CN111157463B - 血浆中乙酰螺旋霉素含量的检测方法 - Google Patents

血浆中乙酰螺旋霉素含量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种血浆中乙酰螺旋霉素含量的检测方法。该方法包括以下步骤：(A)制备微生物悬液；(B)制备标准曲线：分别向微生物悬液中加入梯度浓度的乙酰螺旋霉素，培养，测定吸光度，制备得到标准曲线；(C)样品采集：采集血浆；(D)分别精密量取待测血浆样品和空白血浆样品，加入步骤(A)的微生物悬液中混匀，得待测混合溶液和空白对照；(E)测定待测混合溶液的微生物浓度；(F)将待测混合溶液的微生物浓度与空白对照进行比较，通过标准曲线计算得出乙酰螺旋霉素的浓度。本发明方法的分析时间短、灵敏度高，准确度、精密度、回收率、稳定性经考察后均符合要求，适用于乙酰螺旋霉素在体内的药代动力学试验研究。

Description

血浆中乙酰螺旋霉素含量的检测方法
技术领域
本发明涉及抗生素类药物的血药浓度监测技术领域，特别是涉及一种血浆中乙酰螺旋霉素含量的检测方法。
背景技术
乙酰螺旋霉素(Acetylspiramycin)是由单乙酰螺旋霉素Ⅱ、单乙酰螺旋毒素Ⅲ、双乙酰螺旋霉素Ⅱ和双乙酰螺旋霉素Ⅲ四个组分为主的混合物，结构和成分复杂，具体结构如式1所示。纯品为白色至微黄色粉末，在甲醇、乙醇、丙酮或乙醚中溶解，在水中几乎不溶，在石油醚中不溶。对紫外线敏感，在阳光下照射1天，可分解50％。乙酰螺旋霉素对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌和梭菌属等有较强的抗菌活性，对李斯特菌属、卡他布兰汉菌、淋球菌、胎儿弯曲菌、流感杆菌、百日咳杆菌、类杆菌属、产气荚膜杆菌、痤疮丙酸杆菌、消化球菌和消化链球菌以及支原体、衣原体、梅毒螺旋体、弓形体、隐孢子虫等也有较强的作用。
由于厂家生产工艺和原料的差异，不同厂家生产的乙酰螺旋霉素其组分的比例各不相同，而目前并无研究阐明各组分与其药效的具体关系，故一般的化学分析方法或高效液相色谱法等检测方法无法通过对各组分的分别定量构建统一的乙酰螺旋霉素的量效关系。而本方法基于乙酰螺旋霉素的抑菌作用，无需考虑其组分比例，因而可用于建立具有普适性的量效关系。
Figure BDA0001858405200000011
Figure BDA0001858405200000021
Figure BDA0001858405200000022
发明内容
基于此，本发明提供一种血浆中乙酰螺旋霉素含量的检测方法。该方法准确、快速、特异性强，具有较高的专属性。
具体技术方案如下：
一种血浆中乙酰螺旋霉素含量的检测方法，包括以下步骤：
(A)制备微生物悬液；
(B)制备标准曲线：分别向微生物悬液中加入梯度浓度的乙酰螺旋霉素，培养，测定吸光度，制备得到标准曲线；
(C)样品采集：采集血浆；
(D)分别精密量取待测血浆样品和空白血浆样品，加入步骤(A)的微生物悬液中混匀，得待测混合溶液和空白对照；
(E)测定待测混合溶液的微生物浓度；
(F)将待测混合溶液的微生物浓度与空白对照进行比较，通过标准曲线计算得出乙酰螺旋霉素的浓度。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明建立了采用微生物比浊法测定人或动物血浆中乙酰螺旋霉素含量的方法，其测定原理与临床应用的要求一致，能准确直观地反映抗生素的医疗价值，且对供试品的纯度要求不高，既适用于精制品，又适用于制剂。此外，本方法无需考虑乙酰螺旋霉素的组分比例，因而可用于建立具有普适性的量效关系。本发明方法的分析时间短、灵敏度高，准确度、精密度、回收率、稳定性经考察后均符合要求。本方法具有很高的专属性和很好的重复性，大大提高了检测结果的准确度。本发明检测方法的线性范围为0.25μg/ml～7.5μg/ml，检测下限为0.25μg/ml，适用于人或动物血浆中乙酰螺旋霉素的含量测定，适用于乙酰螺旋霉素在体内的药代动力学试验研究。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供了一种血浆中乙酰螺旋霉素含量的检测方法，包括以下步骤：
(A)制备微生物悬液；
(B)制备标准曲线：分别向微生物悬液中加入梯度浓度的乙酰螺旋霉素，培养，测定吸光度，制备得到标准曲线；
(C)样品采集：采集血浆；
(D)分别精密量取待测血浆样品和空白血浆样品，加入步骤(A)的微生物悬液中混匀，得待测混合溶液和空白对照；
(E)测定待测混合溶液的微生物浓度；
(F)将待测混合溶液的微生物浓度与空白对照进行比较，通过标准曲线计算得出乙酰螺旋霉素的浓度。
在其中一个实施例中，步骤(A)中，所述微生物悬液按以下步骤制备：
A1：取微生物接种在营养琼脂斜面上；
A2：35-37℃恒温培养20-22小时，于2-8℃临时保存；
A3：用灭菌水或(0.9±0.1)％氯化钠溶液将微生物洗下，备用；
A4：将步骤A3得到的微生物移入经灭菌的置有营养肉汤的试管中，振摇成均匀的菌液。
优选地，该检测方法的步骤(A)中，所述微生物悬液按以下步骤制备：
A1：取金黄色葡萄球菌的营养琼脂斜面培养物，接种营养琼脂斜面上；
A2：在35-37℃的恒温培养箱培养20-22小时，放2-8℃冰箱临时保存；
A3：临用时，用灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用；
A4：A3得到的菌苔移入经灭菌的置有营养肉汤的试管中，振摇成均匀的菌液。
在其中一个实施例中，步骤(B)中，所述制备标准曲线包括以下步骤：
B1：称取乙酰螺旋霉素对照品，用溶剂溶解，用灭菌水稀释为特定浓度溶液；优选地，每5mg乙酰螺旋霉素对照品加入溶剂(2±0.2)ml；优选地，所述溶剂为乙醇；
B2：移取适量B1所得溶液，用缓冲液稀释，得不同浓度的标准系列溶液；优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；进一步优选地，所述磷酸盐缓冲液的pH＝7-8；优选的pH＝7.8。
B3：在不同容器中精密量取微生物悬液，分别加入等体积的空白血浆和等体积的标准系列溶液，混合均匀。
优选地，该检测方法的步骤(B)中，所述制备标准曲线包括以下步骤：
B1：称定10mg乙酰螺旋霉素对照品，用乙醇使溶解(每5mg加乙醇2ml)，并用灭菌水定容至10ml，得浓度为1mg/ml；
B2：移取适量上述溶液，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.8)稀释定容得不同浓度浓度的标准系列溶液；
B3：在各试管内精密加入含微生物的液体培养基100μl，再分别精密取血浆和标准系列溶液各100μl，充分振摇。
在其中一个实施例中，步骤(D)中，所述空白对照由以下步骤制备：精密吸取一定体积微生物悬液，加入等体积空白血浆和等体积磷酸盐缓冲液，充分振摇。
在其中一个实施例中，步骤(E)中，所述测定待测混合溶液的微生物浓度按以下步骤进行：
E1：将步骤(D)的待测混合溶液于35-40℃恒温震荡培养3-5小时，取出，加入甲醇水溶液，放置5min-20min；甲醇水溶液的体积浓度为20-40％；所述甲醇水溶液的目的是阻止微生物生长。
E2：在入＝(570±5)nm处测定吸光度；所述吸光度优选为0.3-0.7；测定吸光度的仪器优选为酶标仪，酶标仪型号优选为ELX600。
在其中一个实施例中，所述血浆来自于人或动物；所述微生物为金黄色葡萄球菌。
优选地，该检测方法的步骤(E)中，测定待测混合溶液的微生物浓度按以下步骤进行：
精密加入含金黄色葡萄球菌悬液100μl；分别精密量取血样样品和磷酸盐缓冲液各100μl，充分振摇；放入37℃的恒温震荡器中震荡培养4.5小时，取出立即加入体积浓度30％的甲醇水溶液50μl以终金黄色葡萄球菌生长，放置10min后，在入＝570nm处测定吸收值。
本发明提供了一种检测血浆中乙酰螺旋霉素含量的方法，该方法准确、快速、特异性强，具有较高的专属性。具体包括以下步骤：
(一)培养基配制
葡萄糖MH肉汤：精密称取MH肉汤42.3g和无水葡萄糖20.1g后，加入超纯水1000mL配制比例进行调配，搅拌加热煮沸至完全溶解，115℃30min高压灭菌。
葡萄糖MH琼脂：精密称取MH琼脂38.0g的2％技术琼脂粉和无水葡萄糖10.0g后，加入超纯水1000mL配制比例进行调配，搅拌加热煮沸至完全溶解，115℃30min灭菌。
金黄色葡萄球菌悬液：取金黄色葡萄球菌的营养琼脂斜面培养物，接种营养琼脂斜面上，在35～37℃的恒温培养箱培养20-22小时。临用时，用灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用，移入经灭菌的置有营养肉汤的试管中，振摇成均匀的菌液，测得在λ＝570nm处测定吸收值为0.5。
(二)标准曲线与定量范围
精密称定10mg乙酰螺旋霉素对照品，用乙醇使溶解(每5mg加乙醇2ml)，并用灭菌水定容至10ml，得浓度为1mg/ml的乙酰螺旋霉素对照品溶液(效价为：1324/mg)。分别精密移取适量上述溶液，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.8)稀释定容得浓度分别为0.25、0.5、1、2、3、4、5、7.5μg/ml的标准系列溶液。在各试管内精密加入含金黄色葡萄球菌的液体培养基100μl，再分别精密取血浆和标准系列溶液各100μl，充分振摇，照“(三)样品测定”项方法培养并测定吸光度(Y值)，以浓度的对数值(X值)为横坐标，(Y值)为纵坐标，进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b。
(三)样品测定
在各试管内精密加入含金黄色葡萄球菌悬液100μl，再分别精密量取血样样品和磷酸盐缓冲液各100μl，充分振摇。放入37℃的恒温震荡器中震荡培养4.5小时，取出立即加入体积浓度30％的甲醇水溶液50μl以终止微生物生长，放置10min后，在λ＝570nm处测定吸收值。
将待测目标物吸收值y代入上述步骤“(二)标准曲线与定量范围”项的标准曲线方程中，通过计算得到待检测样品中目标物相对浓度x，由此计算得到该样本中待检测血液中的乙酰螺旋霉素药物浓度。
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
菌株、材料与仪器：
测定仪器：采用酶标仪，型号为ELX600。
恒温培养箱：型号为GHP-9160，生产厂家：上海一恒科技有限公司。
金黄色葡萄球菌：编号：122759；来源：由广州陆军总医院检验科提供。
乙酰螺旋霉素对照品：提供单位：广州白云山医药集团股份有限公司白云山制药总厂。
MH琼脂：批号为3103237，规格为250g/瓶，生产厂家为广东环凯微生物科技有限公司，储存条件为避光、阴凉、干燥。
MH肉汤：批号为3104033，规格为100g/瓶，生产厂家为广东环凯微生物科技有限公司，储存条件为避光、阴凉、干燥。
灭菌水：培养基、比色皿、水等均采用115℃30min灭菌。
空白血浆：采集于人或动物。
实施例1
(一)培养基配制
营养肉汤：精密称取MH肉汤42.3g和无水葡萄糖20.1g后，加入超纯水1000mL配制比例进行调配，搅拌加热煮沸至完全溶解，115℃30min高压灭菌。
葡萄糖MH琼脂：精密称取MH琼脂38.0g和无水葡萄糖10.0g后，加入超纯水1000mL配制比例进行调配，搅拌加热煮沸至完全溶解，115℃30min灭菌。
金黄色葡萄球菌悬液：取金黄色葡萄球菌的营养琼脂斜面培养物，接种营养琼脂斜面上，在35-37℃的恒温培养箱培养20-22小时。临用时，用灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用；移入经灭菌的置有营养肉汤的试管中，振摇成均匀的菌液，测得在λ＝570nm处测定吸收值为0.5。
(二)标准曲线与定量范围
空白对照：精密加入含金黄色葡萄球菌悬液100μl，再分别精密量取药品稀释剂(空白血浆)和磷酸盐缓冲液各100μl，充分振摇。
标准曲线：精密称定10mg乙酰螺旋霉素对照品，用乙醇使溶解(每5mg加乙醇2ml)，并用灭菌水定容至10ml，得浓度为1mg/ml的乙酰螺旋霉素对照品溶液(效价为：1324/mg)。分别精密移取适量上述溶液，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.8)稀释定容得浓度分别为0.25、0.5、1、2、3、4、5、7.5μg/ml的标准系列溶液。在各试管内精密加入含金黄色葡萄球菌的液体培养基100μl，再分别精密取空白血浆和标准系列溶液各100μl，充分振摇，培养一段时间后，测定吸光度(Y值)，以浓度的对数值(X值)为横坐标，(Y值)为纵坐标，进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b。
实施例2
按实施例1所述的方法制备标准曲线和空白对照，其中测定吸光度前的培养时间为4.5h。
血样采集：采集给药后的Beagle犬血浆。
在各试管内精密加入含金黄色葡萄球菌悬液100μl，再分别精密量取Beagle犬血样样品和磷酸盐缓冲液各100μl，充分振摇。放入37℃的恒温震荡器中震荡培养4.5小时，取出立即加入体积浓度30％的甲醇水溶液50μl以终止微生物生长，放置10min后，在λ＝570nm处测定吸收值。检测Beagle犬血浆中乙酰螺旋霉素浓度，在其环境下可做到最低定量下限为0.25μg/ml。
实施例3
按实施例1所述的方法制备标准曲线和空白对照，其中测定吸光度前的培养时间为4.5h。
血样采集：采集给药后的人体血浆。
在各试管内精密加入含金黄色葡萄球菌悬液100μl，再分别精密量取人血样样品和磷酸盐缓冲液各100μl，充分振摇。放入37℃的恒温震荡器中震荡培养4.5小时，取出立即加入体积浓度30％的甲醇水溶液50μl以终止微生物生长，放置10min后，在λ＝500nm处测定吸收值。检测人血浆中乙酰螺旋霉素浓度，在其环境下可测浓度为7.5μg/ml。
实施例4
按实施例1所述的方法制备标准曲线和空白对照，其中测定吸光度前的培养时间为6h。
血样采集：采集给药后的Beagle犬血浆。
在各试管内精密加入含金黄色葡萄球菌悬液100μl，再分别精密量取Beagle犬血样样品和磷酸盐缓冲液各100μl，充分振摇。放入37℃的恒温震荡器中震荡培养6.0小时，取出立即加入体积浓度30％的甲醇水溶液50μl以终止微生物生长，放置10min后，在λ＝500nm处测定吸收值。检测血浆中乙酰螺旋霉素浓度，通过稀释，在其环境下可测浓度2.0g/ml。
实施例5本发明方法的线性关系和定量限
精密称定10mg乙酰螺旋霉素对照品，用乙醇使溶解(每5mg加乙醇2ml)，并用灭菌水定容至10ml，得浓度为1mg/ml的乙酰螺旋霉素对照品溶液(效价为：1324/mg)。分别精密移取适量上述溶液，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.8)稀释定容得浓度分别为0.25、0.5、1、2、3、4、5、7.5μg/ml的标准系列溶液。在各试管内精密加入含金黄色葡萄球菌的液体培养基100μl，再分别精密取待测血浆和标准系列溶液各100μl，充分振摇，培养并测定吸光度(Y值)，以浓度的对数值(X值)为横坐标，(Y值)为纵坐标，进行线性回归，得到标准曲线，结果表明乙酰螺旋霉素的线性范围和定量限如下：
(1)检测限(LOD)：0.25μg/ml。
(2)定量下限(LLOQ)：0.25μg/ml。
(3)线性范围：乙酰螺旋霉素在0.25μg/ml-7.5μg/ml范围内线性良好，相关系数R2＝0.9906＞0.99。
实施例6专属性检测
在各试管内精密加入空白血浆100μl，再分别精密量取含菌液培养基和空白培养基各100μl，充分振摇，照实施例2方法培养并测定吸光度(Y值)。金葡萄球菌在空白葡萄糖MH肉汤和人或动物空白血浆中无抑菌作用，专属性良好，试验结果见表1。
表1乙酰螺旋霉素专属性试验结果(n＝6)
Figure BDA0001858405200000091
实施例7精密度与准确度测试
按实施例1中(二)“标注曲线与定量范围”项下分别配制低、中、高3个浓度(0.5，2，5μg/ml)的质量控制样品(QC)，每一浓度6样本分析，按实施例1所述方法进行测定，连续测定3天。其日内精密度如下表2。乙酰螺旋霉素样品(5μg/ml)日内精密度RSD为3.7％-7.3％，乙酰螺旋霉素样品(2μg/ml)日内精密度RSD为4.3％-10.0％，RSD≤15％；接近定量下限的乙酰螺旋霉素样品(0.5μg/ml)日内精密度RSD为2.5％-10.3％，RSD≤20％。
表2乙酰螺旋霉素血浆样品日内精密度结果表(n＝6)
Figure BDA0001858405200000101
实施例8回收率测试
按实施例1中(二)“标注曲线与定量范围”项下分别配制低、中、高3个浓度(0.5，2，5μg/ml)的质量控制样品(QC)，每一浓度6样本分析，按实施例1所述方法进行测定，根据当日标准曲线计算QC样品值，回收率＝测得量/加入量*100％，其回收率如下表3。乙酰螺旋霉素样品(5μg/ml)回收率为93.2-109.0％，乙酰螺旋霉素样品(2μg/ml)回收率为93.1-106.2％；接近定量下限的乙酰螺旋霉素样品(0.5μg/ml)回收率为85.1-90.9％，RSD≤15％，因此回收率试验结果合格。
表3乙酰螺旋霉素回收率试验结果表(n＝6)
Figure BDA0001858405200000102
本发明建立了采用微生物比浊法测定人或动物血浆中乙酰螺旋霉素含量的方法，其测定原理与临床应用的要求一致，能准确直观地反映抗生素的医疗价值，且对供试品的纯度要求不高，既适用于精制品，又适用于制剂。综合上述验证试验，本发明的检测限、准确度、精密度、回收率等各项技术指标可满足试验要求，检测血液中乙酰螺旋霉素药物浓度方法重现性良好，分析时间短，且具有很高的专属性，从而提高了检测结果的准确度。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种血浆中乙酰螺旋霉素含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(A)制备微生物悬液；
(B)制备标准曲线：分别向微生物悬液中加入梯度浓度的乙酰螺旋霉素，培养，测定吸光度，制备得到标准曲线；
(C) 样品采集：采集血浆；
(D)分别精密量取待测血浆样品和空白血浆样品，加入步骤（A）的微生物悬液中混匀，得待测混合溶液和空白对照；
(E)测定待测混合溶液的微生物浓度；
(F)将待测混合溶液的微生物浓度与空白对照进行比较，通过标准曲线计算得出乙酰螺旋霉素的浓度；
步骤（A）中，所述微生物悬液按以下步骤制备：
A1：取微生物接种在营养琼脂斜面上；
A2：35-37℃恒温培养20小时-22小时，于2-8℃临时保存；
A3：用灭菌水或（0.9±0.1）%氯化钠溶液将微生物洗下，备用；
A4：将步骤A3得到的微生物移入经灭菌的置有营养肉汤的试管中，振摇成均匀的菌液；
步骤（E）中，所述测定待测混合溶液的微生物浓度按以下步骤进行：
E1：将步骤（D）的待测混合溶液于35-40℃恒温震荡培养3小时-7小时，取出，加入甲醇水溶液，放置5分钟-20分钟后；
E2：在入=（570±5）nm处测定吸光度。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（B）中，所述制备标准曲线包括以下步骤：
B1：称取乙酰螺旋霉素对照品，用溶剂溶解，用灭菌水稀释为特定浓度溶液；
B2：移取适量B1所得溶液，用缓冲液稀释，得不同浓度的标准系列溶液；
B3：在不同容器中精密量取微生物悬液，分别加入等体积的空白血浆和等体积的标准系列溶液，混合均匀。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤B1中，每5mg乙酰螺旋霉素对照品加入溶剂（2±0.2）ml。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤B2中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液的pH=7-8。
5.根据权利要求2或权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤B1中，所述溶剂为乙醇。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（D）中，所述空白对照由以下步骤制备：精密吸取一定体积微生物悬液，加入等体积空白血浆和等体积磷酸盐缓冲液，充分振摇。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤E1中，所述甲醇水溶液的体积浓度为20-40%；步骤E2中，所述吸光度为0.3-0.7。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述血浆来自于人或动物；所述微生物为金黄色葡萄球菌。
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