CN111562210B - 一种前包被饲用微生态制剂产品中活菌数的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种前包被饲用微生态制剂产品中活菌数的检测方法，包括以下步骤：(1)培养游离菌，梯度稀释计活菌数，并取适量菌液离心，用无菌水重悬获得菌悬液，备用；(2)取步骤(1)菌液，梯度稀释，与MTT溶液反应，得到沉淀，用DMSO溶解，利用酶标仪比色，测得吸光值；(3)用步骤(1)中得到的游离菌活菌数与步骤(2)中测得的吸光值制得标准曲线；(4)取前包被样品粉碎过筛，加入加有玻璃珠的锥形瓶中，加入破囊液，破囊，得菌悬液；(5)将菌悬液超声，得离散菌悬液(6)将离散后的菌悬液离心，加入DMSO重悬，稀释至不同梯度，同步骤(2)，测得吸光值；(6)根据步骤(3)中得到的标准曲线计算前包被微生态制剂中活菌数。
Description
技术领域
本发明属于微生物活菌数检测技术领域，涉及一种前包被饲用微生态制剂产品中活菌数的检测方法。
背景技术
发酵前包被微囊化培养益生菌，即在发酵前将游离菌体利用微囊化技术包裹在囊中，之后进行发酵培养，其与游离培养的益生菌相比，菌株具有更快的生长优势，有效提高了菌株对高铜及胃肠液的耐受性，对微生物菌株起到了很好的保护作用，保证了其生理功能的发挥，解决了益生菌作为饲料添加剂所存在的效价不稳定的问题。
一种成熟的益生菌活菌计数方法应具备计数结果平行性好、重现性好等特点，但是，由于发酵前包被微囊化益生菌菌体是包被到囊中以后发酵的，这就造成了囊中菌体密度过高，菌体之间紧密结合在一起，形成生物膜而不易分离，导致现有益生菌活菌计数方法，即平板计数法不适用于此类产品的活菌数检测。
活细胞中存在与NADP相关的脱氢酶，可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色甲臢，而死细胞NADP相关的脱氢酶酶消失，MTT不会被还原，用DMSO溶解甲臢后可用酶标仪在490nm处测得溶解液的吸光值来确定活菌数。然而，传统的MTT法不能将微囊中紧密结合的菌体在不破坏其活性的条件下均匀分散，无法准确检测微囊中包裹的活菌数量，CN101620188A公开了一种利用四唑蓝法快速测定发光细菌活细菌总数的方法，其使用MTT法检测不同浓度活菌数制作标准曲线，再使用MTT法检测发酵液中活菌数，但是该方法适用于菌液，测定参数不完善，不适用于微囊中紧密结合的菌体活性；CN102053123A公开了一种微囊化细胞活性的检测方法，该方法虽然运用MTT法检测微囊化细胞，但是其对微囊进行破囊处理的方法未考虑到对菌体细胞的损伤，且没有表明腺苷酸能荷和活细胞数量有对应关系，因此，常规的MTT法不适用于前包被饲用微生态制剂产品的活菌数检测。
综上，目前在前包被微生态制剂活菌数检测领域没有一套适用的、成熟的检测方法。本发明结合特有的前处理技术，融合改进后的MTT法，针对前包被微生态制剂产品样品前处理条件、破囊液选择以及对标菌液培养阶段进行优化，开发了一种特有的适用于前包被微生态制剂产品中活菌数检测的方法，该方法具备计数结果平行性好、重现性好且受人为因素影响小等特点。适用于其他前包被微生态产品活菌数的检测，微生物产品包括前包被枯草芽孢杆菌，前包被地衣芽孢杆菌，前包被酿酒酵母，前包被布拉迪酵母，前包被前屎肠球菌、前包被粪肠球菌、前包被嗜酸乳杆菌、前包被植物乳酸杆菌、前包被乳酸片球菌、前包被丁酸梭菌和前包被布氏乳杆菌。
发明内容
为了解决当前前包被微生态制剂产品活菌计数问题，本发明的目的在于提供一种前包被饲用微生态制剂产品中活菌数的检测方法，它极其显著的改善了目前计数方法存在的缺陷，极其显著的提高了前包被微生态制剂产品活菌检测合格率，不仅极大的降低了人为因素的影响，且计数结果稳定，重复性高。
为了实现上述技术目的，本发明采取了如下方案：
一种前包被饲用微生态制剂产品中活菌数的检测方法，包括以下步骤：
(1)培养游离菌，梯度稀释计活菌数，并取适量菌液离心，用无菌水重悬获得菌悬液，备用；
(2)取步骤(1)菌悬液，梯度稀释，与MTT溶液反应，得到沉淀，用DMSO溶解，利用酶标仪比色，测得吸光值；
(3)用步骤(1)中得到的游离菌活菌数与步骤(2)中测得的吸光值制得标准曲线；
(4)取前包被样品粉碎过筛，加入加有玻璃珠的锥形瓶中，加入破囊液，破囊，得菌悬液；
(5)将步骤(4)中菌悬液超声处理，离心，加入DMSO重悬，稀释至不同梯度，同步骤(2)，测得吸光值；
(6)根据步骤(3)中得到的标准曲线计算前包被微生态产品中活菌数。
进一步的，步骤(1)中游离菌液培养温度根据不同菌种生长特性确定，即30-37℃下培养，二次扩培至对数期末期，即20-48h，备用。
进一步的，步骤(1)中重悬菌液加入的无菌水以去除培养基底色干扰，其与离心去除的上清液比例为1∶1。
进一步的，步骤(2)中在酶标板中加入菌悬液的量为100μL，加入MTT溶液40-60μL，优选地，加入50μL，37℃反应4-5h，反应后溶液离心分离条件为：10000-12000r/min，离心8-10min。
进一步的，步骤(2)中MTT溶液，其配制方法为：称取MTT 0.5g，溶于100mL的磷酸缓冲液(PBS)中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，于4℃避光保存，现用现配。
进一步的，步骤(2)中加入DMSO的量为200-220μL，静置时间为10-15min，比色波长为490nm。
进一步的，步骤(3)中制得的标准曲线样品线性回归与预期活菌数相关系数R2≥0.999。
进一步的，步骤(4)中所述的，前包被微生态产品样品过筛条件为：过80-100目筛处理，取样量为10g，加入破囊液90mL，在锥形瓶中破囊条件为：温度25-35℃，200-250r/min，45-60min。
进一步的，步骤(4)中所述的，玻璃珠直径为0.56-0.60cm；
进一步的，步骤(4)中所述的，破囊液含有水90mL，海藻糖0.01-0.1g，吐温800.01-0.1g，柠檬酸三钠2-3g。
进一步的，步骤(5)中所述的，超声处理条件为：功率240W-480W，时间3-7min。
基于前包被微生态制剂产品的特殊性，本发明针对性的开发了应用于前包被微生态产品的破囊液、前处理方法，有效将前包被微胶囊打开，并利用超声空化作用在菌体间产生的瞬间爆破力，有效将结合紧密的菌团打散，并对对标菌液培养阶段、MTT检测波长、底物加入浓度、菌体加入浓度进行了优化。与现有技术相比，本方法具备计数结果平行性好、重现性好且受人为因素影响小、检测周期短等优点。本方法同样适用于其它前包被微生物产品活菌数的检测，微生物产品包括前包被枯草芽孢杆菌，前包被地衣芽孢杆菌，前包被酿酒酵母，前包被布拉迪酵母，前包被前屎肠球菌、前包被粪肠球菌、前包被嗜酸乳杆菌、前包被植物乳酸杆菌、前包被乳酸片球菌、前包被丁酸梭菌和前包被布氏乳杆菌。
附图说明
图1为前包被乳酸菌MTT法定量测定标准曲线；
图2为传统乳酸菌MTT法定量测定标准曲线；
图3为前包被乳酸菌MTT法定量测定标准曲线；
图4为传统乳酸菌MTT法定量测定标准曲线；
图5为前包被酿酒酵母菌MTT法定量测定标准曲线；
图6为传统酿酒酵母菌MTT法定量测定标准曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例,基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-6，本发明提供一种技术方案：
一种前包被乳酸菌中活菌数检测的方法，其包括，标准曲线的绘制，前包被乳酸菌样品前处理，包括样品粉碎和菌液制备，根据标准曲线确定前包被乳酸菌样品的活菌数。具体地，包括以下步骤：
步骤一：标准曲线的绘制
(1)培养游离乳酸菌20-24h，梯度稀释计活菌数，并取适量菌液离心，用无菌水重悬获得菌悬液，备用，特别地，游离菌培养至对数期末期；
(2)取步骤(1)菌液，梯度稀释，与MTT溶液反应，得到沉淀，用DMSO溶解，利用酶标仪比色，测得吸光值；
(3)用步骤(1)中得到的游离乳酸菌活菌数与步骤(2)中测得的吸光值制得标准曲线。
步骤二：前包被乳酸菌样品菌悬液制备
取10g前包被乳酸菌样品粉碎过80-100目筛，加入加有玻璃珠的锥形瓶中，加入破囊液90mL，特别地，玻璃珠直径为0.56-0.60cm，破囊液中含有海藻糖0.01-0.1g、吐温800.01-0.1g和柠檬酸三钠2-3g，温度25-35℃，200-250r/min，45-60min，摇匀，制得菌悬液；
步骤三：前包被乳酸菌样品活菌数确定
将步骤二中菌悬液超声处理(功率240W-480W，时间3-7min)后离心，加入等体积的DMSO重悬，稀释至不同梯度，通过活细胞代谢产生NADP脱氢酶还原MTT显色，并用DMSO溶解反应物，测得反应液吸光值，根据步骤一绘制的标准曲线计算得到前包被乳酸菌中活菌数。
实施例1
本实施例以乳酸菌为例，对本发明实施例的一种前包被饲用微生态制剂产品中活菌数的检测方法，进行具体说明。其他种类的微生态制剂与此处实施例的原理和方法相同。
一种包被乳酸菌中活菌数检测的方法，包括以下步骤(以菌量为1×1010前包被乳酸菌样品为例)：
步骤一：标准曲线的绘制
(1)培养游离乳酸菌21h，梯度稀释计活菌数，并取适量菌液离心，加入等体积无菌水无菌水重悬获得菌悬液，备用；
(2)取步骤(1)菌液，稀释不同梯度后，分别取100μL菌液加入96孔酶标板中，并加入50μL MTT溶液(MTT溶液配制方法为：称取MTT 0.5g，溶于100mL的磷酸缓冲液(PBS)中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，于4℃避光保存，现用现配)，37℃，避光反应4h，10000r/min下离心10min，去上清液，在沉淀中加入200μL DMSO，混匀，静置10min至沉淀完全溶解，加入至96孔酶标板中，摇匀至无沉淀，利用酶标仪在波长490nm条件下比色，测得吸光值；
(3)用步骤(1)中得到的游离乳酸菌活菌数与步骤(2)中测得的吸光值制得标准曲线；
步骤二：前包被乳酸菌样品菌悬液制备
取10g前包被乳酸菌样品粉碎过80目筛，加入加有玻璃珠(玻璃珠直径为0.58cm)的锥形瓶中，破囊液90mL(破囊液中含有海藻糖0.01g、吐温80 0.1g和柠檬酸三钠2g)，温度25℃，250r/min，55min，摇匀，制得菌悬液；
步骤三：前包被乳酸菌样品活菌数确定
将步骤二中菌悬液超声处理(功率240W，时间7min)后离心，加入等体积的DMSO重悬，稀释至不同梯度，通过活细胞代谢产生NADP脱氢酶还原MTT显色，并用DMSO溶解反应物，测得反应液吸光值，根据步骤一绘制的标准曲线计算得到前包被乳酸菌中活菌数。
对比例1
采用平板计数法，参考国标GB 4789.35-2016。
对比例2
采用传统MTT法进行活菌计数，游离乳酸菌培养15h，在波长570nm处进行比色，具体操作参考文献：黄立坤，杜鹏，霍贵成.MTT法测定乳酸菌活菌数的研究，食品工业[J].2008(3)：62-65。
实施例1的标准曲线如图1所示，对比例2的标准曲线如图2所示。
实施例1与对比例1和2最后得到的测定结果如表1-3所示。
表1实施例1与对比例1和2的活菌计数结果(样品一)
表2实施例1与对比例1和2的活菌计数结果(样品二)
表3实施例1与对比例1和2的活菌计数结果(样品三)
实施例2
本实施例以乳酸菌为例，对本发明实施例的一种前包被饲用微生态制剂产品中活菌数的检测方法，进行具体说明。其他种类的微生态制剂与此处实施例的原理和方法相同。
一种前包被乳酸菌中活菌数检测的方法，包括以下步骤：
步骤一：标准曲线的绘制
(1)培养游离乳酸菌23h，梯度稀释计活菌数，并取适量菌液离心，加入等体积无菌水无菌水重悬获得菌悬液，备用；
(2)取步骤(1)菌液，稀释不同梯度后，分别取100μL菌液加入96孔酶标板中，并加入50μL MTT溶液(MTT溶液配制方法为：称取MTT 0.5g，溶于100mL的磷酸缓冲液(PBS)中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，于4℃避光保存，现用现配)，37℃，避光反应4h，12000r/min下离心8min，去上清液，在沉淀中加入200μL DMSO，混匀，静置12min至沉淀完全溶解，加入至96孔酶标板中，摇匀至无沉淀，利用酶标仪在波长490nm条件下比色，测得吸光值；
(3)用步骤(1)中得到的游离乳酸菌活菌数与步骤(2)中测得的吸光值制得标准曲线；
步骤二：前包被乳酸菌样品菌悬液制备
取10g前包被乳酸菌样品粉碎过100目筛，加入加有玻璃珠(玻璃珠直径为0.58cm)的锥形瓶中，破囊液90mL(破囊液中含有海藻糖0.05g、吐温80 0.05g和柠檬酸三钠3g)，温度30℃，200r/min，60min，摇匀，制得菌悬液；
步骤三：前包被乳酸菌样品活菌数确定
将步骤二中菌悬液超声处理(功率480W，时间3min)后离心，加入等体积的DMSO重悬，稀释至不同梯度，通过活细胞代谢产生NADP脱氢酶还原MTT显色，并用DMSO溶解反应物，测得反应液吸光值，根据步骤一绘制的标准曲线计算得到前包被乳酸菌中活菌数。
对比例1
采用平板计数法，参考国标GB 4789.35-2016。
对比例2
采用传统MTT法进行活菌计数，游离乳酸菌培养15h，在波长570nm处进行比色，具体操作参考文献：黄立坤，杜鹏，霍贵成.MTT法测定乳酸菌活菌数的研究，食品工业[J].2008(3)：62-65。实施例2的标准曲线如图3所示,对比例2的标准曲线如图4所示。
实施例2与对比例1和2最后得到的测定结果如表4-6所示。
表4实施例2与对比例1和2的活菌计数结果(样品一)
表5实施例2与对比例1和2的活菌计数结果(样品二)
表6实施例2与对比例1和2的活菌计数结果(样品三)
通过以上两组案例结果对比可看出，国标GB 4789.35-2016平板计数方法得到的活菌数结果平行性非常差、同一批次产品计数结果重现性差，且检测得到的活菌数量极低，传统MTT法得到的活菌数结果平行性差、同一批次产品计数结果重现性差。而本发明方法，由标准曲线可看出，利用本发明开发前包被微生态制剂产品的计数方法中测得的吸光值与游离乳酸菌活菌数线性相关系数R2达到0.999，即通过此方法得到的计数结果稳定可靠，由样品活菌计数结果可看出，利用本发明方法进行活菌计数有效提高了样品检测合格率，且计数结果稳定，重复性好。
实施例3
本实施例以酿酒酵母菌为例，对本发明实施例的一种前包被饲用微生态制剂产品中活菌数的检测方法，进行具体说明。其他种类的微生态制剂与此处实施例的原理和方法相同。
一种前包被酿酒酵母菌中活菌数检测的方法，包括以下步骤：
步骤一：标准曲线的绘制
(1)培养游离酿酒酵母菌38h，梯度稀释计活菌数，并取适量菌液离心，加入等体积无菌水无菌水重悬获得菌悬液，备用；
(2)取步骤(1)菌液，稀释不同梯度后，分别取100μL菌液加入96孔酶标板中，并加入50μL MTT溶液(MTT溶液配制方法为：称取MTT 0.5g，溶于100mL的磷酸缓冲液(PBS)中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，于4℃避光保存，现用现配)，37℃，避光反应4h，12000r/min下离心8min，去上清液，在沉淀中加入200μL DMSO，混匀，静置12min至沉淀完全溶解，加入至96孔酶标板中，摇匀至无沉淀，利用酶标仪在波长490nm条件下比色，测得吸光值；
(3)用步骤(1)中得到的游离酿酒酵母菌活菌数与步骤(2)中测得的吸光值制得标准曲线；
步骤二：前包被酿酒酵母菌样品菌悬液制备
取10g前包被酿酒酵母菌样品粉碎过100目筛，加入加有玻璃珠(玻璃珠直径为0.58cm)的锥形瓶中，破囊液90mL(破囊液中含有海藻糖0.05g、吐温80 0.05g和柠檬酸三钠3g)，温度30℃，200r/min，60min，摇匀，制得菌悬液；
步骤三：前包被酿酒酵母菌样品活菌数确定
将步骤二中菌悬液超声处理(功率480W，时间3min)后离心，加入等体积的DMSO重悬，稀释至不同梯度，通过活细胞代谢产生NADP脱氢酶还原MTT显色，并用DMSO溶解反应物，测得反应液吸光值，根据步骤一绘制的标准曲线计算得到前包被酿酒酵母菌中活菌数。
对比例1
采用平板计数法，参考国标GB 4789.15-2016。
对比例2
采用传统MTT法进行活菌计数，游离酿酒酵母菌培养38h，在波长570nm处进行比色，具体操作参考文献：彭立强，谢云，任涛涛，等.猪饲料添加剂复合菌种的筛选和特性研究，饲料工业[J].2010，31(20)：37-41。
对比例1的标准曲线如图5所示，对比例2的标准曲线如图6所示。
实施例3与对比例1和2最后得到的测定结果如表7-9所示。
表7实施例2与对比例1和2的活菌计数结果(样品一)
表8实施例2与对比例1和2的活菌计数结果(样品二)
表9实施例2与对比例1和2的活菌计数结果(样品三)
通过以上案例结果对比可看出，国标GB 4789.15-2016平板计数方法得到的活菌数结果平行性非常差、同一批次产品计数结果重现性差，且检测得到的活菌数量极低，传统MTT法得到的活菌数结果平行性差、同一批次产品计数结果重现性差。而本发明方法，由标准曲线可看出，利用本发明开发前包被微生态制剂产品的计数方法中测得的吸光值与游离乳酸菌活菌数线性相关系数R2达到0.999，即通过此方法得到的计数结果稳定可靠，由样品活菌计数结果可看出，利用本发明方法进行活菌计数有效提高了样品检测合格率，且计数结果稳定，重复性好。
Claims (6)
1.一种前包被饲用微生态制剂产品中活菌数的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）培养游离菌至对数生长末期，梯度稀释计活菌数，
（2）取适量菌液离心去除上清液，用无菌水重悬获得菌悬液，将菌悬液梯度稀释，与MTT溶液反应，在37℃下避光处理，得到沉淀，用DMSO溶解不断吹吸使其混匀，利用酶标仪比色，测得吸光值；所述MTT溶液，其配制方法为：称取MTT 0.5 g，溶于100 mL的磷酸缓冲液（PBS）中，用0.22 μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，于4℃避光保存，现用现配；
（3）用步骤（1）中得到的游离菌活菌数与步骤（2）中测得的吸光值制得标准曲线；
（4）取前包被样品粉碎过筛，加入加有玻璃珠的锥形瓶中，加入破囊液，破囊，得菌悬液，取菌悬液超声处理，备用，所述的前包被样品过筛条件为：过筛80-100目筛处理，取样量为10 g，加入破囊液体90 mL，在锥形瓶中摇匀条件为：温度25-35℃，200-250 r/min，45-60min, 所述的破囊液含有海藻糖、吐温80和柠檬酸三钠，每90 mL水含有海藻糖0.01-0.1 g，吐温80 0.01-0.1 g，柠檬酸三钠2-3 g,超声处理条件为：功率240 W-480 W，时间3-7 min；
（5）将步骤（4）中菌悬液离心，加入DMSO重悬，稀释至不同梯度，同步骤（2），测得吸光值；
（6）根据步骤（3）中得到的标准曲线计算前包被饲用微生态产品中活菌数。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于,步骤（1）中游离菌菌液培养温度根据不同菌种生长特性确定，即30-37℃下培养，游离菌菌液培养至对数期末期，即20-48 h，备用。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）离心去除的上清液与重悬菌液加入的无菌水的比例为1∶1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中在酶标板中加入菌悬液的量为100μL，加入MTT溶液40～60μL，37℃反应4～5 h，反应后溶液离心分离条件为：10000～12000 r/min，离心8-10 min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中加入DMSO的量为200～220μL，静置时间为10～15 min，比色波长为490 nm。
6.权利要求1所述的一种前包被饲用微生态制剂产品中活菌数的检测方法的应用，其特征在于，该MTT法同样适用于微生态制剂产品包括前包被枯草芽孢杆菌，前包被地衣芽孢杆菌，前包被酿酒酵母，前包被布拉迪酵母，前包被屎肠球菌、前包被粪肠球菌、前包被嗜酸乳杆菌、前包被植物乳酸杆菌、前包被乳酸片球菌、前包被丁酸梭菌和前包被布氏乳杆菌。
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