测定记录530nm处的吸光度值，其中，设定测定参数：培养温度37℃，振摇间隔时间5min，单次振摇时间20s，振摇频率0.2HZ，监测开始时间45min，监测间隔时间10min。振摇20s，清除本底值，开始实验，总实验时间4h。

本实施例中稀释100倍的废水吸光度值为0.248，其吸光度值落入螺旋霉素-金黄色葡萄球菌标准曲线的线性范围之内，将测定的吸光度值0.248代入式（Ⅰ）中，计算废水水样SPM-1针对G⁺的抗生素类物质的残留生物效能（残留生物效价），计算结果如表4所示。

实施例3-6螺旋霉素生产废水残留综合生物效能的测定

除了从螺旋霉素生产工厂的废水处理车间的上流式厌氧污泥床（UASB）的出水处采集废水水样（SPM-2）、从螺旋霉素生产工厂的废水处理车间的厌氧生物处理后的缺氧池出水处采集废水水样（SPM-3）、从螺旋霉素生产工厂的废水处理车间的好氧生物处理后的好氧池出水处采集废水水样（SPM-4）、从螺旋霉素生产工厂的废水处理车间的二级生物处理后的二沉池出水处采集废水水样（SPM-5），实施例3中的废水水样（SPM-2）稀释倍数为50倍，200min是测定的吸光度为0.465；实施例4中废水水样（SPM-3）的稀释倍数为5倍，200min是测定的吸光度为0.339；实施例5中废水水样（SPM-4）的稀释倍数为5倍，200min是测定的吸光度为0.340；实施例6中废水水样（SPM-5）的稀释倍数为5倍，200min是测定的吸光度为0.383之外，其余与实施例2相同。

将测定的吸光度值分别代入式（Ⅰ）中，计算废水水样SPM-2、SPM-3、SPM-4、SPM-5针对G⁺的螺旋霉素的残留生物效能（残留生物效价），测定结果如表4所示。

表4螺旋霉素生产废水的螺旋霉素效价与螺旋霉素浓度的测定结果

表4的测定结果表明，采用比浊法测定以含螺旋霉素为主的抗生素废水的抗生素类物质的残留综合生物效能（即废水的残留效价）值显著高于按照UPLC-MS/MS测定方法的测定结果。本发明方法通过测定废水对细菌菌株的抑制，综合表征废水的抑菌活性，包含废水中各种抗生素及其可能的具有抗菌活性的代谢中间产物，测定抗生素废水的综合生物活性效能能够更准确的反映废水的抗菌活性，能够对废水中其他抗生素以及可能产生的具有抗菌活性的代谢中间产物进行综合评估。而以结构为基础的UPLC-MS/MS测定方法测定的抗生素的浓度偏低，不能准确反映废水的抗菌生物活性效能，以及可能对生物处理系统产生的影响。

液质联用技术是利用抗生素分子中的官能团所具有的特殊反应或由其性质来测定含量，此方法适用于已知结构的抗生素及其代谢产物，需要有相应的抗生素标准品才能进行定量，而抗生素生产废水在处理过程中会发生一系列的变化，产生不同的异构体或水解与降解中间产物，这些产物可能会在液质联用的测定中被遗漏。

本发明发明采用比浊法测定废水中所含抗生素类物质的生物效能，既排除了基质的干扰，使其适用范围广，基质干扰通过固相萃取解决，回收率已经通过实验验证；普适性通过选用标准抗生素来解决，其可行性也通过实验结果的相关性得到验证。

实施例7螺旋霉素生产废水残留综合生物效能的测定

1、采集废水水样

与实施例2相同；

2、富集抗生素类物质

与实施例2相同；

3、标准菌液配制

标准菌液配制步骤中金黄色葡萄球菌标准菌液配制与实施例1相同；

4、绘制标准参照抗生素工作曲线

1）红霉素标准溶液配制

红霉素标准溶液配制方法与实施例1相同，制成0.15、0.22、0.33、0.5、0.75、1.00u/mL的6个浓度的红霉素标准溶液；

2）配制测定混合液

分别取上述6个不同浓度的红霉素标准溶液各1ml，然后向6个不同浓度的螺旋霉素标准溶液中分别加入9ml制备的金黄色葡萄球菌标准菌液，每个浓度红霉素标准溶液设5个平行，即浓度为0.15u/mL的红霉素标准溶液取5ml，分成5份，每份1ml，分别向每1份红霉素标准溶液中加入9ml的金黄色葡萄球菌标准菌液，其他浓度的红霉素标准溶液按照上述方法分别加入金黄色葡萄球菌标准菌液；

3）配制阳性、阴性对照液

阳性对照液A：向1mlPBS（pH7.8）溶液中加入9ml金黄色葡萄球菌标准菌液；

阴性对照液A：向1mlPBS（pH7.8）溶液加入9ml不含任何试验菌抗生素Ⅲ号培养基。

4）比浊测定

将配制的测定混合液、阳性对照液、阴性对照液加入到比色皿中，塞上塞子后放入已预热并保温为37℃的微生物比浊测量仪（北京先驱威锋技术开发公司）中进行比浊测定，测定记录530nm处的吸光度值，其中，设定测定参数：培养温度37℃，振摇间隔时间5min，单次振摇时间20s，振摇频率0.2HZ，监测开始时间45min，监测间隔时间10min。振摇20s，清除本底值，开始实验，总实验时间4h。

5）数据处理

用仪器相应的工作站软件查看数据结果，一次实验给出20组不同时间的监测数据，选择200min时的数据，分别测得浓度为0.15-1u/mL线性范围内的不同浓度梯度的红霉素标准溶液的吸光度值为：0.517、0.445、0.362、0.296、0.228、0.1635，以红霉素浓度的对数值为横坐标，以金黄色葡萄球菌与红霉素的混合液的吸光度值为纵坐标绘制出金黄色葡萄球菌-红霉素的标准曲线，红霉素-金黄色葡萄球菌标准曲线如式（Ⅱ）所示，

y=-0.420x+0.167（Ⅱ）

其中：式（Ⅱ）的斜率为0.420；综合指标因子F为2.80；x为lnC，C为红霉素的浓度；y为吸光度。

除了绘制标准参照抗生素的工作曲线步骤之外，其余测定步骤与实施例2相同。

本实施例中稀释100倍的废水吸光度值为0.227，其吸光度值落入红霉素-金黄色葡萄球菌标准曲线的线性范围之内，将测定的吸光度值0.227代入式（Ⅱ）中，计算废水水样SPM-1针对G⁺的抗生素类物质的综合生物效能，即废水水样SPM-1针对G⁺的标准参照抗生素（红霉素）的残留生物效能，计算结果如表5所示。

实施例8-11螺旋霉素生产废水残留综合生物效能的测定

除了从螺旋霉素生产工厂的废水处理车间的上流式厌氧污泥床（UASB）的出水处采集废水水样（SPM-2）、从螺旋霉素生产工厂的废水处理车间的厌氧生物处理后的缺氧池出水处采集废水水样（SPM-3）、从螺旋霉素生产工厂的废水处理车间的好氧生物处理后的好氧池出水处采集废水水样（SPM-4）、从螺旋霉素生产工厂的废水处理车间的二级生物处理后的二沉池出水处采集废水水样（SPM-5），实施例8中的废水水样（SPM-2）稀释倍数为50倍，200min是测定的吸光度为0.436；实施例9中废水水样（SPM-3）的稀释倍数为5倍，200min是测定的吸光度为0.346；实施例10中废水水样（SPM-4）的稀释倍数为5倍，200min是测定的吸光度为0.346；实施例11中废水水样（SPM-5）的稀释倍数为5倍，200min是测定的吸光度为0.387之外，其余与实施例7相同。

将测定的吸光度值分别代入式（Ⅱ）中，计算废水水样SPM-2、SPM-3、SPM-4、SPM-5针对G⁺的标准抗生素（红霉素）的残留生物效能（即残留生物效价），测定结果如表5所示。

表5螺旋霉素生产废水的（标准抗生素）效能测定结果

本发明采用红霉素作为标准抗生素，是为了解决此方法的普适性问题，针对含有不同抗生素的混合废水进行综合评价或为了比较含有不同类的抗生素废水的残留效价水平时采用的。简单来说，一种废水主要含有哪种抗生素就应该采用哪种抗生素作标准曲线来测定此种抗生素的残留效价当量，而当遇到某废水含有多种抗生素时，不能随意选择其中某一种抗生素来进行评估时，选用标准抗生素来统一评价，具有普遍性。

实施例12土霉素生产废水残留综合生物效能的测定

本发明实施例以土霉素生产废水为例进行详细说明，土霉素生产废水的处理流程如图3所示，土霉素生产废水依次通过调节池、序批式活性污泥反应器（SBR，sequncingbatchreactor）、接触氧化池、二沉池后，达到《发酵类制药工业水污染物排放标准GB21903-2008》排放标准，直接排放，其中：OTC-1为进入调节池之前的土霉素生产废水；OTC-2为经过调节池处理后的出水；OTC-3为经过序批式活性污泥反应器处理后的出水；OTC-4为经过二沉出处理的出水。采用自动采样器采集废水水样。

1、采集废水水样

将从土霉素生产工厂的废水处理车间的进水口，即在土霉素废水进入调节池时采集的废水水样（OTC-1），通过GF/F滤纸，去除废水中的悬浮物，得到过滤废水水样。

2、富集抗生素类物质

依次向HLB固相萃取柱中通入2*3ml的甲醇/乙酸乙酯混合溶剂（V/V=1/1）；2*3ml含有1%氨水的甲醇（v/v）；2*3mlpH为4的超纯水，对HLB固相萃取柱进行活化处理，制得活化HLB固相萃取柱，备用；

取过滤后的OTC-1废水水样20ml用40%H₂SO₄调节pH至2.50-3.00，加入0.01g的Na₂-EDTA，溶解均匀，然后加入到活化的HLB固相萃取柱中，待样品全部吸附后，以二氯甲烷/丙酮（v/v=3/2）为洗脱液进行洗脱，合并洗脱液，用氮气吹干洗脱液，得到抗生素类富集物；

加入体积百分比浓度为40%的甲醇水溶液溶解抗生素类富集物，振荡、混匀，定容至2ml，制得抗生素类富集物浓缩液，备用。

3、标准菌液配制

金黄色葡萄球菌标准菌液配制与实施例1相同。

4、绘制标准参照抗生素工作曲线

标准参照抗生素工作曲线绘制步骤与实施例7相同，

用仪器相应的工作站软件查看数据结果，一次实验给出20组不同时间的监测数据，选择200min时的数据，分别测得浓度为0.15-1.0u/mL线性范围内的不同浓度梯度的红霉素标准溶液的吸光度值为：0.527、0.432、0.359、0.3175、0.238、0.1635，以红霉素浓度的对数值为横坐标，以金黄色葡萄球菌与红霉素的混合液的吸光度值为纵坐标绘制出葡萄球菌-红霉素的标准曲线，红霉素-金黄色葡萄球菌工作曲线如式（Ⅲ）所示：

y=-0.412x+0.175（Ⅲ）

其中，式（Ⅲ）的斜率为0.412；综合指标因子F为2.75；x为lnC，C为红霉素的浓度；y为吸光度。

5、废水中抗生素及其相关物残留生物效能测定

将抗生素类富集物浓缩液稀释10倍、100倍、1000倍，制成3个浓度系列；

分别取上述3个不同浓度的废水稀释液各1ml，然后向3个不同浓度的废水稀释液中分别加入9ml金黄色葡萄球菌标准菌液，每个浓度的废水稀释液设5个平行，即稀释10倍的废水稀释液取5ml，分成5份，每份1ml，向每一份中分别加入9ml的金黄色葡萄球菌标准菌液，其他浓度的废水稀释液按照上述方法分别加入金黄色葡萄球菌标准菌液；

将配制的测定混合液、阳性对照液、阴性对照液加入到比色皿中，塞上塞子后放入已预热至37℃的微生物比浊测量仪中进行比浊测定，测定记录530nm处的吸光度值，其中，设定测定参数：培养温度37℃，振摇间隔时间5min，单次振摇时间20s，振摇频率0.2HZ，监测开始时间45min，监测间隔时间10min。振摇20s，清除本底值，开始实验，总实验时间4h。

本实施例中稀释1000倍的废水吸光度值为0.336，其吸光度值落入红霉素-金黄色葡萄球菌标准曲线的线性范围之内，将测定的吸光度值0.336代入式（Ⅲ）中，计算废水水样OTC-1针对G⁺的抗生素类物质的综合生物效能，即废水水样OTC-1针对G⁺的标准参照抗生素（红霉素）的残留生物效能，计算结果如表6所示。

实施例13-15土霉素生产废水残留综合生物效能的测定

除了从土霉素生产工厂的废水处理车间的调节池的出水处采集废水水样OTC-2、从土霉素生产工厂的废水处理车间的SBR反应器的出水处采集OTC-3、从土霉素生产工厂的废水处理车间的二沉池出水处采集OTC-4，实施例13中的废水水样（OTC-2）稀释倍数为1000倍，200min是测定的吸光度为0.358；实施例14中废水水样（OTC-3）的稀释倍数为200倍，200min是测定的吸光度为0.359；实施例15中废水水样（OTC-4）的稀释倍数为100倍，200min是测定的吸光度为0.307之外，其他与实施例12相同。

将测定的吸光度值分别代入式（Ⅲ）中，计算废水水样OTC-2、OTC-3、OTC-4针对G⁺的标准抗生素（红霉素）的残留生物效能（即残留生物效价），测定结果如表6所示。

实施例16土霉素生产废水残留综合生物效能的测定

1、采集废水水样

与实施例12相同；

2、富集抗生素类物质

与实施例12相同；

3、标准菌液配制

标准菌液配制步骤中大肠杆菌标准菌液配制与实施例1相同；

4、绘制标准参照抗生素工作曲线

1）四环素标准溶液配制

四环素标准溶液配制方法与实施例1的相同，用PBS（磷酸盐缓冲液，pH6.0）稀释得到浓度为10-20u/mL线性范围内的不同浓度梯度的四环素标准溶液，即稀释成10、12、14、16、18、20u/mL的6个浓度的四环素标准溶液；

2）配制测定混合液

分别取上述6个不同浓度的四环素标准溶液各1ml，然后向6个不同浓度的四环素标准溶液中分别加入9ml制备的大肠杆菌标准菌液，每个浓度的四环素标准溶液设5个平行，即浓度为10u/mL的四环素标准溶液取5ml，分成5份，每份1ml，向每一份四环素标准溶液中分别加入9ml的大肠杆菌标准菌液，其他浓度的四环素标准溶液按照上述方法分别加入大肠杆菌标准菌液；

3）配制阳性、阴性对照液

阳性对照液B：向1mlPBS（pH6.0）溶液中加入9ml大肠杆菌标准菌液；

阴性对照液B：向1mlPBS（pH6.0）溶液加入9ml不含任何试验菌的灭菌水（或抗生素Ⅲ号培养基）。

4）比浊测定

将配制的测定混合液、阳性对照液、阴性对照液加入到比色皿中，塞上塞子后放入已预热至37℃的微生物比浊测量仪中进行比浊测定，测定记录530nm处的吸光度值，其中，设定测定参数：培养温度37℃，振摇间隔时间5min，单次振摇时间20s，振摇频率0.2HZ，监测开始时间45min，监测间隔时间10min。振摇20s，清除本底值，开始实验，总实验时间4h。

5）数据处理

用仪器相应的工作站软件查看数据结果，一次实验给出20组不同时间的监测数据，选择200min时的数据，分别测得浓度为10-20u/mL线性范围内的不同浓度梯度的四环素标准溶液的吸光度值为：0.532、0.432、0.344、0.288、0.231、0.178，以四环素浓度的对数值为横坐标，以大肠杆菌与四环素的混合液的吸光度值为纵坐标绘制述大肠杆菌-四环素的标准曲线，四环素-大肠杆菌标准曲线如式（Ⅳ）所示，

y=-1.165x+1.691（Ⅳ）

其中：式（Ⅳ）的斜率为1.165；综合指标因子F为2.33；x为lnC，C为四环素的浓度；y为吸光度。

5、废水中抗生素及其相关物残留生物效能测定

将抗生素类富集物浓缩液稀释10倍、50倍、100倍，制成3个浓度系列；

分别取上述3个不同浓度的废水稀释液各1ml，然后向3个不同浓度的废水稀释液中分别加入9ml大肠杆菌标准菌液，每个浓度的废水稀释液设5个平行，即稀释10倍的废水稀释液取5ml，分成5份，每份1ml，向每一份中分别加入9ml的大肠杆菌标准菌液，其他浓度的废水稀释液按照上述方法分别加入大肠杆菌标准菌液；

将配制的测定混合液、阳性对照液、阴性对照液加入到比色皿中，塞上塞子后放入已预热至37℃的微生物比浊测量仪中进行比浊测定，测定记录530nm处的吸光度值，其中，设定测定参数：培养温度37℃，振摇间隔时间5min，单次振摇时间20s，振摇频率0.2HZ，监测开始时间45min，监测间隔时间10min。振摇20s，清除本底值，开始实验，总实验时间4h。

本实施例中稀释50倍的废水吸光度值为0.512，其吸光度值落入四环素-大肠杆菌标准曲线的线性范围之内，将测定的吸光度值0.512代入式（Ⅳ）中，计算废水水样OTC-1针对G^-的抗生素类物质的综合生物效能，即废水水样OTC-1针对G^-的标准参照抗生素（四环素）的残留生物效能，计算结果如表6所示。

实施例17-19土霉素生产废水残留综合生物效能的测定

除了从土霉素生产工厂的废水处理车间的调节池的出水处采集废水水样OTC-2、从土霉素生产工厂的废水处理车间的SBR反应器的出水处采集OTC-3、从土霉素生产工厂的废水处理车间的二沉池出水处采集OTC-4，实施例17中的废水水样（OTC-2）稀释倍数为25倍，200min是测定的吸光度为0.204；实施例18中废水水样（OTC-3）的稀释倍数为5倍，200min是测定的吸光度为0.216；实施例19中废水水样（OTC-4）的稀释倍数为5倍，200min是测定的吸光度为0.413之外，其他与实施例16相同。

将测定的吸光度值分别代入式（Ⅳ）中，计算废水水样OTC-2、OTC-3、OTC-4针对G^-的标准抗生素（四环素）的残留生物效能（即残留生物效价），测定结果如表6所示。

表6土霉素生产废水的残留生物效能（mg/L）

对含有不同种类抗生素的废水，通过标准参照抗生素针对G⁺、G^-的当量的测定，能够比较含有不同种类的抗生素废水的残留生物效能水平。表5和表6所示的两种废水的针对G⁺的标准抗生素（红霉素）效价当量值比较可以看出，土霉素生产废水的残留生物效能水平明显高于螺旋霉素生产废水，从而有助于研究和评价抗生素废水对环境的微生物生态效应。

利用标准抗生素比较了土霉素和螺旋霉素两种抗生素废水的效价，发现土霉素废水的效价明显高于螺旋霉素，表明土霉素废水的生物效能高于螺旋霉素废水，说明本发明方法能够比较不同类的抗生素废水的残留生物效能，从而评价哪类抗生素废水危害更大、对环境影响更大等。

实施例20螺旋霉素、巴龙霉素混合生产废水残留综合生物效能的测定

本发明实施例以螺旋霉素、巴龙霉素混合生产的废水为例进行详细说明，螺旋霉素、巴龙霉素混合生产废水的处理流程如图4所示，螺旋霉素、巴龙霉素混合生产废水依次通过调节池、上流式厌氧污泥床（UASB，Up-flowAnaerobicSludgeBed/Blanket）、缺氧池、好氧池、二沉池后，达到《发酵类制药工业水污染物排放标准GB21903-2008》排放标准，直接排放，其中：MW1为进入调节池之前的螺旋霉素、巴龙霉素混合废水；MW2为经过厌氧污泥床处理后的厌氧出水；MW3为经过缺氧池处理后的出水；MW4为经过好氧池处理的出水。采用自动采样器采集废水水样。

1、采集废水水样

将从螺旋霉素、巴龙霉素生产工厂的混合废水处理车间的进水口，即在螺旋霉素、巴龙霉素混合废水进入调节池时采集废水水样（MW1），通过GF/F滤纸，去除混合废水中的悬浮物，得到过滤废水水样。

2、富集抗生素类物质

将过滤后的MW1废水水样50ml加入到活化的HLB固相萃取柱中，待样品全部吸附后，依次以2*3ml甲醇/乙酸乙酯混合溶剂（V/V=1/1）、2*3ml含有1%氨水的甲醇（v/v）为洗脱液进行洗脱，合并洗脱液，用氮气吹干，得到抗生素类富集物；

加入超纯水溶解抗生素类富集物，振荡、混匀，定容至2ml，制得抗生素类富集物浓缩液，备用。

3、标准菌液配制

革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌标准菌液的配制与实施例1相同。

4、绘制标准参照抗生素工作曲线

标准参照抗生素工作曲线绘制步骤与实施例7相同，红霉素-金黄色葡萄球菌工作曲线如式（Ⅲ）所示：

y=-0.412x+0.175（Ⅲ）

其中，式（Ⅱ）的斜率为0.412；综合指标因子F为2.75；x为lnC，C为红霉素的浓度；y为吸光度。

5、废水中抗生素及其相关物残留生物效能（生物活性）测定

将抗生素类富集物浓缩液稀释10倍、50倍、100倍，制成3个浓度系列；

分别取上述3个不同浓度的废水稀释液各1ml，然后向3个不同浓度的废水稀释液中分别加入9ml制备的金黄色葡萄菌标准菌液，每个浓度的废水稀释液设5个平行，即稀释10倍的废水稀释液取5ml，分成5份，每份1ml，向每1份废水稀释液中分别加入9ml的金黄色葡萄菌标准菌液，其他浓度的废水稀释液按照上述方法分别加入金黄色葡萄菌标准菌液；

将配制的测定混合液、阳性对照液、阴性对照液加入到比色皿中，塞上塞子后放入已预热至37℃的微生物比浊测量仪中进行比浊测定，测定记录530nm处的吸光度值，其中，设定测定参数：培养温度37℃，振摇间隔时间5min，单次振摇时间20s，振摇频率0.2HZ，监测开始时间45min，监测间隔时间10min。振摇20s，清除本底值，开始实验，总实验时间4h。

本实施例中稀释100倍的废水吸光度值为0.286，其吸光度值落入红霉素-金黄色葡萄球菌标准曲线的线性范围之内，将测定的吸光度值0.286代入式（Ⅲ）中，计算废水水样MW1针对G⁺的抗生素类物质的综合生物效能，即废水水样MW1针对G⁺的标准参照抗生素（红霉素）的残留生物效能，计算结果如表7所示。

实施例21-23螺旋霉素-巴龙霉素生产废水残留综合生物效能的测定

除了从螺旋霉素-巴龙霉素生产工厂的废水处理车间的UASB出水处采集废水水样MW2、从螺旋霉素-巴龙霉素生产工厂的废水处理车间的缺氧池出水处采集废水MW3、从螺旋霉素-巴龙霉素生产工厂的废水处理车间的好氧池出水处采集废水MW4，实施例21中的废水水样（MW2）稀释倍数为50倍，200min是测定的吸光度为0.402；实施例22中废水水样（MW3）的稀释倍数为20倍，200min是测定的吸光度为0.290；实施例23中废水水样（MW4）的稀释倍数为20倍，200min是测定的吸光度为0.300之外，其他与实施例20相同。

将测定的吸光度值分别代入式（Ⅲ）中，计算废水水样MW2、MW3、MW4针对G⁺的标准抗生素（红霉素）的残留生物效能（即残留生物效价），测定结果如表7所示。

实施例24螺旋霉素-巴龙霉素生产废水残留综合生物效能的测定

采集废水水样、富集抗生素类物质的步骤与实施例20相同；

标准菌液配制步骤中大肠杆菌标准菌液配制与实施例1相同；

绘制标准参照抗生素工作曲线步骤中“大肠杆菌-四环素的标准曲线”与实施例16相同，四环素-大肠杆菌标准曲线如式（Ⅳ）所示，

y=-1.165x+1.691（Ⅳ）

其中：式（Ⅳ）的斜率为1.165；综合指标因子F为2.33；x为lnC，C为四环素的浓度；y为吸光度。

废水中抗生素及其相关物残留生物效能测定步骤按照如下步骤进行：

将抗生素类富集物浓缩液稀释10倍、50倍、100倍，制成3个浓度系列；分别取上述3个不同浓度的废水稀释液各1ml，然后向3个不同浓度的废水稀释液中分别加入9ml大肠杆菌标准菌液，每个浓度的废水稀释液设5个平行，即稀释10倍的废水稀释液取5ml，分成5份，每份1ml，向每一份中分别加入9ml的大肠杆菌标准菌液，其他浓度的废水稀释液按照上述方法分别加入大肠杆菌标准菌液；

将配制的测定混合液、阳性对照液、阴性对照液加入到比色皿中，塞上塞子后放入已预热至37℃的微生物比浊测量仪中进行比浊测定，测定记录530nm处的吸光度值，其中，设定测定参数：培养温度37℃，振摇间隔时间5min，单次振摇时间20s，振摇频率0.2HZ，监测开始时间45min，监测间隔时间10min。振摇20s，清除本底值，开始实验，总实验时间4h。

本实施例中废水稀释成100倍的废水吸光度值为0.288，其吸光度值落入大肠杆菌-四环素标准曲线的线性范围之内，将测定的吸光度值0.288代入式（Ⅵ）中，计算废水水样MW1针对G^-的抗生素类物质的综合生物效能，即废水水样MW1针对G^-的标准参照抗生素（四环素）的残留生物效能，计算结果如表7所示。

实施例25-27螺旋霉素-巴龙霉素生产废水残留综合生物效能的测定

除了从螺旋霉素-巴龙霉素生产工厂的废水处理车间的UASB出水处采集废水水样MW2、从螺旋霉素-巴龙霉素生产工厂的废水处理车间的缺氧池出水处采集废水MW3、从螺旋霉素-巴龙霉素生产工厂的废水处理车间的好氧池出水处采集废水MW4，实施例25中的废水水样（MW2）稀释倍数为20倍，200min是测定的吸光度为0.475；实施例26中废水水样（MW3）的稀释倍数为10倍，200min是测定的吸光度为0.227；实施例27中废水水样（MW4）的稀释倍数为10倍，200min是测定的吸光度为0.297之外，其他与实施例24相同。

将测定的吸光度值分别代入式（Ⅳ）中，计算废水水样MW2、MW3、MW4针对G^-的标准抗生素（四环素）的残留生物效能（即残留生物效价），测定结果如表7所示。

不同标准抗生素分别代表针对G⁺、G^-的生物效能，抗生素对G⁺和G^-的作用机制不同，分为窄谱（比如螺旋霉素，抑制革兰氏阳性菌和少数革兰氏阴性菌）和广谱（比如对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制的土霉素），因此结果是不同的。对含有不同类抗生素的混合废水，通过标准抗生素效价当量的测定，能够综合评价混合抗生素废水的残留生物效能水平，并与其他废水进行比较评价处理效果。

本发明除了测定螺旋霉素、巴龙霉素、红霉素、土霉素之外，还可以用于测定庆大霉素、青霉素、卡那霉素、四环素、核糖霉素、盐酸去甲万古霉素、链霉素、卷曲霉素、泰乐菌素、盐酸大观霉素、麦白霉素、吉他霉素、林可霉素、克拉霉素、磷霉素、硫酸新霉素、硫酸小诺霉素、阿奇霉素等的残留生物效能的测定。

对照例1

对实施例2-6从螺旋霉素生产工厂的废水处理车间的进水口、UASB出水、缺氧池出水、好氧池出水、二沉池出水处采集废水水样（SPM-1、SPM-2、SPM-3、SPM-4、SPM-5）分别制成抗生素类富集物浓缩液用超高效液相色谱（WatersUPLC）-串联质谱仪进行分析。

1）配制标准抗生素溶液

精确称取标准效价为1348u/mL的螺旋霉素标准品，用甲醇溶解，配制成1000mg/L的标准螺旋霉素贮备液。

使用时将标准贮备液用乙腈/0.1%的甲酸水溶液(v/v=1：1)稀释成浓度为10、20、50、100、200、500、1000μg/L的标准螺旋霉素稀释液。

2）绘制螺旋霉素标准曲线

采用超高效液相色谱（WatersUPLC）-串联质谱仪测定不同浓度螺旋霉素标准溶液的峰面积，根据所得浓度与峰面积的数据，以螺旋霉素标准溶液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制UPLC标准曲线，螺旋霉素的UPLC标准曲线如式（Ⅴ）所示：

y=420.3x+4942（Ⅴ）

其中，式（Ⅴ）的斜率为420.3，线性相关系数r²为0.992，检出限为1.0μg/L；信噪比S/N≥3；x为螺旋霉素的浓度；y为峰面积。

色谱条件为：WatersXterraMSC18柱（50mm×2.1mm，2.5μm孔径）以及Phenomenex保护柱（4mm×2.1mm,Torrance,CA,USA），柱温45℃；流速0.32mL/min；进样量20μL。梯度洗脱条件：A相为0.1%甲酸溶于水，B相为0.1%甲酸溶于乙腈；0分钟A-B(80:20)，12分钟A-B(65:35)，13分钟A-B(80:20)；10分钟柱平衡。

质谱条件为：电喷雾离子源，正电子扫描，单离子监测法（SIM），定性、定量离子对为843.7/422.5，锥孔电压为25、50v。

3）样品测定

利用超高效液相色谱（WatersUPLC）-串联质谱仪分布测定稀释10倍、50倍、100倍的废水样品SPM-1、SPM-2、SPM-3、SPM-4、SPM-5中螺旋霉素的峰面积，将测定的废水中螺旋霉素的峰面积带入式（Ⅳ）中，计算，分布得到废水样品SPM-1、SPM-2、SPM-3、SPM-4、SPM-5中螺旋霉素的浓度，计算结果如表4所示。

试验例回收率试验

1、精确称取土霉素盐酸盐标准品（≥95%(HPLC),crystalline(Sigma)），加入灭菌水定容至50ml，配制成1000mg/L的土霉素贮备液；

2、用超纯水将土霉素贮备液稀释成50mg/L、20mg/L、10mg/L、2mg/L的4个不同浓度的土霉素溶液（OTC-1、OTC-2、OTC-3、OTC-4），备用；

3、依次向HLB固相萃取柱中通入2*3ml的甲醇/乙酸乙酯混合溶剂（V/V=1/1）；2*3ml含有1%氨水的甲醇（v/v）；2*3mlpH为4的超纯水，对HLB固相萃取柱进行活化处理，制得活化HLB固相萃取柱；

4、分别取不同浓度的土霉素溶液各20ml，用40%H₂SO₄调节pH至2.50-3.00，加入0.01g的Na₂-EDTA，溶解均匀，然后分别加入到不同的活化HLB固相萃取柱中，待样品全部吸附后，以二氯甲烷/丙酮（v/v=3/2）为洗脱液进行洗脱，合并洗脱液，氮气吹干洗脱液，分别得到5个经HLB柱固相萃取后的土霉素富集物；

5、分别向土霉素富集物中加入体积百分比浓度为40%的甲醇水溶液，溶解，振荡、混匀，定容至2ml，制得相应的土霉素富集物浓缩液（OTC-A、OTC-B、OTC-C、OTC-D），备用；

6、金黄色葡萄球菌标准菌液配制与实施例1相同；红霉素-金黄色葡萄球菌标准曲线的绘制与实施例7相同，红霉素-金黄色葡萄球菌标准曲线如式（Ⅱ）所示，

y=-0.420x+0.167（Ⅱ）

其中：式（Ⅱ）的斜率为0.420；综合指标因子F为2.80；x为lnC，C为红霉素的浓度；y为吸光度；土霉素-金黄色葡萄球菌标准曲线的绘制与实施例1相同，土霉素-金黄色葡萄球菌标准曲线如式（Ⅵ）所示，

y=-0.328x+0.055（Ⅵ）

其中：式（Ⅵ）的斜率为0.328；综合指标因子F为1.312；x为lnC，C为土霉素的浓度；y为吸光度；

7、分别取上述步骤2配制的土霉素标准溶液及经HLB柱固相萃取后溶解得到的相应的土霉素富集物浓缩液各1ml，然后分别加入实施例1中制备的金黄色葡萄球菌标准菌液9ml，混合均匀；

将配制的测定混合液加入到比色皿中，塞上塞子后放入已预热至37℃的微生物比浊测量仪中进行比浊测定，测定记录530nm处的吸光度值，其中，设定测定参数：培养温度37℃，振摇间隔时间5min，单次振摇时间20s，振摇频率0.2HZ，监测开始时间45min，监测间隔时间10min。振摇20s，清除本底值，开始实验，总实验时间4h；监测波长为530nm；

8、测定的土霉素标准溶液和相应的经HLB柱固相萃取后的土霉素富集物浓缩液针对G⁺的标准抗生素（红霉素）的吸光度值见表8。

表8土霉素溶液针对G⁺的标准抗生素（红霉素）的吸光度值

将表8中所列的吸光度值分别代入式（Ⅱ），计算土霉素溶液针对G⁺的标准抗生素（红霉素）的残留生物效能（残留生物效价）；

表9土霉素溶液针对G⁺的土霉素的吸光度值

将表9中所列的吸光度值分别代入式（Ⅵ），计算土霉素溶液针对G⁺的土霉素的残留生物效能（残留生物效价）；

将土霉素溶液SPE前后测定得到的两组效价当量值进行比较，计算回收率，结果如表10所示。

表10土霉素溶液的SPE处理后的回收率（％）

土霉素效价回收率达到99%-130%，试验结果表明本发明方法评估抗生素残留生物效能的结果准确度高，可以用于测定抗生素生物效能。

本发明针对废水成分复杂可能对抗生素效价测定造成影响的问题，以SPE法富集和纯化废水中的抗生素，然后根据微生物浊度法建立评估废水中抗生素残留生物效价的方法，本发明方法可靠性、准确度高，具有普遍适用性，普适性高，能够用于评估任何废水中抗生素类物质的生物效价。不仅能够对抗生素生产废水及处理出水进行前处理与残留生物效能测定，也能对不同类型抗生素废水进行比较或是对含有多种抗生素的混合废水进行综合评价。

Claims (8)

1.一种评估废水中抗生素的残留生物效能的方法，其特征是，包括如下顺序进行的步骤：

1)采用比浊法筛选针对革兰氏阳性菌的标准参照抗生素，并获得革兰氏阳性菌-标准参照抗生素标准曲线；其中，所述标准参照抗生素的筛选包括如下顺序进行的步骤：

1A)将革兰氏阳性菌接种于抗生素Ⅲ号培养基中，摇匀，培养，制得革兰氏阳性菌标准菌液，备用；

1B)精确称取不同抗生素标准品，溶解，分别配制成不同浓度的抗生素溶液，接着加入革兰氏阳性菌菌液，混匀后在530nm波长下进行比浊测定，测定革兰氏阳性菌与不同浓度的抗生素溶液的混合液的吸光度值；其中，所述抗生素标准品选择红霉素、螺旋霉素、巴龙霉素、核糖霉素、土霉素、四环素、链霉素、卡那霉素；

1C)以抗生素浓度的对数值为横坐标，以革兰氏阳性菌与抗生素的混合液的吸光度值为纵坐标绘制所述革兰氏阳性菌-抗生素的标准曲线；

1D)根据得到的革兰氏阳性菌-抗生素的标准曲线，以标准曲线的斜率以及综合因子作为筛选依据，筛选得到针对革兰氏阳性菌的标准参照抗生素为红霉素，其中所述综合因子为革兰氏阳性菌-抗生素的标准曲线的线性浓度范围内的高浓度与低浓度比值与标准曲线的斜率之积；

2)富集和纯化废水中的抗生素类物质，获得抗生素类富集物；

3)无菌水溶解抗生素类富集物后加入革兰氏阳性菌菌液，混匀，采用比浊法测定吸光度；

4)将测定得到的吸光度值代入革兰氏阳性菌-标准参照抗生素的标准曲线中，获得废水中抗生素类物质的综合生物效能。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤1A)中所述培养的温度为35-37℃。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征是步骤1A)中所述革兰氏阳性菌标准菌液在波长530nm处的吸光度达到0.3-0.7。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征是所述革兰氏阳性菌选择金黄色葡萄球菌。

5.一种评估废水中抗生素的残留生物效能的方法，其特征是包括如下顺序进行的步骤：

(1)采用比浊法筛选针对革兰氏阴性菌的标准参照抗生素，并获得革兰氏阴性菌-标准参照抗生素标准曲线；其中，所述标准参照抗生素的筛选包括如下顺序进行的步骤：

(1A)将革兰氏阴性菌接种于抗生素Ⅲ号培养基中，摇匀，培养，制得革兰氏阴性菌标准菌液，备用；

(1B)精确称取不同抗生素标准品，溶解，分别配制成不同浓度的抗生素溶液，接着加入革兰氏阴性菌菌液，混匀后在530nm波长下进行比浊测定，测定革兰氏阴性菌与不同浓度的抗生素溶液的混合液的吸光度值；其中，所述抗生素标准品选择红霉素、螺旋霉素、巴龙霉素、核糖霉素、土霉素、四环素、链霉素、卡那霉素；

(1C)以抗生素浓度的对数值为横坐标，以革兰氏阴性菌与抗生素的混合液的吸光度值为纵坐标绘制所述革兰氏阴性菌-抗生素的标准曲线；

(1D)根据得到的革兰氏阴性菌-抗生素的标准曲线，以标准曲线的斜率以及综合因子作为筛选依据，筛选得到针对革兰氏阴性菌的标准参照抗生素为四环素，其中，所述综合因子为革兰氏阴性菌-抗生素的标准曲线的线性浓度范围内的高浓度与低浓度比值与标准曲线的斜率之积；

(2)富集和纯化废水中的抗生素类物质，获得抗生素类富集物；

(3)无菌水溶解抗生素类富集物后加入革兰氏阴性菌菌液，混匀，采用比浊法测定吸光度；

(4)将测定得到的吸光度值代入革兰氏阴性菌-标准参照抗生素的标准曲线中，获得废水中抗生素类物质的综合生物效能。

6.如权利要求5所述的方法，其特征是步骤(1A)中所述革兰氏阴性菌标准菌液在波长530nm处的吸光度达到0.3-0.7。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征是所述革兰氏阴性菌选择大肠杆菌。

8.如权利要求1或5所述的方法，其特征是步骤2)中采用固相萃取法对废水进行富集和纯化，得到所述抗生素类富集物。