CN102827918A - 一种用于检测沙门氏菌的显色培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测沙门氏菌的显色培养基，属于食品安全及临床微生物检测领域。本发明的培养基含有琼脂、蛋白胨、牛肉浸粉、氯化钠、表面活性剂、胆盐、酶诱导剂、辛酸酯酶显色底物、β-半乳糖苷酶显色底物、氨基己糖苷酶显色底物、新生霉素。本发明的显色培养基用于检测沙门氏菌，检测灵敏度高，特异性好，直接根据菌落颜色就可对菌株作出初步鉴别；可操作性强，适用于处理大通量的样本，可对食品生产、临床疾病诊断和环境中沙门氏菌进行全面、系统、准确的检测和初步鉴别，为微生物快速检测提供了新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物检测的培养基，尤其涉及一种用于检测沙门氏菌的显色培养基。
背景技术
沙门氏菌(Salmonella)是肠杆菌科的重要致病菌属，据统计在世界各国的细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首，一直以来均引起国际国内的广泛关注，它不但涉及到人类身体健康和国际贸易，而且严重影响社会的稳定。据美国CDC2009年2月9日公布的统计数字，美国44个州有600人因食用两种花生酱受到沙门氏菌感染。在我国，沙门氏菌污染也是最主要的食品安全问题。调查显示，我国每年发生的细菌性食物中毒事件由沙门氏菌引起的占80％。
沙门氏菌传统的检测方法利用的是常规生化原理，由于与其它肠杆菌如志贺氏菌、柠檬酸菌属及变形杆菌的生化特征非常相似，在传统木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐培养基（ＸＬＤ）中选择效果不明显，可疑菌落不易识别，而且当有其它的肠道菌群存在时会影响沙门氏菌的检测，给检测技术人员带来极大的工作量与不确定性。随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的沙门氏菌检测方法，如PCR法、金标试纸法、免疫法、乳胶凝集试验和DNA探针技术等快速检验方法，已在不断得到扩大应用。然而由于这些方法需要较高的技术且仪器试、剂的成本较高，而且酶联免疫吸附法、乳胶凝集试验等会与沙门氏菌的多种血清型出现交叉反应。相比以显色培养基为基础的特异性显色生化鉴定技术在当前能更好地与传统方法相接轨，这种技术可以把检测、计数和初步鉴别一次完成，大幅度提高检测的速度和准确性，检测成本较低，因此其应用前景广阔。
目前国内外已有的沙门氏菌显色培养基利用的原理为：沙门氏菌能利用丙烯乙二醇产酸以及不含β-半乳糖苷酶，但大肠杆菌及其它大肠菌群不能利用丙烯乙二醇产酸以及含β-半乳糖苷，因此在基础培养基中添加丙烯乙二醇及β-半乳糖苷酶的底物，这种显色培养基中沙门氏菌显示利用丙烯乙二醇产酸的色泽－亮红色，而大肠杆菌及其它大肠菌群呈现半乳糖苷酶的底物中显色基团的色泽－蓝绿色。如德国Merck公司生产的显色培养基Rambach agar以及国内的某些品牌的培养基，这种原理的显色培养基不可以检测沙门氏菌中的伤寒沙门氏菌和甲副伤寒沙门氏菌，这两种菌在此类显色培养基上不能显示特征性的色泽。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测沙门氏菌的显色培养基。
本发明的所采用的技术方案为：
一种用于检测沙门氏菌的显色培养基，每1000mL培养基含有琼脂10～18g、蛋白胨8～20g、牛肉浸粉2～10g、氯化钠3～10g、表面活性剂 1～10g、辛酸酯酶显色底物0.1～0.7g、β-半乳糖苷酶显色底物0.1～0.6g、氨基己糖苷酶显色底物0.1～0.6g、酶诱导剂 0.05～0.3g、胆盐3～10g、新生霉素5～20mg。
辛酸酯酶显色底物为5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯（Magenta-caprylate）。
β-半乳糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）。
氨基己糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（X-GLUCOSAMINIDE）。
表面活性剂为吐温系列中的任一种。
酶诱导剂为IPTG、1-硫代-Β-D-乙基半乳糖苷、1-O-甲基-b-D-吡喃半乳糖苷、甲基-1-硫代-B -D-半乳糖苷、苯基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷中的任一种。
胆盐为牛胆盐、猪胆盐、三号胆盐、去氧胆酸钠中的至少一种。
优选的，用于检测沙门氏菌的显色培养基，每1000mL培养基含有琼脂 15g、蛋白胨12g、牛肉浸粉5g、氯化钠5g、吐温-20 5g、5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯0.35g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷0.4g、IPTG 0.15g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷0.4g、猪胆盐6g、新生霉素12mg。
本发明在培养基中添加了5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯，沙门氏菌（包括亚利桑那沙门氏菌亚属）、弗氏柠檬酸杆菌和念珠菌在辛酸酯酶作用下显示出紫红色色泽。
本发明在培养基中添加了表面活性剂，其作用在于诱导沙门氏菌的辛酸酯酶，使之能利用显色底物5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯，从而沙门氏菌显示出紫红色色泽。表面活性剂包括吐温系列（吐温-20、吐温-40、吐温-60和吐温-80），吐温-20可使辛酸酯酶的活力得到相对高的表达，因此优选了吐温-20。
本发明在培养基中添加了β-半乳糖苷酶显色底物，其它的肠杆菌属如大肠杆菌和大肠菌群在β-半乳糖苷酶作用下分解底物，游离出显色基团，使菌落呈现出显色基团的色泽－蓝绿色。本发明在培养基中添加了氨基己糖苷酶显色底物，念珠菌在氨基己糖苷酶作用下分解底物，游离出显色基团，使菌落呈现出显色基团的色泽－蓝绿色。由于弗氏柠檬酸杆菌同时具有辛酸酯酶和β-半乳糖苷酶，而念珠菌同时具有辛酸酯酶和氨基己糖苷酶，通过显色底物量的调整以及诱导剂对酶的诱导，最终使弗氏柠檬酸杆菌和念珠菌呈现出5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷底物以及5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷底物显色基团的色泽－蓝绿色，从而可以与沙门氏菌相区分。
本发明在培养基中添加了酶的诱导剂，其作用在于诱导肠杆菌属的β-半乳糖苷酶，使之能利用显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷，从而使肠杆菌属显示出蓝绿色色泽。诱导剂包括了IPTG（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside dioxane free）、1-硫代-Β-D-乙基半乳糖苷（Ethyl-beta-D-thiogalactopyranoside）、1-O-甲基-b-D-吡喃半乳糖苷（1-O-Methyl-beta-D-galactopyranoside）、甲基-1-硫代-Β-D-半乳糖苷（Methyl-beta-D-thiogalactopyranoside）以及苯基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Phenyl-beta-D-thiogalactopyranoside）。IPTG较适于固体培养基中诱导β-半乳糖苷酶的表达，其它几种诱导剂比较适合于液体培养基中诱导β-半乳糖苷酶的表达。
本发明中辛酸酯酶显色底物、β-半乳糖苷酶显色底物和氨基己糖苷酶底物是由糖苷类特定结合物和显色基团合成的，显色底物包括X-caprylate、Salmon-caprylate、Magenta-caprylateg、MU-caprylate、Ｘ-Gal、Salmon-Gal、Magenta–Gal、Iodo–Gal、Magenta–NAG、Salmon- NAG和X-NAG等。本发明采用了5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯（Ｍagenta-caprylate）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）和5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷（X-GLUCOSAMINIDE），这三种底物的搭配在此显色培养基中检测辛酸酯酶、β-半乳糖苷酶及氨基己糖苷酶的活性比其它显色底物更有效。
本发明在培养基中添加了胆盐，可抑制样品中大部分的革兰氏阳性球菌。胆盐包括牛胆盐、猪胆盐、三号胆盐、去氧胆酸钠和混合胆盐。本发明优选猪胆盐。
本发明在培养基中添加了抗生素，可抑制样品中部分的革兰氏阴性杆菌如容易扩散生长的变型杆菌以及气单胞菌。
本发明的有益效果是：
本发明的显色培养基用于检测沙门氏菌，检测灵敏度高，特异性好，直接根据菌落颜色就可对菌株作出鉴别，检测周期短、可操作性强、适用于处理大通量的样本、易于产业化生产，可对临床标本、食品、化妆品和环境中沙门氏菌进行全面、系统、准确的检测和初步鉴定，为微生物快速检测提供了新的途径。
本发明的显色培养基能准确快速地从肠道菌中鉴别出大沙门氏菌，本发明的显色培养基中添加了辛酸酯酶显色底物，特点为沙门氏菌含有相对应的酶而其它大部分肠道菌不含，添加了β-半乳糖苷酶显色底物，大部分其它肠道菌含有相对应的酶而沙门氏菌不含，添加了氨基己糖苷酶显色底物，念珠菌含有相对应的酶而沙门氏菌不含，以显色反应来区分目标菌株，观察方便，还添加了胆盐和抗生素，能抑制部分的革兰氏阳性球菌和阴性杆菌。
具体实施方式
一种用于检测沙门氏菌的显色培养基，每1000mL培养基含有琼脂10～18g、蛋白胨8～20g、牛肉浸粉2～10g、氯化钠3～10g、表面活性剂1～10g、辛酸酯酶显色底物0.1～0.7g、β-半乳糖苷酶显色底物0.1～0.6g、氨基己糖苷酶显色底物0.1～0.6g、酶诱导剂 0.05～0.3g、胆盐3～10g、新生霉素5～20mg。
辛酸酯酶显色底物为5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯（Magenta-caprylate）。
β-半乳糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）。
氨基己糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（X-GLUCOSAMINIDE）。
表面活性剂为吐温系列中的任一种。
酶诱导剂为IPTG、1-硫代-Β-D-乙基半乳糖苷、1-O-甲基-b-D-吡喃半乳糖苷、甲基-1-硫代-Β-D-半乳糖苷、苯基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷中的任一种。
胆盐为牛胆盐、猪胆盐、三号胆盐、去氧胆酸钠中的至少一种，优选为猪胆盐。
本发明的显色培养基用于检测沙门氏菌的方法，包括如下步骤：
1) 制备显色平板：每1000mL去离子水中加入上述显色培养基的原料，搅拌，加热煮沸至完全溶解，调节pH值约为7.0±0.2，煮沸2min，待冷至约50℃倒平板，备用；
2) 接种培养：将样品或含样品的增菌液接种到显色平板上，37℃培养22～26h；
3) 结果分析：若显色平板上出现光滑、略突起、直径1～3mm、边缘整齐的紫红色的菌落，说明该样品存在沙门氏菌，其它肠道菌或被抑制或为显示蓝绿色或无色的菌落。
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。
5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷和新生霉素均购自Sigma公司。
实施例1
一种用于检测沙门氏菌的显色培养基，每1000mL培养基含有琼脂 15g、蛋白胨12g、牛肉浸粉5g、氯化钠5g、吐温-20 5g、5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯0.35g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷0.4g、IPTG 0.15g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷0.4g、猪胆盐6g、新生霉素12mg。
实施例2
一种用于检测沙门氏菌的显色培养基，每1000mL培养基含有琼脂 11g、蛋白胨15g、牛肉浸粉3g、氯化钠7g、吐温-20 2g、5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯0.1g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷0.4g、IPTG 0.05g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷0.3g、猪胆盐2g、新生霉素15mg。
实施例3
一种用于检测沙门氏菌的显色培养基，每1000mL培养基含有琼脂 18g、蛋白胨10g、牛肉浸粉7g、氯化钠6g、吐温-20 7g、5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯0.4g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷0.3g、IPTG 0.3g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷0.5g、猪胆盐8g、新生霉素10mg。
实施例4
一种用于检测沙门氏菌的显色培养基，每1000mL培养基含有琼脂 16g、蛋白胨8g、牛肉浸粉6g、氯化钠4g、吐温-20 6g、5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯0.7g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷0.1g、IPTG 0.10g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷0.2g、猪胆盐6g、新生霉素11mg。
特异性试验：
将SalmonellatyphimuriumCMCC(B)50115、S.typhimurium ATCC 14028、S.typhiCMCC(B)50071、S.ehteritidisCMCC(B)50335、S.arizonaCMCC(B)47001、S.thompsonCMCC(B)50023、S.paratyphi A CMCC(B)50093、S.paratyphi B CMCC(B)50004、Streptococci faecalis ATCC29212、Staphylococci aureus ATCC6538、CitrobacterfreundiiATCC43864、Enterobacter aerogen CMCC(B) 45103、E..cloacae CMCC(B) 45301、Klebsiella pneumoniae ATCC13048、Escherichia coli ATCC25922、Proteus vulgaris CMCC(B)49027、ShigellaflexneriCMCC(B)51572、E.sakazakiiATCC29544、Pseudomonas aeruginosa ATCC9027、Candidaalbicans ATCC10231 20种标准菌株分别制成适当浓度的标准菌悬液（浓度为106～108cfu/ml），分别划线接种到实施例1显色培养基（简称HKM）及对照厂家的显色培养基和传统培养基XLD（购自BD公司）制成的平板上，37℃培养 24小时，观察显色效果。对照厂家的显色培养基有：科玛嘉CHROMagar TM Salmonellaagar显色培养基（简称科玛嘉），OXOID沙门氏菌显色培养基（简称OXOID），国内厂家Ｉ沙门氏菌显色培养基（简称厂家Ｉ），国内厂家ＩＩ沙门氏菌显色培养基（简称厂家ＩＩ）。检测结果见表1。
上述培养基检测的特征性菌为沙门氏菌，五种显色培养基检测的特征性菌落色泽为紫红色，XLD检测的特征性菌落色泽为红色。
由表1可知，沙门氏菌属在HKM和XLD平板上均显示阳性的特征性色泽，对于S.typhimuriumCMCC(B)50115和S.thompson，在科玛嘉的平板上均不能显示阳性的特征性色泽；对于S.typhi和S.paratyphi A，在OXOID和国内厂家ＩＩ的平板上，前者受抑制后者不能显示阳性的特征性色泽；而对于S.arizona，在科玛嘉、国内厂家Ｉ和国内厂家ＩＩ的平板上均不能显示阳性的特征性色泽；其它非沙门氏菌属的菌，在HKM和OXOID平板上均可以与沙门氏菌属相区分，C .freundii 、S. flexneri和P.vulgaris在XLD平板上形态与沙门氏菌相似，均不可以与沙门氏菌属相区分；E.sakazakii在国内厂家Ｉ和国内厂家ＩＩ的平板上均不可以与沙门氏菌属相区分；E.aerogenes在科玛嘉和国内厂家Ｉ的平板上均不可以与沙门氏菌属相区分；S. faecalis、S. aureus和P. aeruginosa在各种平板上（除XLD平板）均受抑制。表明本发明所述的沙门氏菌显色培养基与OXOID平板在特异性显色方面均无明显差异，均优于科玛嘉等其它四种平板。
灵敏度试验：
将上述的4种沙门氏菌阳性标准菌株：S.typhimuriumCMCC(B)50115、S.typhimurium ATCC 14028、S.paratyphi B CMCC(B)50004和S.ehteritidisCMCC(B)50335分别制成适当浓度的标准菌悬液（浓度为102～103cfu/ml），用螺旋接种法接种到用实施例1 HKM，科玛嘉、OXOID，厂家I和厂家II显色培养基及胰蛋白胨大豆琼脂培养基（简称TSA）等6种培养基制成的平板上，37℃培养24 h，计算各显色培养基的生长率。结果见表2。
由表2可知，在灵敏度检测方面，各种显色培养基的生长率相当，差异无统计学意义P=0.308，P＞0.05。在菌落大小方面，4株沙门氏菌在HKM和上厂家II均比较大，而在科玛嘉、OXOID和厂家I平板上稍小。表明本发明所述的沙门氏菌显色培养基对上述四种标准菌株与国内外显色培养基在检测灵敏度方面无明显差异，在乙副伤寒沙门氏菌生长率方面均优于OXOID厂家，在肠炎沙门氏菌生长率方面优于科玛嘉和厂家I产品。
综上所述，本发明所述的沙门氏菌显色培养基对目标菌沙门氏菌检测灵敏度较高，特异性强，综合检测效果可达到进口OXOID同类产品水平，优于科玛嘉和国内已有显色培养基。
虽然本发明已经对具体实施案例进行了描述，但是本发明并不局限于此，本行业技术人员应该意识到，在本发明所述原理下可以对本发明做多种修饰和改变。因此，本发明意欲涵盖在权利要求书及其同等物范围内的所有这些修饰和改变。
Claims (9)
1.一种用于检测沙门氏菌的显色培养基，每1000mL培养基含有琼脂10～18g、蛋白胨8～20g、牛肉浸粉2～10g、氯化钠3～10g、表面活性剂 1～10g、辛酸酯酶显色底物0.1～0.7g、β-半乳糖苷酶显色底物0.1～0.6g、氨基己糖苷酶显色底物0.1～0.6g、酶诱导剂 0.05～0.3g、胆盐2～10g、新生霉素5～20mg。
2.根据权利要求1所述的用于检测沙门氏菌的显色培养基，其特征在于：辛酸酯酶显色底物为5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯（Magenta- caprylate）。
3.根据权利要求1所述的用于检测沙门氏菌的显色培养基，其特征在于：β-半乳糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-β- D-半乳糖苷（X-Gal）。
4.根据权利要求1所述的用于检测沙门氏菌的显色培养基，其特征在于：氨基己糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（X-Glucosaminide）。
5.根据权利要求1所述的用于检测沙门氏菌的显色培养基，其特征在于：表面活性剂为吐温系列中的任一种。
6.根据权利要求1所述的用于检测沙门氏菌的显色培养基，其特征在于：酶诱导剂为IPTG、1-硫代-Β-D-乙基半乳糖苷、1-O-甲基-b-D-吡喃半乳糖苷、甲基-1-硫代-Β-D-半乳糖苷、苯基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷中的任一种。
7.根据权利要求1所述的用于检测沙门氏菌的显色培养基，其特征在于：胆盐为牛胆盐、猪胆盐、三号胆盐、去氧胆酸钠中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的用于检测沙门氏菌的显色培养基，其特征在于：胆盐为猪胆盐。
9.根据权利要求1～8任一项所述的用于检测沙门氏菌的显色培养基，其特征在于：每1000mL培养基含有琼脂 15g、蛋白胨12g、牛肉浸粉5g、氯化钠5g、吐温-20 5g、5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯0.35g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷0.4g、IPTG 0.15g、氨基己糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷0.4g、猪胆盐6g、新生霉素12mg。
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