CN101186891A - 沙门氏菌显色培养基、检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及的一种沙门氏菌显色培养基、检测试剂盒及检测方法，属于食品微生物安全监测领域。检测试剂盒由加入了0.1～0.5g细菌特异性酶的混合显色底物M－galactoside的显色培养基与增菌液A缓冲蛋白胨水培养基、B四硫磺酸钠煌绿增菌液组成；检测时，对食品样品进行前处理，先后利用增菌液A、B进行增菌培养，最后将二次增菌液接种至显色培养基上培养，若出现光滑、略凸起、直径1～3mm、边缘整齐的品红色菌落，说明样品存在沙门氏菌。所述的显色培养基成本低廉，试剂盒配置简单，检测方法检测灵敏度高，周期短、可操作性强、适用于处理大通量的样本、易于产业化生产，可以广泛推广应用到食品卫生、环境监测等领域。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种微生物显色培养基、检测试剂盒及检测方法，属于食品微生物安全监测领域。
【背景技术】
“民以食为天”，食品是人类赖以生存的物质基础，食品安全是关系人类健康和社会发展的重大问题。近年来，国内外食品安全的恶性事件不断发生。食源性致病菌是指以食物为载体，导致人类发生疾病的一大类细菌。据统计，发达国家每年约有1/3的人患食源性疾病，美国每年约有7600万例食源性疾病患者，全世界每年约有220万人因患食源性疾病而丧生，而且，食源性疾病常常是发展中国家导致人非正常死亡的主要原因。由此可见，食源性疾病已成为国内外普遍关心的问题。
沙门氏菌(Salmonella)是人类常见的重要食源性致病菌之一，是人和动物肠道中最主要且数量最多的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，正常栖居条件下不致病。但若进入胆囊、膀胱等处可引起感染，如腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等。
为有效控制病原的发生和扩散，准确及时的检测手段是预防和控制沙门氏菌传播的关键。目前，沙门氏菌传统的检测方法需要分离培养、镜检观察、生化鉴定等多个步骤，检测周期长，整个过程大约4-7天，且操作复杂，已不能满足食品中病源菌快速检测的现实需要，而且当有其它的肠道菌群存在时会影响沙门氏菌在传统SS培养基和DHL培养基中的检出。近年来，快速检验法中的PCR法、金标试纸法、免疫法和特异性的显色生化鉴定技术等快速检验方法，已在不断得到扩大应用，使沙门氏菌的快速检测有了很大发展。但是这些技术也存在一定缺陷，如技术要求高，设备操作复杂，需要专业的技术人员进行操作，以及检测费用昂贵等。
针对以上不足，以显色培养基为基础的特异性显色生化鉴定技术在当前能更好地与传统方法相接轨，检测成本较低。显色生化鉴定技术的原理是使用适当的显色底物，在细菌特异性酶作用下，显示一定颜色，直接观察菌落颜色的快速分析法，可以把检测、计数和鉴定一次完成。应用显色酶底物来检测微生物专一性和特异性的方法，推动了食源性致病菌的鉴定以及早期筛选培养基一系列技术的发展。这些基于酶的试验方法具有简便、快速、准确和检出率高的优点，在临床诊断及食品微生物检验中，显色培养基以其独具的优势与传统的培养基展开了竞争，从而引发了显色培养基开发和应用的热潮。国外的显色培养基研究起步很早。目前法国CHROMagar公司、意大利的Biolife公司、英国的Biolog公司和法国的BioMerieux公司已开发出沙门氏菌显色培养基，但是这些进口显色培养基价格昂贵，检测成本很高，且购买不方便，国内一般基层机构和企业很少采用。
【发明内容】
本发明旨在针对传统方法的不足，提供一种特异性高、检测周期短、成本低、可操作性强，适用于处理大通量样本的沙门氏菌显色培养基、检测试剂盒及检测方法。
所述的沙门氏菌显色培养基，其配方为：蛋白胨20～30g、酵母膏粉3～7g、氯化钠4～7g、胆盐0.1～0.5g、琼脂12～15g、混合显色底物M-galactoside 0.05～0.95g、Na2CO3 0.02～0.04g、选择性添加剂0.01～0.05g。
上述显色培养基优选的配方为：蛋白胨25.6g、酵母膏粉3g、氯化钠5g、胆盐0.1g、琼脂13g、混合显色底物M-galactoside 0.75g、Na2CO3 0.02g、选择性添加剂0.03g。
所述的沙门氏菌检测试剂盒，其组成为：上述沙门氏菌显色培养基、增菌液A和B。
其中，增菌液A为高压灭菌处理后的缓冲蛋白胨水培养基(BP)；
增菌液B为高压灭菌处理后的四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)。
所述的沙门氏菌检测方法，其具体步骤为：
(1)制备显色平板：每1000mL蒸馏水或去离子水中加入42～60g显色培养基干粉，搅拌加热煮沸至完全溶解，待冷至40～50℃，倒平板，备用；
(2)样品前处理：按国标法(GB/T 4789.4-2003)对食品样品进行前处理；
(3)一步增菌(非选择性增菌)：将处理过的样品25g置于225mL增菌液A中，混合均匀后37℃培养6～8h；
(4)二步增菌(选择性增菌)：取一步增菌液1mL加入到9mL增菌液B中，混合均匀后37℃培养18～24h；
(5)接种培养：将二步增菌液接种显色平板上，37℃培养18～24h；
(6)结果分析：若显色平板上出现光滑、略突起、直径1～3mm、边缘整齐的品红色菌落，说明该样品存在沙门氏菌。
本发明针对现有技术中的不足，从生物化学的角度出发，利用细菌特异性酶对其进行快速检测。首先，在分析沙门氏菌特异性生化反应的基础上，筛选出细菌特异性酶，然后通过在分离培养基上加入细菌特异性酶的显色底物，研制出显色培养基，直接根据菌落颜色就可对菌株作出鉴定，同时结合高效的样本前处理技术，建立特异性显色生化检测方法，用于沙门氏菌的快速诊断和监控，可大大节省检测成本和时间，具有更广泛的应用前景。
本发明通过筛选沙门氏菌特异性酶及显色底物，开发了沙门氏菌的显色培养基，克服了已有显色培养基价格昂贵和传统培养基特异性差等缺点；并通过对比各种标准方法的样本前处理技术，建立了一套系统的沙门氏菌显色生化快速检测方法，提高了检测效率；所建立的沙门氏菌显色生化快速检测方法，可对食品和环境中沙门氏菌进行全面、系统、准确的检测和鉴定，为微生物快速检测提供了新的途径。
本发明所述的试剂盒配置简单，检测方法检测灵敏度高，周期短、可操作性强、适用于处理大通量的样本、易于产业化生产，可以广泛推广应用到食品卫生等领域。
【具体实施方式】
实施例1：本发明所述的沙门氏菌显色培养基特异性的验证
1、沙门氏菌显色培养基的配制：称取47.5g显色培养基干粉，加入1000mL蒸馏水或去离子水，搅拌加热煮沸至完全溶解，待冷至40～50℃，倒平板，备用。
2、接种：将鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、伤寒沙门氏菌(S.typhi)、肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)、猪霍乱沙门氏菌(S.cholerae)、甲型副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi A)、乙型副伤寒沙门氏菌(S.paratyphiB)、汤卜逊沙门氏菌(S.thompson)、大肠菌群(Colifrom)、变形杆菌(Proteus)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、粪链球菌(Streptococcusfaecalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)在营养琼脂复苏24h后，分别划线接种上述显色培养基平板，37℃培养18～24h。
3、结果及分析：沙门氏菌在显色平板上均出现品红色菌落，大肠菌群在显色平板上均出现蓝绿色菌落，变形杆菌和福氏志贺氏菌在显色平板上均出现无色菌落，粪链球菌、金黄色葡萄球菌在显色平板上均无生长现象，说明沙门氏菌显色培养基具有较高的特异性。
实施例2：本发明所述的沙门氏菌显色培养基灵敏度及特异性的验证
1、沙门氏菌显色培养基的配制：称取47.5g显色培养基干粉，加入1000mL蒸馏水或去离子水，搅拌加热煮沸至完全溶解，待冷至40～50℃，倒平板，备用。
2、接种：将鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、汤卜逊沙门氏菌、柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌25922、阴沟肠杆菌、大肠杆菌44113、大肠杆菌8099、普通变型杆菌、奇异变型杆菌、白色念珠菌、痢疾志贺氏菌、阪崎肠杆菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌和粪链球菌在营养琼脂复苏24h后，按以下菌种的组合，分别用接种环挑取1环，加入到10mL 0.85％生理盐水中配成原液，然后进行10倍梯度稀释，取10-5～10-6浓度混合菌液各0.1mL，分别涂布上述显色培养基平板(简称HKSAL)、传统的SS平板、国外两种品牌的沙门氏菌显色培养基平板(简称ZWSALI和ZWSALII)，37℃培养18～24h。
菌种组合：
1)猪霍乱沙门氏菌+柠檬酸杆菌+粪链球菌+金黄色葡萄球菌+白色念珠菌
2)伤寒沙门氏菌+产气肠杆菌+粪链球菌+金黄色葡萄球菌+痢疾志贺氏菌
3)甲副伤寒沙门氏菌+肺炎克雷伯氏菌+金黄色葡萄球菌+铜绿假单胞菌+奇异变型杆菌
4)肠炎沙门氏菌+大肠杆菌25922+粪链球菌+铜绿假单胞菌+粘质沙雷伯氏菌
5)鼠伤寒沙门氏菌+阴沟肠杆菌+粪链球菌+铜绿假单胞菌+阪崎肠杆菌
6)乙副伤寒沙门氏菌+大肠杆菌44113+金黄色葡萄球菌+铜绿假单胞菌+普通变型杆菌
7)汤卜逊沙门氏菌+大肠杆菌8099+金黄色葡萄球菌+铜绿假单胞菌+粪链球菌
3、结果及分析：
混合菌液涂布各平板灵敏度试验结果如表1，对各培养基的菌落数进行t检验分析，表明本发明所述的沙门氏菌显色培养基与传统的SS平板及国外其中一种品牌的沙门氏菌显色培养基平板(ZWSALI)的沙门氏菌检出率没有显著差异(P＞0.05)，三种培养基可以达到相同的检测限；而与国外另一种品牌的沙门氏菌显色培养基平板(ZWSALII)的沙门氏菌检出率有显著差异(P＜0.05)，稍优于ZWSALII；
混合菌液涂布各平板特异性试验结果如表2，在本发明所述的沙门氏菌显色培养基平板上沙门氏菌仍呈特殊的品红色菌落，其他肠道菌受抑或呈现蓝色或呈无色菌落。表明其他肠道菌基本不影响沙门氏菌的检测，显色培养基对沙门氏菌的特异性高。
表1 七种组合中的沙门氏菌在各培养基上的灵敏度试验结果(均值)
| 菌株 | HKSAL | ZWSALII | ZWSALI | SS | |
| 1) | 猪霍乱沙门氏菌 | 29 | 18 | 22 | 42 |
| 2) | 伤寒沙门氏菌 | 60 | 42 | 68 | 58 |
| 3) | 甲副伤寒沙门氏菌 | 68 | 34 | 81 | 与奇变不能区分 |
| 4) | 肠炎沙门氏菌 | 124 | 112 | 113 | 136 |
| 5) | 鼠伤寒沙门氏菌 | 180 | 136 | 与阪崎不能区分 |
| 6) | 乙副伤寒沙门氏菌 | 208 | 150 | 174 | 与普变不能区分 |
| 7) | 汤卜逊沙门氏菌 | 78 | 78 | 70 | 100 |
| NO.1T(f) | 沙门氏菌 | 3.23+* | 0.96 | 2.27 |
备注：查表T(6)0.05＝2.45，T(5)0.05＝2.57，T(4)0.05＝2.78
上表T值大于查表所得数据，则表示检验差异有显著性意义；反之，T值小于查表所得数据，则表示检验差异无显著性意义。“*”表示检验差异有显著性意义；“+*”表示NO.1好，“-*”表示NO.1稍差。
表2 七种组合中各种菌在各培养基上的特异性试验结果
| 菌株 | 接种量(cfu) | HKSAL | ZWSALII | ZWSALI | SS |
| 沙门氏菌菌落特征 | 品红色 | 品红色 | 品红色 | 无色半透明，有或无黑心 | |
| 猪霍乱沙门氏菌 | 品红色 | 品红色 | 浅品红色 | 无色 | |
| 伤寒沙门氏菌 | 品红色 | 品红色 | 品红色 | 无色 | |
| 甲副伤寒沙门氏菌 | 浅品红色 | 浅品红色 | 浅品红色 | 无色 | |
| 肠炎沙门氏菌 | 品红色 | 品红色 | 品红色 | 无色 | |
| 鼠伤寒沙门氏菌 | 品红色 | 品红色 | 紫罗兰色 | 无色，有黑心 | |
| 乙副伤寒沙门氏菌 | 品红色 | 品红色 | 品红色 | 无色，有黑心 | |
| 汤卜逊沙门氏菌 | 品红色 | 品红色 | 紫罗兰色 | 无色 | |
| 粪链球菌 | 5000 | - | - | - | - |
| 金黄色葡萄球菌 | 5000 | - | - | - | - |
| 铜绿假单胞菌 | 5000 | - | - | - | - |
| 粘质沙雷伯氏菌 | 1000 | - | - | - | - |
| 奇异变形杆菌 | 200 | +(无色) | - | - | +(无色) |
| 痢疾志贺氏菌 | 1000 | - | +(无色) | - | - |
| 普通变形杆菌 | 200 | +(无色) | +(无色) | +(无色) | +(无色) |
| 阪崎肠杆菌 | 200 | +(紫罗兰色) | +(暗红色) | +(蓝绿色) | +(无色) |
| 白色念珠菌 | 200 | +(无色) | +(无色) | - | - |
实施例3：生猪肉中沙门氏菌检测的模拟试验
1、制备显色平板
称取47.5g显色培养基干粉(含蛋白胨25.6g、酵母膏粉3g、氯化钠5g、胆盐0.1g、琼脂13g、混合显色底物M-galactoside 0.75g、Na2CO3 0.02g、选择性添加剂0.03g)，加入1000mL蒸馏水或去离子水，搅拌加热煮沸至完全溶解，待冷至40～50℃，倒平板，备用。
2、前增菌
称取25g猪肉样品2份，其中1份添加1～10cfu沙门氏菌，模拟实际样品混合2h，无菌操作将2份样品分别加到含有225mL BP增菌液的三角瓶中，37℃培养4h。
3、选择性增菌
各取1mL样品前增菌液分别加入到9mLTTB中进行二次增菌，37℃培养18h。
4、接种培养
各取1环二次增菌液，划线接种显色培养基，37℃培养18～24h，观察记录菌落大小、颜色和形态。
5、结果观察和分析
未添加沙门氏菌的样品增菌后在显色平板上无品红色菌落；添加沙门氏菌的样品增菌后在显色平板上呈现光滑、略突起、直径1～3mm、边缘整齐的品红色菌落。检测过程中，前增菌需4h，选择性增菌18h，显色平板培养18～24h，阳性结果时间最长需46h。检测灵敏度可以达到1～10cfu。
实施例4：鸡蛋中沙门氏菌的检测
1、制备显色平板
称取47.5g显色培养基干粉(含蛋白胨25.6g、酵母膏粉3g、氯化钠5g、胆盐0.1g、琼脂13g、混合显色底物M-galactoside 0.75g、Na2CO3 0.02g、选择性添加剂0.03g)，加入1000mL蒸馏水或去离子水，搅拌加热煮沸至完全溶解，待冷至40～50℃，倒平板，备用。
2、前增菌
在无菌条件下，称取已去壳25g鸡蛋，无菌操作将样品加到含有225mL BP增菌液的三角瓶中，37℃培养4h。
3、选择性增菌
取1mL样品前增菌液加入到9mLTTB中进行二次增菌，37℃培养18h。
4、接种培养
取1环二次增菌液，划线接种显色培养基，37℃培养18～24h，观察记录菌落大小、颜色和形态。以沙门氏菌标准菌株划线接种显色培养基作对照，对比分析检测结果。
5、结果分析
显色平板上呈现光滑、略突起、直径1～3mm、边缘整齐的品红色菌落，菌落颜色和形态与标准菌株相符，说明鸡蛋样品中存在沙门氏菌。实施例5：本发明所述的沙门氏菌检测方法与国家标准检测法(简称国标法)和国外同类产品(ZWSALI)的比较
从超市和菜市场购买实际样品共40份，按国标法(GB/T 4789.4-2003，食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验)和本发明所述的检测方法对沙门氏菌进行检测，检测阳性样本用VITEK32的GNI+鉴定试剂条进行验证，比较三种检测方法的灵敏度。
(1)国标法：样本-TTB(或MM)与SC增菌24h-划线接种DHL平板—无色半透明菌落—生化鉴定。
(2)本发明所述的检测法：样本-BP前增菌4h-TTB选择性增菌18h-划线接种本发明所述的显色培养基(HKSAL)和国外同类产品(ZWSALI)-直接观察有无品红色菌落。
通过40份超市和菜市场代表性食品中沙门氏菌的国标法和本发明所述的检测方法以及国外同类产品(ZWSALI)的检测方法，结果如表3，说明用本发明所述的沙门氏菌检测方法在检测生奶和生鸡肉样品时检出率与国标法以及国外同类产品相同，但在检测熟食时本发明所述的沙门氏菌检测方法的检出率高于其他两种培养基。
表3实际样品中沙门氏菌的检测结果
| 样品 | DHL | HKSAL | ZWSALI |
| (份数) | 株数(阳性率) | 株数(阳性率) | 株数(阳性率) |
| 熟食(20份) | 16(80％) | 17(85％) | 13(65％) |
| 牛奶(10份) | 9(90％) | 9(90％) | 9(90％) |
| 生鸡肉(10份) | 9(90％) | 9(90％) | 9(90％) |
| 总计(40份) | 34(85％) | 35(87.5％) | 31(77.5％) |
Claims (5)
1.一种沙门氏菌显色培养基，其特征在于配方为：蛋白胨20～30g、酵母膏粉3～7g、氯化钠4～7g、胆盐0.1～0.5g、琼脂12～15g、混合显色底物M-galactoside 0.05～0.95g、Na2CO3 0.02～0.04g、选择性添加剂0.01～0.05g。
2.如权利要求1所述的显色培养基，其特征在于配方为：蛋白胨25.6g、酵母膏粉3g、氯化钠5g、胆盐0.1g、琼脂13g、混合显色底物M-galactoside0.75g、Na2CO3 0.02g、选择性添加剂0.03g。
3.一种沙门氏菌检测试剂盒，其特征在于其包括
增菌液A：高压灭菌处理后的缓冲蛋白胨水培养基；
增菌液B：高压灭菌处理后的四硫磺酸钠煌绿增菌液；以及
如权利要求1或2所述的沙门氏菌显色培养基。
4.一种使用如权利要求3所述的检测试剂盒检测沙门氏菌的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)制备显色平板：每1000mL蒸馏水或去离子水中加入42～60g显色培养基干粉，搅拌加热煮沸至完全溶解，待冷至40～50℃，倒平板，备用；
(2)样品前处理：按国标法对食品样品进行前处理；
(3)一步增菌：将处理过的样品25g置于225mL增菌液A中，混合均匀后37℃培养6～8h；
(4)二步增菌：取一步增菌液lmL加入到9mL增菌液B中，混合均匀后37℃培养18～24h；
(5)接种培养：将二步增菌液接种显色平板上，37℃培养18～24h；
(6)结果分析：若显色平板上出现光滑、略突起、直径1～3mm、边缘整齐的品红色菌落，说明该样品存在沙门氏菌。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于在制备显色平板步骤中每1000mL蒸馏水或去离子水中加入47.5g显色培养基干粉。
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