MX2014007889A - Metodo para detectar un microorganismo de salmonella. - Google Patents

Metodo para detectar un microorganismo de salmonella.

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Patrick A Mach
Christine A Binsfeld
Mara S Celt
Adam J Stanenas
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Abstract

Se proporciona un método para detectar un microorganismo de Salmonella. El método incluye el uso de un medio de crecimiento selectivo, un primer sistema indicador que se convierte a un primer producto detectable por un microorganismo de Salmonella, y un segundo sistema indicador que se convierte a un segundo producto detectable por la actividad enzimática de ß-galactosidasa. El método comprende adicionalmente inocular el medio de crecimiento e incubar el medio de crecimiento inoculado a una temperatura mayor a 40 centígrados.

Description

METODO PARA DETECTAR UN MICROORGANISMO DE SALMONELLA Antecedentes de la Invención La familia Enterobacteriaceae incluye un gran número de bacterias metabólicamente diversas, facultativamente anaeróbicas que son capaces de fermentar azúcares a ácido láctico y otros productos finales. La familia incluye varios patógenos humanos bien conocidos tal como Escherichia coli, varias subespecies de Salmonella, Yersinia pestis, varias especies de Klebsiella, y varias especies de Shigella .
El género Salmonella incluye dos especies, S. entérica y S. bongori, que incluyen subespecies capaces de provocar enfermedad en humanos. Algunas de las salmonellas patógenas se pueden transmitir a humanos mediante la ingestión de bebidas o alimentos contaminados. Puede ser difícil la detección de microorganismos de Salmonella en muestras alimenticias debido a la presencia de números relativamente bajos de los microorganismos de Salmonella en la muestra, la presencia de números relativamente altos de microorganismos entéricos no de Salmonella cercanamente relacionadas en la muestra, y/o el presencia de materiales no de microorganismos (por ejemplo, partículas alimenticias o productos químicos solubles) en la muestra que interfieren en el crecimiento o detección de los microorganismos de REF. : 249626 Salmonella.
Se han desarrollado una variedad de medios de cultivo microbiológico selectivos y/o diferenciales para detectar microorganismos de Salmonella en una muestra y para distinguirlos de uno o más microorganismos no de Salmonella . Típicamente, estos medios de cultivo incluyen un agente selectivo que inhibe el crecimiento de los microorganismos no entéricos. Además, muchos de estos medios de cultivo dependen de uno o más sistemas indicadores diferenciales para distinguir entre microorganismos de Salmonella y no de Salmonella .
A pesar de la variedad de medios de cultivo microbiológico para detectar en una muestra microorganismos de Salmonella, permanece la necesidad de métodos mejorados para detectar en una muestra un microorganismo de Salmonella .
Breve Descripción de la Invención En general, la presente descripción se refiere a un método para detectar un microorganismo de Salmonella. En particular, el método incluye el uso de un medio de crecimiento selectivo que incluye un sistema indicador diferencial positivo (es decir, un sistema indicador que incluye un compuesto indicador que se convierte a un producto detectable por un microorganismo de Salmonella) y un sistema indicador diferencial negativo (es decir, un sistema indicador que incluye un compuesto indicador que se puede convertir a un producto detectable por la actividad de la enzima ß-galactosidasa y, de esta manera no se convierte a un compuesto detectable por un microorganismo de Salmonella) . De manera sorprendente, los miembros de la especie S. bongori no reaccionan con el segundo sistema indicador a temperaturas de incubación por arriba de 40 centígrados.
En un aspecto, la presente descripción proporciona un método para detectar un microorganismo de Salmonella . El método puede comprender proporcionar una muestra que se va a probar, un dispositivo de cultivo, un medio nutriente que facilita el crecimiento de un microorganismo entérico Gramnegativo, un primer agente selectivo que inhibe el crecimiento de microorganismos Grampositivos , un primer sistema indicador diferencial que comprende un primer compuesto indicador diferencial que se puede convertir a un primer compuesto detectable por un miembro de un grupo de microorganismos de Salmonella que incluye un microorganismo de la especie Salmonella bongori, y un segundo sistema indicador diferencial que comprende un segundo compuesto indicador diferencial que se puede convertir a un segundo producto detectable por una actividad de enzima ß-galactosidasa . El método puede comprender adicionalmente poner en contacto en el dispositivo de cultivo el medio nutriente, el primer agente selectivo, el primer sistema indicador diferencial, y el segundo sistema indicador diferencial con una muestra para formar un dispositivo de cultivo inoculado, incubar el dispositivo de cultivo inoculado durante un primer período de tiempo a una temperatura mayor de 40 centígrados, observar el dispositivo de cultivo para detectar la presencia o ausencia del primer producto detectable, y observar el dispositivo de cultivo para detectar una presencia o una ausencia del segundo producto detectable; en donde la observación de la presencia del primer producto detectable indica una posible presencia en la muestra de un microorganismo de Salmonella; en donde la observación de la presencia del primer producto detectable yuxtapuesto con el segundo producto detectable indica la presencia en la muestra de un microorganismo diferente de un miembro productor de ß-galactosidasa de la especie Salmonella bongori .
En cualquier modalidad, el dispositivo de cultivo se puede proporcionar como un dispositivo de cultivo de película delgada con el medio de nutriente, el primer agente selectivo, el primer sistema indicador diferencial, y el segundo sistema indicador diferencial colocado en el mismo en una forma sustancialmente deshidratada. En cualquiera de las modalidades anteriores, la observación de la ausencia del primer producto detectable puede indicar una ausencia de un microorganismo de Salmonella en la muestra. En cualquiera de las modalidades anteriores, la observación del medio nutriente para detectar la presencia del primer producto detectable puede comprender observar el dispositivo de cultivo para detectar un primer color detectable. En cualquiera de las modalidades anteriores, el primer compuesto indicador diferencial puede comprender un sustrato enzimático. En algunas modalidades, el sustrato enzimático puede comprender un sustrato enzimático para detectar actividad de la enzima caprilato-esterasa o para detectar la actividad de la enzima a-galactosidasa . En algunas modalidades, el sustrato enzimático se puede seleccionar del grupo que consiste de caprilato de 5-bromo-6-cloro-3-indolilo, caprilato de 4-nitrofenilo, caprilato de 2-naftilo, 5-bromo-4 -cloro-3-indoxil- -D-galactopiranósido, resorufinil-a-D-galactopiranósido, y -nitrofenil-a-D-galactopiranósido .
En cualquiera de las modalidades anteriores, el primer sistema indicador diferencial puede comprender un indicador de pH y al menos un carbohidrato seleccionado del grupo que consiste de melibiosa, 2 -desoxi-D-ribosa, manitol, L-arabinosa, dulcitol, maltosa, L-ramnosa, trehalosa, D-xilosa, y sorbitol .
En cualquiera de las modalidades anteriores, el primer producto detectable puede ser sustancialmente soluble en agua, en donde la observación del primer producto detectable puede comprender observar una zona coloreada adyacente a una colonia microbiana.
En cualquiera de las modalidades anteriores, la observación del segundo producto detectable comprende observar el dispositivo de cultivo para detectar un segundo color detectable. En cualquiera de las modalidades anteriores, el segundo compuesto indicador diferencial se puede seleccionar del grupo que consiste de 5-bromo-4-cloro-3 -indolil-P-D-galactopiranósido, 5 -bromo-3 -indolil-P-D-galactopiranósido, 5-bromo-6-cloro-3-indolil-P-D-galacto-piranósido, 2-nitrofenil-p-D-galactopiranósido, y 4-nitrofenil-p-D-galactopiranósido .
En cualquiera de las modalidades anteriores, el primer producto detectable puede ser sustancialmente soluble en agua y el segundo producto detectable puede ser sustancialmente insoluble en agua o, de manera alternativa, en donde el primer producto detectable puede ser sustancialmente insoluble en agua y el segundo producto detectable puede ser sustancialmente soluble en agua .
En cualquiera de las modalidades anteriores, el primer agente selectivo se selecciona del grupo que consiste de un antibiótico, sales biliares, sales biliares No. 3, ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido desoxicólico, violeta cristalina, novobiocina, ácido nalidíxico, polimixina B, estreptomicina, meticilina, cefsoludin, o una combinación de cualquiera de dos o más de los agentes selectivos anteriores. En cualquiera de las modalidades anteriores, el dispositivo de cultivo puede comprender adicionalmente al menos un segundo agente selectivo, en donde el por lo menos un segundo agente selectivo inhibe el crecimiento de al menos un microorganismo entérico Gramnegativo que no es un miembro del género Salmonella. En algunas modalidades, el segundo agente selectivo se puede seleccionar del grupo que consiste de un antibiótico de ß-lactama, un antibiótico de aminoglucósido, un antibiótico de quinolona, un antibiótico de sulfa, un antibiótico de polimixina, y una combinación de cualquiera de dos o más de los antibióticos anteriores. En algunas modalidades, el por lo menos un segundo agente selectivo comprende una combinación de ácido nalidíxico, estreptomicina y polimixina B. En cualquiera de las modalidades anteriores, la incubación del dispositivo de cultivo comprende incubar el dispositivo de cultivo a una temperatura entre 41-44 centígrados, inclusive.
En cualquiera de las modalidades anteriores, el método puede comprender adicionalmente proporcionar un artículo con un tercer sistema indicador diferencial que comprende un tercer compuesto indicador diferencial que se puede convertir por un microorganismo de Salmonella a un tercer producto detectable, poner en contacto el artículo con el dispositivo de cultivo inoculado, incubar el dispositivo de cultivo inoculado durante un segundo período de tiempo, y observar el dispositivo de cultivo para detectar el tercer producto detectable; la observación del tercer producto detectable yuxtapuesto con el primer producto detectable indica la presencia en la muestra de un microorganismo de Salmonella .
En cualquiera de las modalidades anteriores, el método puede comprender adicionalmente proporcionar un compuesto indicador no diferencial que se puede convertir por un microorganismo entérico a un cuarto producto detectable y observar el dispositivo de cultivo para detectar la presencia o ausencia del cuarto producto detectable; en donde la puesta en contacto en el dispositivo de cultivo del medio nutriente, el primer agente selectivo, el primer sistema indicador diferencial, y el segundo sistema indicador diferencial con una muestra para formar un dispositivo de cultivo inoculado comprende adicionalmente poner en contacto en el dispositivo de cultivo el medio nutriente, el primer agente selectivo, el primer sistema indicador diferencial, el segundo sistema indicador diferencial, y el compuesto indicador no diferencial con la muestra para formar el dispositivo de cultivo inoculado.
En cualquiera de las modalidades anteriores, la observación del dispositivo de cultivo puede comprender observar visualmente el dispositivo de cultivo. En cualquiera de las modalidades anteriores, la observación del dispositivo de cultivo puede comprender la creación de una imagen del dispositivo de cultivo usando un dispositivo de formación de imágenes. En cualquiera de las modalidades anteriores, el método puede comprender adicionalmente analizar la imagen usando un procesador. En cualquiera de las modalidades anteriores, el método puede comprender adicionalmente enumerar varias colonias formadas por un microorganismo que corresponde al grupo.
Las palabras "preferida" y "preferentemente" se refieren a modalidades de la invención que pueden otorgar ciertos beneficios, bajo ciertas circunstancias. Sin embargo, también se prefieren otras modalidades, bajo las mismas u otras circunstancias. Adicionalmente, la cita de una o más modalidades preferidas no implica que otras modalidades no sean útiles, y no se propone excluir otras modalidades del alcance de la invención.
El "microorganismo de Salmonella" , como se usa en la presente, se refiere a cualquier microorganismo que corresponda al género Salmonella .
El "sistema indicador diferencial", como se usa en la presente, se refiere a uno o más compuestos que se usan para distinguir dos tipos de microorganismos con base a su capacidad respectiva para convertir un compuesto indicador diferencial a un producto detectable. En algunos casos, por ejemplo, el compuesto indicador diferencial (por ejemplo, 2-nitrofenil--D-galactósido) se puede convertir por un tipo de microorganismo directamente al producto detectable (por ejemplo, 2 -nitrofenol ) . En algunos casos, por ejemplo, el compuesto indicador diferencial (por ejemplo, 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-a-D-galactopiranósido) se puede convertir por un tipo de microorganismo a un producto intermedio que, en la presencia de aire puede reaccionar para formar el producto detectable (un tipo de tinte índigo) . En algunos casos, por ejemplo, el compuesto indicador diferencial (por ejemplo, un carbohidrato fermentable tal como melibiosa) se puede convertir por un tipo de microorganismo al producto detectable (por ejemplo, ácido láctico) , que puede reaccionar con otro componente del sistema indicador diferencial (por ejemplo, un indicador de pH tal como rojo de clorofenol) para provocar que cambie el color detectable en el otro componente .
"Agente selectivo", como se usa en la presente, se refiere a un compuesto químico que inhibe el crecimiento del primer microorganismo o un primer grupo de microorganismos a un mayor grado que un segundo microorganismo o un segundo grupo de microorganismos, favoreciendo de este modo el crecimiento de los microorganismos menos inhibidos.
Los términos "comprende" y variaciones de los mismos no tienen un significado limitante donde estos términos aparezcan en la descripción y las reivindicaciones .
Como se usa en la presente, "un", "una", "el", "la" "al menos uno" y "uno o más" se usan de manera indistinta. De esta manera, por ejemplo, se puede interpretar que un microorganismo significa "uno o más" microorganismos .
El término "y/o" significa uno o todos los elementos listados o una combinación de dos o más de los elementos listados.
También, las citas de intervalos numéricos por puntos finales incluyen todos los números abarcados dentro del intervalo (por ejemplo, 1 a 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etcétera).
La breve descripción anterior de la presente invención no propone que describa cada modalidad descrita o cada implementación de la presente invención. La descripción que sigue ejemplifica más en particular modalidades ilustrativas. En varios lugares a todo lo largo de la solicitud, se proporciona guía a través de listas de ejemplos, ejemplos que se pueden usar en varias combinaciones. En cada caso, la lista citada sirve solo como un grupo representativo y no se debe interpretar como una lista exhaustiva.
Los detalles adicionales de estas y otras modalidades se exponen en las Figuras anexas y en la descripción a continuación. Otras características, objetos y ventajas llegarán a ser evidentes a partir de la descripción y las Figuras, y de las reivindicaciones.
Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra un diagrama de bloques de una modalidad de un método para detectar un microorganismo de Salmonella de acuerdo a la presente descripción.
La Figura 2 muestra un diagrama de bloques de pasos analíticos adicionales y pasos opcionales de proceso asociados con una modalidad del método mostrado en la Figura 1.
Descripción Detallada de la Invención El género Salmonella incluye dos especies, Salmonella entérica y Salmonella bongori. La relación genética de las dos especies se ha estudiado por Fookes et al. ("Salmonella bongori Provides Insights into the Evolution of the Salmonellae" , PLOs Pathogens en www.plospathogens.org, 201 1, volumen 7, número de artículo el002191, páginas 1-16, la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad) . Aunque se conocen mejor las subespecies de S. entérica que las de S. bongori por su capacidad para infectar y provocar enfermedad en humanos, también se ha mostrado que S. bongori provoca infecciones humanas. De esta manera, una prueba diseñada para detectar microorganismos de Salmonella potencialmente patógenos debe ser capaz de detectar ambas especies .
La presente descripción se refiere en general a un método para detectar en una muestra microorganismos de Salmonella. En particular, la presente descripción se refiere a un método de detección basado en crecimiento que es capaz de distinguir ciertos organismos de Salmonella productos de ß-galactosidasa (por ejemplo, miembros de la especie S. bongori) de microorganismos no de Salmonella productores de ß-galactosidasa (por ejemplo, Escherichia coli y otros miembros productores de ß-galactosidasa de la familia Enterobacteriaceae) . El método inventivo combina un medio de crecimiento selectivo que incluye una pluralidad de reactivos indicadores diferenciales con una temperatura elevada de incubación para diferenciar microorganismos de S. bongori .
La detección e identificación basada en crecimiento de Salmonella requiere en general el uso de reacciones bioquímicas que detectan de manera específica cepas de Salmonella en la presencia de microorganismos no de Salmonella. Desdichadamente, la mayoría de los sistemas convencionales de detección no proporciona la especificidad adecuada para diferenciar microorganismos de Salmonella de microorganismos de Bnfcerojbacte-riaceae no de Salmonella que pueden estar presentes en la muestra. Las pruebas requieren frecuentemente reactivos y procedimientos adicionales (por ejemplo, pruebas inmunológicas o genéticas) para diferenciar microorganismos no de Salmonella de microorganismos de Salmonella encontrados en una muestra.
Por desgracia, algunas de las reacciones que se usan comúnmente para detectar grupos de microorganismos entéricos no de Salmonella (por ejemplo, bacterias coliformes) no diferencian de manera negativa todas las cepas de Salmonella . Por ejemplo, hay algunas cepas de Salmonella que son positivas a lac (producen ß-D-galactosidasa) y de esta manera, no se diferencian de manera negativa de los microorganismos no de Salmonella en pruebas que usan sustratos de enzimas de ß-galactosidasa (por ejemplo, 5-bromo-4-cloro-3 -indolil-p-D-galactopiranósido) . Los investigadores han descubierto que ciertas cepas de Salmonella positivas a ß-D-galactosidasa no reaccionan con los sustratos enzimáticos de ß-galactosidasa cuando se incuban a temperaturas elevadas. Además, la temperatura elevada de incubación puede inhibir el crecimiento de algunos microorganismos productores de ß-galactosidasa no de Salmonella y/o no afecta sustancialmente la capacidad para detectar su actividad enzimática de ß-galactosidasa . De esta manera, la presente descripción proporciona un método para la diferenciación de colonias en crecimiento Salmonella bongori de colonias de otros microorganismos entéricos productos de ß-galactosidasa .
La presente descripción proporciona un método para detectar un microorganismo de Salmonella en una muestra. La Figura 1 muestra una modalidad de un método 10 para detectar un microorganismo de Salmonella en una muestra .
El método 10 comprende el paso 45 de proporcionar los componentes del procedimiento de prueba. La provisión de los componentes del procedimiento de prueba comprende proporcionar una muestra que se va aprobar, un dispositivo de cultivo, un medio nutriente que facilita el crecimiento de un microorganismo entérico Gramnegativo; un primer agente selectivo que inhibe el crecimiento de microorganismos Grampositivos , un primer sistema indicador diferencial que comprende un primer compuesto indicador diferencial que se puede convertir a un primer producto detectable por un miembro de un grupo de microorganismos de Salmonella que incluye un microorganismo de la especie Salmonella bongorx, y un segundo sistema indicador diferencial que comprende un segundo compuesto indicador diferencial que se puede convertir a un segundo producto detectable por una actividad enzimática de ß-galactosidasa . El método 10 comprende adicionalmente el paso 50 de poner en contacto los componentes del procedimiento de prueba para formar un medio nutriente inoculado. La puesta en contacto con los componentes del procedimiento de prueba para formar un medio nutriente inoculado incluye poner en contacto; en el dispositivo de prueba; el medio nutriente, el agente selectivo, el primer sistema indicador diferencial, y el segundo sistema indicador diferencial con la muestra para formar un medio de cultivo inoculado. El método 10 comprende adicionalmente el paso 55 de incubar el medio de cultivo inoculado durante un primer periodo de tiempo a una temperatura mayor de 40 grados C y el paso 60 de observar el dispositivo de cultivo para detectar la presencia o ausencia del primer producto detectable y observar el dispositivo de cultivo para detectar la presencia o ausencia del segundo producto detectable. En estas modalidades, la observación de la presencia del primer producto detectable indica una posible presencia en la muestra de un microorganismo de Salmonella (por ejemplo, Salmonella entérica y/o Salmonella bongori) . La observación de la presencia del primer producto detectable yuxtapuesto con el segundo producto detectable indica la presencia en la muestra de un microorganismo diferente de un miembro productor de ß-galactosidasa de la especie Salmonella bongori.
En algunas modalidades, el método 10 puede comprender adicionalmente el paso opcional 65 de poner en contacto el medio nutriente inoculado con un tercer sistema indicador diferencial que comprende un tercer compuesto indicador diferencial que se puede convertir por un microorganismo de Salmonella a un tercer producto detectable, como se describe en la presente.
El tercer sistema indicador diferencial se puede poner en contacto con el medio nutriente inoculado usando una variedad de procedimientos, incluyendo aquellos descritos en la presente para poner en contacto el primer compuesto indicador diferencial, el segundo compuesto indicador diferencial, el tercer compuesto indicador diferencial, o el compuesto indicador no diferencial con la muestra y/o medio nutriente. Adicionalmente , el tercer sistema indicador diferencial se puede poner en contacto con el medio nutriente inoculado después del primer período de incubación al poner en contacto un artículo que comprende el tercer sistema indicador con el medio nutriente inoculado. Esto se puede realizar, por ejemplo, al usar un artículo que tiene un revestimiento que comprende el tercer sistema indicador diferencial. Por ejemplo, el artículo puede comprender un revestimiento y/o un sustrato revestido como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 6,022,682; que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.
Después de que el tercer sistema indicador diferencial que comprende un tercer compuesto indicador diferencial se pone en contacto con el medio nutriente inoculado, el método puede incluir el paso opcional 70 de incubar la placa durante un segundo período de tiempo. Durante el segundo período de incubación, un microorganismo de Salmonella, si está presente, puede convertir el tercer compuesto indicador diferencial a un tercer producto detectable .
En algunas modalidades, el método 10 puede comprender adicionalmente el paso opcional (no mostrado) de proporcionar un compuesto indicador no diferencial. En estas modalidades, la puesta en contacto; en el dispositivo de cultivo; de la muestra, el medio nutriente, el primer agente selectivo, el primer sistema indicador diferencial, y el segundo sistema indicador diferencial para formar un medio de cultivo inoculado puede comprender además opcionalmente poner en contacto; en el dispositivo de cultivo, la muestra, el medio nutriente, el primer agente selectivo, el primer sistema indicador diferencial, el segundo sistema indicador diferencial con un compuesto indicador no diferencial para formar el medio de cultivo inoculado. El compuesto indicador no diferencial se puede poner en contacto con los otros componentes del medio de cultivo inoculado usando cualquier método adecuado incluyendo aquellos descritos en la presente .
Los compuestos indicadores no diferenciales adecuados incluyen compuestos indicadores que se metabolizan por, o se hacen reaccionar de otro modo con, microorganismos en crecimiento, y al hacerlo así, producen un cuarto producto detectable que puede provocar que las colonias microbianas o el medio nutriente adyacente a las colonias se coloree o tome fluorescencia para facilidad de visualización, formación en imágenes, y/o cuantificación. El indicador no diferencial, y el cuarto producto detectable derivado del mismo, no deben interferir sustancialmente con la detección del primer producto detectable o el segundo producto detectable y/o el tercer producto detectable, si está presente en el medio de cultivo inoculado. Los ejemplos no limitantes de compuestos indicadores no diferenciales adecuados incluyen indicadores cromogénicos reducción-oxidación, tal como cloruro de trifenil-tetrazolio, rojo de p-tolil-tetrazolio, violeta de tetrazolio, azul de veratril-tetrazolio, y sal disódica de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato. En una modalidad donde se pone en contacto un indicador no diferencial con el medio nutriente inoculado, la observación del dispositivo de cultivo para detectar la presencia del primero y/o segundo producto detectable puede comprender adicionalmente observar el dispositivo de cultivo para detectar la presencia del cuarto producto detectable.
Las muestras probadas en el método de la presente descripción incluyen una variedad de muestras que pueden ser sospechosas de contener un microorganismo de Salmonella. Las muestras de interés particular, materia prima, materia en proceso, o materia de producto terminado de operaciones de procesamiento de bebidas o procesamientos de alimentos. Otras muestras adecuadas incluyen, por ejemplo, muestras de agua (por ejemplo, agua superficial, agua de proceso), muestras ambientales (por ejemplo, muestras de aire; muestras superficiales de paredes, pisos, drenajes, superficies en contacto con alimentos, equipos de proceso); y muestras clínicas) . Los ejemplos no limitantes de muestras clínicas incluyen muestras gastrointestinales, muestras rectales, y muestras fecales . Las muestras de prueba pueden incluir líquidos, así como sólidos disueltos o suspendidos en un medio líquido.
Los dispositivos de cultivo de la presente descripción incluyen cualquier dispositivo de cultivo que se usa para mantener un medio nutriente en un proceso para detectar microorganismos presentes en una muestra. En ciertas modalidades preferidas, el medio nutriente comprende un agente formador de gel para facilitar la enumeración de los microorganismos. Los ejemplos no limitantes de dispositivos adecuados de cultivo incluyen cajas de Petri, placas de múltiples concavidades, tubos, matraces, dispositivos de cultivo de película delgada (por ejemplo, los dispositivos de cultivo de película delgada descritos en las Patente de los Estados Unidos Nos. 4,565,783; 5,601,998; 5,681,712; 6,265,203, y 6,638,755, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad) , y similares .
En algunas modalidades, la provisión de un dispositivo de cultivo puede comprender proporcionar un dispositivo de cultivo que contiene un medio nutriente que facilita el crecimiento de un microorganismo entérico Gramnegativo, un primer agente selectivo que inhibe el crecimiento de microorganismos Grampositivos , un primer sistema indicador diferencial que comprende un primer compuesto indicador diferencial que se puede convertir a un primer producto detectable por un miembro de un grupo de microorganismos de Salmonella que incluye un microorganismo de la especie Salmonella bongori, y/o un segundo sistema indicador diferencial que comprende un segundo compuesto indicador diferencial que se puede convertir a un segundo producto detectable por una actividad enzimática de ß-galactosidasa .
En algunas modalidades, al menos un componente seleccionado del medio nutriente que facilita el crecimiento de un microorganismo entérico Gramnegativo; el primer agente selectivo que inhibe el crecimiento de microorganismos Grampositivos; el primer sistema indicador diferencial que comprende un primer compuesto indicador diferencial que se puede convertir a un primer producto detectable por un miembro de un grupo de microorganismos de Salmonella que incluye un microorganismo de la especie Salmonella bongori ; y/o el segundo sistema indicador diferencial que comprende un segundo compuesto indicador diferencial que se puede convertir a un segundo producto detectable por una actividad enzimática de ß-galactosidasa se proporciona (opcionalmente , en el dispositivo de cultivo) en un estado sustancialmente deshidratado. En estas modalidades, el por lo menos un componente deshidratado se puede rehidratar con un líquido acuoso (por ejemplo, agua, una solución de amortiguador, un diluyente, una muestra líquida) antes o durante el contacto con la muestra.
En algunas modalidades, el por lo menos un componente seleccionado del medio nutriente que facilita el crecimiento de un microorganismo entérico Gramnegativo; el primer agente selectivo que inhibe el crecimiento de microorganismos Grampositivos ; el primer sistema indicador diferencial que comprende un primer compuesto indicador diferencial que se puede convertir a un primer producto detectable por un miembro de un grupo de microorganismos de Salmonella que incluye un microorganismo de la especie Salmonella bongori; y/o el segundo sistema indicador diferencial que comprende un segundo compuesto indicador diferencial que se puede convertir a un segundo producto detectable por una actividad enzimática de ß-galactosidasa se mezcla con la muestra (por ejemplo, disuelve o diluye en una muestra líquida) antes de adicionar el componente al dispositivo de cultivo.
Los medios nutrientes de la presente descripción incluyen cualquier medio nutriente que facilita el crecimiento de un microorganismo entérico Gramnegativo. En técnica se conocen una variedad medios nutrientes adecuados. Los medios nutrientes adecuados incluyen nutrientes proteinaceos (por ejemplo, digestiones químicas y/o enzimáticas de proteínas animales o vegetales) , que pueden proporcionar carbono, nitrógeno, y energía para facilitar el crecimiento de microorganismos entéricos Gramnegativos . El medio nutriente puede comprender otros nutrientes (por ejemplo, minerales u otros componentes) , con la condición que no interfieran sustancialmente con la función del primer sistema diferencial indicador, el segundo sistema indicador diferencial, y/o el tercer sistema indicador diferencial, si está presente.
El primer sistema indicador diferencial de la presente descripción comprende un primer compuesto indicador diferencial que se puede convertir a un primer producto detectable por un microorganismo de Salmonella . De manera preferente, el primero compuesto indicador diferencial se puede convertir al primer producto detectable por un miembro de un grupo de microorganismos de Salmonella que incluye un microorganismo de la especie Salmonella bongori . De manera más específica, el primero compuesto indicador diferencial también se convierte al primer producto detectable por un microorganismo de Salmonella que corresponde a una especie diferente de S. bongori (por ejemplo, S. entérica) . En algunas modalidades, el primer sistema indicador diferencial comprende un primer compuesto indicador diferencial que se puede convertir a un primer producto detectable por al menos un microorganismo entérico no de Salmonella capaz de crecer en el dispositivo de cultivo.
En algunas modalidades, el primero compuesto indicador diferencial es un compuesto nutriente (por ejemplo, un carbohidrato) que se puede convertir (por ejemplo, mediante fermentación) por un microorganismo de Salmonella a un primer producto detectable (por ejemplo, un compuesto ácido, tal como ácido láctico, por ejemplo, y/o un gas tal como dióxido de carbono, a manera de ejemplo) . De manera preferente, el primer indicador diferencial comprende un compuesto nutriente que se convierte al primer producto detectable por una pluralidad de especies y/o subespecies de Salmonella al primer producto detectable. De manera más preferente, el primer indicador diferencial comprende un compuesto nutriente que no se convierte al primer producto detectable por muchas especies de microorganismos que no corresponden al género Salmonella . De manera aún más preferente, el primer indicador diferencial comprende un compuesto nutriente que no se convierte al primer producto detectable por un microorganismo no de Salmonella. Los ejemplos no limitantes de los primeros indicadores diferenciales adecuados incluyen un compuesto seleccionado del grupo que consiste de melibiosa, 2-desoxi-D-ribosa, manitol, L-arabinosa, dulcitol, maltosa, L-ramnosa, trehalosa, D-xilosa, y sorbitol .
En algunas modalidades, en donde un compuesto ácido es el primer producto detectable, el primer sistema indicador diferencial puede comprender además un indicador de pH. En la técnica se conocen varios indicadores de pH para detectar compuestos ácidos producidos por bacterias. Los ejemplos no limitantes de indicadores de pH adecuados incluyen rojo de fenol, rojo de clorofenol, rojo neutral, azul de bromotimol, púrpura de bromotimol. En algunas modalidades, en donde el primer producto detectable comprende un gas, el gas se puede detectar, por ejemplo, al atrapar el gas (por ejemplo, al atrapar el gas en un tubo Durham, en un caldo de cultivo, al atrapar el gas en un hidrogel en una dispositivo de cultivo de película delgada, como se describe en la Guía de Interpretación para la PETRIFILM Enterobacteriaceae Píate Count, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) .
En algunas modalidades, el primer compuesto indicador puede comprender un sustrato enzimático. Un sustrato enzimático cromogénico o fluorogénico adecuado que se convierte (por ejemplo, hidroliza por una enzima) a un primer producto detectable (por ejemplo, un producto coloreado o un producto fluorescente) por un miembro de un grupo de microorganismos de Salmonella que incluye un microorganismo de la especie Salmonella bongori . De manera preferente, el sustrato enzimático se convierte al primer producto detectable por un microorganismo de Salmonella que corresponde a una especie diferente de S. bongori (por ejemplo, S. entérica) . Los ejemplos no limitantes de sustratos enzimáticos adecuados incluyen sustratos enzimáticos para detectar la actividad enzimática de caprilato-esterasa o para detectar la actividad enzimática de a-galactosidasa . Los sustratos enzimáticos cromogénicos adecuados incluyen, por ejemplo, un sustrato enzimático seleccionado del grupo que consiste de caprilato de 5-bromo-6-cloro-3-indolilo, caprilato de 4-nitrofenilo, caprilato de 2 -naftilo, 5 -bromo-4-cloro-3 - indoxil-a-D-galactopiranósido, resorufinil -a-D-galactopiranósido, 4-nitrofenil-a-D-galacto-piranósido, y combinaciones de los mismos.
Los segundos sistemas indicadores diferenciales de la presente descripción comprenden un segundo compuesto indicador diferencial que se puede convertir a un segundo producto detectable por una actividad enzimática de ß- galactosidasa . Por consiguiente, el segundo sistema indicador diferencial distingue entre microorganismos que producen actividad enzimática de ß-galactosidasa y microorganismos que no producen actividad enzimática de ß-galactosidasa . Por ejemplo, muchas Salmonellas no produce actividad enzimática de ß-galactosidasa y se pueden diferenciar de los miembros de utilizan lactosa de la familia Enterobacteriaceae al usar un indicador de actividad enzimática de ß-galactosidasa, como se describe por A. Rambach ("New píate médium for facilitated differentiation of Salmonella spp . From Proteus spp . And other enteric bacteria", 1990, Appl . Environ. Microbiol . , volumen 56, páginas 301-303; que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad) .
Sin embargo, algunos informes indican que se ha encontrado que más de 90% de los microorganismos aislados de algunas especies (por ejemplo, S. bongori) y subespecies (por ejemplo, S. arizonae entérica y S. entérica diarizonae) de Salmonella producen actividad enzimática de ß-galactosidasa (por ejemplo, ver A.M. Littell, "Plating médium for differentiating Salmonella arizonae from other Salmonellae" , 1977, Appl. Environ. Microbiol., volumen 33, páginas 485-487; que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad) . De esta manera, un medio de cultivo y el correspondiente procedimiento diseñado para distinguir entre microorganismos de Salmonella y microorganismos no de Salmonella con base a la actividad enzimática de ß-galactosidasa pueden subestimar erróneamente el número de microorganismos de Salmonella en una muestra si en la muestran está presentes Salmonellas productoras de ß-galactosidasa . Los investigadores han descubierto un método que, de manera sorprendente, es capaz de distinguir algunos microorganismos de Salmonella productores de ß-galactosidasa aun cuando el medio de cultivo usado en el método dependa de un indicador de la actividad enzimática de ß-galactosidasa para distinguir entre los microorganismos de Salmonella y microorganismo no de Salmonella. Un ejemplo no limitante de un segundo compuesto indicador diferencial adecuado de acuerdo a la presente descripción es 5-bromo-4-cloro-3-indolil^-D-galactopiranósido, 5 -bromo-3 - indolil^-D-galactopiranósido, 5-bromo-6-cloro-3-indolil- -D-galacto-piranósido, 2 -nitrofenil^-D-galactopiranósido, 4-nitrofenil-ß-D-galactopiranósido . En algunas modalidades, el segundo sistema indicador diferencial comprende lactosa y un indicador de pH.
Los métodos de la presente descripción usan un primer agente selectivo para inhibir el crecimiento de microorganismos Grampositivos , reduciendo de este modo la competición de nutrientes y facilitando el crecimiento de microorganismos Gramnegativos tal como miembros del género Salmonella . Los ejemplos no limitantes de primeros agentes selectivos adecuados incluyen un agente selectivo seleccionado del grupo que consiste de un antibiótico, sales biliares, sales biliares No. 3, ácido cólico, ácido desoxicólico, violeta cristalina, novobiocina, o una combinación de cualquiera de dos o más de los agentes selectivos anteriores.
Los métodos de la presente descripción pueden usar opcionalmente al menos un segundo agente selectivo para inhibir el crecimiento de al menos un microorganismo entérico Gramnegativo que no es un miembro del género Salmonella . En algunas modalidades, el segundo agente selectivo también puede inhibir el crecimiento de al menos un microorganismo Grampositivo. De manera ventajosa, el segundo agente selectivo, en combinación con el primer agente selectivo, inhibe adicionalmente microorganismos (microorganismo Gramnegativo y/o Grampositivo) , reduciendo de este modo la competición de nutrientes y facilitando el crecimiento de un microorganismo de Salmonella . Además, el por lo menos un segundo agente selectivo también puede impedir de manera sustancial el crecimiento de un microorganismo Gramnegativo no de Salmonella que convertirá de otro modo el primer compuesto diferencial y/o el tercer compuesto diferencial a su respectivo producto detectable. De esta manera, el segundo agente selectivo puede reducir la probabilidad de que un microorganismo no de Salmonella se interprete como un posible microorganismo de Salmonella . Los ejemplos no limitantes de segundos agentes selectivos adecuados incluyen un agente selectivo seleccionado del grupo que consiste de un antibiótico de ß-lactama, un antibiótico de aminoglucósido, un antibiótico de quinolona, un antibiótico sulfa, un antibiótico de polimixina, y una combinación de cualquiera de dos o más de los antibióticos anteriores. En una modalidad, el por lo menos un segundo agente selectivo comprende una combinación de ácido nalidíxico, estreptomicina y polimixina B. De manera preferente, la concentración de cada uno del por lo menos un segundo agente selectivo en el medio nutriente se selecciona para permitir el crecimiento de una microorganismo de Salmonella . De manera más preferente, la concentración de cada uno del por lo menos un segundo agente selectivo en el medio nutriente se selecciona para permitir el crecimiento de todos los microorganismos de Salmonella .
Los métodos de la presente descripción comprenden poner en contacto, en el dispositivo de cultivo, el medio nutriente, el primer agente selectivo, el primer sistema indicador diferencial, y el segundo sistema indicador diferencial con una muestra para formar un medio de cultivo inoculado. La muestra se puede poner en contacto en el dispositivo de cultivo con el medio nutriente, el primer agente selectivo, el primer sistema indicador diferencial, y el segundo sistema indicador diferencial en cualquiera de una variedad de maneras. Por ejemplo, en una modalidad del método, el medio nutriente, el primer agente selectivo, el primer sistema indicador diferencial, y el segundo sistema indicador diferencial se pueden colocar en el dispositivo de cultivo como una mezcla en una forma hidratada (por ejemplo, en un medio de cultivo de agar hidratado a manera de ejemplo) . En esta modalidad, la muestra (por ejemplo, una muestra líquida, una muestra sólida, una muestra líquida y/o sólida capturado en un filtro, una muestra sólida suspendida en un medio líquido) se puede depositar y opcionalmente distribuir, en o sobre la mezcla por técnicas que se conocen, tal como, por ejemplo, con pipeta, técnicas de inoculación en placa extendida y técnicas de inoculación en placa rayada .
En una modalidad alternativa, la muestra (por ejemplo, que comprende un material líquido y/o sólido) se pone en contacto y se mezcla con una mezcla líquida (por ejemplo, una solución de agar líquida, templada, fundida) que comprende el medio nutriente, el primero agente selectivo, el primer sistema indicador diferencial, y el segundo sistema indicador diferencial y posteriormente, la mezcla se transfiere al dispositivo de cultivo.
En otra modalidad alternativa, se pueden colocar uno o más de los componentes (por ejemplo, el medio nutriente, el primer agente selectivo, el primer sistema indicador diferencial, y el segundo sistema indicador diferencial) en un dispositivo de cultivo, en una forma deshidratada tal como en un dispositivo de cultivo de película delgada similar a los dispositivos de cultivo descritos en las Patente de los Estados Unidos Nos. 4,565,783; 5,601,998; 5,681,712; 6,265,203; y 6,638,755. En esta modalidad, la muestra (por ejemplo, una muestra líquida acuosa o una muestra sólida suspendida en un medio de suspensión acuoso) se puede poner en contacto con los componentes deshidratados al tomar con pipeta la muestra en el dispositivo de cultivo, a manera de ejemplo. En esta modalidad, se pueden disolver o suspender uno o más de los componentes en la muestra antes o después de que la muestra se deposite en el dispositivo de cultivo.
En aun otra modalidad alternativa, se pueden colocar uno o más de los componentes (por ejemplo, el medio nutriente, el primer agente selectivo, el primer sistema indicador diferencial, y el segundo sistema indicador diferencial) en un dispositivo de cultivo en una forma deshidratada tal como en un dispositivo de cultivo de película delgada, como se describe en la presente. Un líquido acuoso adecuado (por ejemplo, agua estéril, un amortiguador estéril; que comprende opcionalmente uno o más de los componentes) se toma con pipeta en el dispositivo de cultivo y el agente formador de gel, si está presente, en el dispositivo de cultivo se deja rehidratar. Subsiguientemente, la muestra se puede depositar (por ejemplo, por pipeta, rayadura, colocación de un filtro de membrana que comprende la muestra) en el dispositivo de cultivo en contacto con los componentes.
Una persona que tiene habilidad ordinaria en la técnica reconocerá una variedad de otros procedimientos en los cuales se pueden poner en contacto los componentes (por ejemplo, el medio nutriente, el primer agente selectivo, el primer sistema indicador diferencial, y el segundo sistema indicador diferencial) con la muestra en un dispositivo de cultivo .
Los métodos de la presente descripción comprenden adicionalmente incubar el dispositivo de cultivo inoculado durante un primer período de tiempo. La incubación del dispositivo de cultivo inoculado puede comprender mantener el dispositivo a una temperatura elevada (por ejemplo, en una incubadora con temperatura controlada) . La incubación del dispositivo de cultivo inoculado a una temperatura elevada (por ejemplo, mayor de 25 centígrados) facilita el crecimiento de microorganismos entéricos tal como microorganismos del género Sal onella . La mayoría de las técnicas para cultivar microorganismos de Salmonella comprende colocar el dispositivo de cultivo en un ambiente de aproximadamente 37° centígrados (aproximadamente a la temperatura corporal de un humano) . Sin embargo, a esta temperatura, los miembros de la especie Salmonella bongori son capaces de producir actividad enzimática de P-D-galactosidasa que es detectable usando el segundo sistema indicador diferencial de la presente descripción. Sin embargo, mucho del Salmonella bongori es capaz de crecer, pero no de producir actividad enzimática de ß-D-galactosidasa que es detectable usando el segundo sistema indicador diferencial de la presente descripción, a temperaturas mayores de 40 centígrados. De esta manera, los métodos de la presente descripción comprenden incubar el dispositivo de cultivo inoculado a una temperatura mayor de 40 centígrados (por ejemplo, a temperaturas mayores de o iguales a 41 centígrados) durante un primer período de tiempo. En algunas modalidades, la incubación del dispositivo de cultivo inoculado comprende incubar el dispositivo de cultivo inoculado a una temperatura entre 41 centígrados y 44 centígrados, inclusive. En algunas modalidades, la incubación del dispositivo de cultivo inoculado comprende incubar el dispositivo de cultivo inoculado a una temperatura a 41 centígrados. En algunas modalidades, la incubación del dispositivo de cultivo inoculado comprende incubar el dispositivo de cultivo inoculado a una temperatura a 42 centígrados. En algunas modalidades, la incubación del dispositivo de cultivo inoculado comprende incubar el dispositivo de cultivo inoculado a una temperatura a 43 centígrados. En algunas modalidades, la incubación del dispositivo de cultivo inoculado comprende incubar el dispositivo de cultivo inoculado a una temperatura a 44 centígrados.
El dispositivo de cultivo se incuba durante un primer período de tiempo suficiente para permitir el crecimiento y multiplicación de microorganismos entéricos presentes en la muestra. Típicamente, el dispositivo de cultivo se incuba durante un primer período de aproximadamente 10 horas. En algunas modalidades, los dispositivos de cultivo se incuban durante un primer período de aproximadamente 14 a aproximadamente 48 horas. En algunas modalidades, los dispositivos de cultivo se incuban durante un primer período de aproximadamente 18 a aproximadamente 48 horas. En algunas modalidades, los dispositivos de cultivo se incuban durante un primer período de aproximadamente 24 a aproximadamente 36 horas. En una modalidad preferida, los dispositivos de cultivo se incuban durante un período de aproximadamente 24 + 2 horas.
Los métodos de la presente descripción incluyen observar el dispositivo de cultivo para detectar la presencia o ausencia del primer producto detectable. El primer producto detectable se produce por un miembro de un grupo de microorganismos de Salmonella que incluye un microorganismo de la especie Salmonella bongori. El miembro del grupo convierte el primer compuesto indicador diferencial (por ejemplo, mediante fermentación, mediante actividad metabólica, mediante una actividad enzimática) al primer producto detectable. Típicamente, se observa el medio nutriente después del primer período de incubación. En cualquier modalidad, la observación del medio nutriente para detectar la presencia del primer producto detectable puede comprender observar el dispositivo de cultivo para detectar un primer color detectable. En algunas modalidades, el primer color detectable se puede detectar por fluorescencia (por ejemplo, en una modalidad en donde el primer compuesto indicador diferencial comprende 4 -metilumbeliferil-oí-D-galactopiranósido) .
En una modalidad en donde el primer sistema indicador diferencial comprende un carbohidrato fermentable y un indicador de pH, el primer color detectable puede ser una zona coloreada asociada con el indicador de pH próximo (es decir, adyacente) a una colonia de microorganismos capaces de convertir el carbohidrato a uno o más productos ácidos. De esta manera, conforme los productos ácidos se acumulan en la colonia y/o el medio nutriente que circunda la colonia, se forma una zona coloreada, que resulta de la interacción de los productos ácidos con el indicador de pH, próxima a la colonia y, en algunos casos, también puede colorear la colonia. El tamaño de la zona ácida se puede controlar por el uso de un amortiguador en el medio nutriente, como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5601998.
En una modalidad en donde el primer compuesto indicador diferencial comprende un sustrato de enzima cromogénica, el primer color detectable puede ser una zona coloreada próxima a una colonia de microorganismos. Por ejemplo, la zona coloreada puede comprender un producto soluble en agua (por ejemplo, 4-nitrofenol) que resulta de una enzima microbiana que reacciona con el sustrato cromogénico (por ejemplo, 4-nitrofenil-a-D-galactopiranósido) . De manera alternativa, la zona coloreada puede comprender un producto insoluble en agua (por ejemplo, índigo) que resulta de una enzima microbiana que reacciona con el sustrato cromogénico (5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactopiranósido) .
Los métodos de la presente descripción incluyen observar el dispositivo de cultivo para detectar la presencia o ausencia de] segundo producto detectable. El segundo producto detectable se produce por un microorganismo que tiene actividad enzimática de ß-galactosidasa . El microorganismo que tiene actividad enzimática de ß-galactosidasa convierte el segundo compuesto indicador diferencial al segundo producto detectable. Típicamente, el medio nutriente se observa después del primer período de incubación. En cualquier modalidad, la observación del medio nutriente para detectar la presencia del segundo producto detectable puede comprender observar el dispositivo de cultivo para detectar un segundo color detectable. En algunas modalidades, el segundo color detectable se puede detectar al observar la absorbancia o reflectancia de la luz. En algunas modalidades, el segundo color detectable se puede detectar por fluorescencia (por ejemplo, en una modalidad en donde el primer compuesto indicador diferencial comprende 4-metilumbeliferil--D-galactopiranósido) .
Una persona experta en la técnica reconocerá que, en cualquier modalidad, el primer producto detectable no debe interferir sustancialmente con la detección (por ejemplo, por enmascaramiento del color o extinción fluorescente) del segundo producto detectable y el segundo producto detectable no debe interferir de manera sustancial con la detección (por ejemplo, por enmascaramiento de color o extinción fluorescente) del primer producto detectable. Una persona experta en la técnica reconocerá que, en una modalidad en donde el primero de color detectable y el segundo color detectable se detectan por fluorescencia, el primer producto detectable debe comprender un fluoróforo diferente que el segundo producto detectable .
Los métodos de la presente descripción incluyen observar el dispositivo de cultivo para detectar un primer producto detectable y/o un segundo producto detectable. En una modalidad del método, la observación del dispositivo de cultivo puede comprender observar la mezcla que comprende el medio nutriente; el primer agente selectivo; el primer sistema indicador diferencial; el segundo ingrediente selectivo; el segundo agente selectivo, si está presente; y el tercer sistema indicador diferencial, si está presente. En cualquier modalidad del método, la observación del dispositivo de cultivo puede comprender observar visualmente el dispositivo de cultivo (por ejemplo, usando uno o más ojos humanos) .
De manera adicional o alternativamente, en cualquier modalidad del método, la observación del dispositivo de cultivo puede comprender observar mecánicamente el dispositivo de cultivo (por ejemplo, usando un sistema formador de imágenes tal como, por ejemplo, el sistema formador de imágenes descrito en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,243,486; 7,496,225, y 7,351,574, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. En esta modalidad, la observación del dispositivo de cultivo puede comprender crear una imagen del dispositivo de cultivo usando un dispositivo formador de imágenes. Además de crear una imagen del dispositivo de cultivo, el método puede comprender de manera opcional analizar la imagen usando un procesador.
Los métodos de la presente descripción se pueden usar para detectar y opcionalmente, enumerar en una muestra los microorganismos de Salmonella. Por ejemplo, la observación de la presencia del primer producto detectable en el dispositivo de cultivo puede indicar una posible presencia, en la muestra, de un microorganismo de Salmonella (por ejemplo, un miembro de la especie Salmonella bongori y/o un miembro de la especie Salmonella entérica) . Sin embargo, en los métodos de acuerdo a la presente descripción, la observación de la presencia del primer producto detectable yuxtapuesto con el segundo producto detectable indica la presencia, en una muestra, de un microorganismo diferente de un miembro productor de ß-galactosidasa de la especie Salmonella bongori.
El tercer compuesto indicador diferencial puede ser cualquier compuesto indicador adecuado para detectar un microorganismo de Salmonella, con la condición que el tercer producto detectable derivado del mismo sea distinguible; de manera preferente, ópticamente distinguible, de manera más preferente, visualmente distinguible; del primer producto detectable del primer sistema indicador diferencial y el segundo producto detectable del segundo sistema indicador diferencial. De esta manera, en una modalidad, el tercer sistema indicador diferencial puede comprender un indicador de pH en unión con un nutriente (por ejemplo, un carbohidrato) que se puede convertir (por ejemplo, mediante fermentación) a un primer producto detectable (por ejemplo, un compuesto ácido, tal como ácido láctico, a manera de ejemplo, y/o un gas tal como dióxido de carbono, a manera de ejemplo), como se describe en la presente. En otra modalidad, el tercer sistema indicador diferencial puede comprender un sustrato de enzima cromogénica, como se describe en la presente. En aun otra modalidad, el tercer sistema indicador diferencial puede ser un sustrato de enzima cromogénica, como se describe en la presente. Cualquier primer sistema indicador diferencial descrito en la presente puede ser adecuado para el uso como un tercer sistema indicador diferencial, con la condición que no interfiera sustancialmente con, y sea distinguible de, el primero y segundo sistemas indicadores diferenciales y/o el cuarto sistema indicador, si está presente.
De manera ventajosa, el tercer sistema indicador diferencial se puede usar como un medio para "confirmar" la presencia de un microorganismo de Salmonella en la muestra. Es decir, cuando se observa la presencia de un primer producto detectable en el dispositivo de cultivo, esa presencia se puede inferir como una indicación de la posible presencia de un microorganismo de Salmonella en la muestra. Sin embargo, cuando se observa la presencia de un tercer producto detectable en yuxtaposición con la presencia del primer producto detectable (es decir, el primer y tercer productos detectables se asocian con la misma colonia bacteriana) ; la observación puede indicar una mayor probabilidad (por ejemplo, una probabilidad significativamente mayor) de la presencia en la muestra de un microorganismo de Salmonella .
La incubación del dispositivo de cultivo inoculado durante un segundo período de tiempo puede comprender mantener el dispositivo a una temperatura elevada (por ejemplo, en una incubadora de temperatura controlada) . La incubación del dispositivo de cultivo inoculado a una temperatura elevada (por ejemplo, mayor de 25 centígrados, pero menor de o igual a aproximadamente 44 centígrados) puede facilitar la conversión por microorganismos entéricos (por ejemplo, miembros del género Salmonella) del tercer compuesto indicador diferencial al tercer producto detectable. En una modalidad preferida, el dispositivo de cultivo se incubará durante un segundo período de tiempo a una temperatura entre 35 a 42 centígrados, inclusive. En una modalidad más preferida, el dispositivo de cultivo se incubará durante un segundo período de tiempo a una temperatura entre 42 °C ± 1 grado C .
En algunas modalidades, el tercer sistema indicador diferencial se pone en contacto con el medio nutriente inoculado después del primer período de incubación. De manera ventajosa, esto puede reducir la duración del segundo período de incubación necesario para detectar el tercer producto detectable. De esta manera, en algunas modalidades, el segundo período de incubación puede ser de 1 hora a aproximadamente 6 horas. En algunas modalidades, el segundo período de incubación puede ser de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 4 horas. En una modalidad preferida, el segundo período de incubación es de 4 horas ± 1 hora.
Cuando se usa de acuerdo a la presente descripción, el método puede detectar la presencia o ausencia de una muestra de un microorganismo de Salmonella . La Figura 2 muestra una modalidad de varios pasos analíticos y pasos opcionales de proceso asociados con el método mostrado en la Figura 1. Después de que el dispositivo de cultivo se incuba durante un primer período de tiempo, como se muestra en la Figura 1, se observa el dispositivo de cultivo (paso 60) para detectar (paso 100) la presencia o una ausencia de un primer producto detectable y para detectar (paso 110) la presencia o una ausencia de un segundo producto detectable. El primero y/o segundo productos detectables se pueden detectar como se describe en la presente .
Si no se detecta el primer producto detectable después de un período suficiente de incubación, se presume que la muestra de prueba no contiene un microorganismo de Salmonella, como se muestra en el paso 105. Si se observa el primer producto detectable, el dispositivo de cultivo se observa adicionalmente (paso 110) para la presencia del segundo producto detectable yuxtapuesto con el primer producto detectable. Si se observa el primer producto detectable yuxtapuesto con el segundo producto detectable, se presume la muestra no contiene un microorganismo de Salmonella, como se muestra en el paso 115.
Si el primer producto detectable se observa que está asociado con una colonia microbiana y el segundo producto detectable no se observa, o si el segundo producto detectable no está yuxtapuesto con el primer producto detectable próximo a la colonia microbiana, se presume que la muestra de prueba contiene al menos un microorganismo de Salmonella, como se muestra en el paso 118. El microorganismo de Salmonella puede ser un miembro de la especie S. bongori o puede ser un miembro productor de ß-galactosidasa de la especie S. entérica . Opcionalmente , el operador puede desear confirmar si un microorganismo que produce el primer producto detectable es un miembro del género Salmonella . Esto se puede lograr, por ejemplo, al realizar el paso opcional 65 de poner en contacto el medio nutriente inoculado con el tercer sistema indicador (por ejemplo, al proporcionar un artículo que comprende el tercer sistema indicador y poner en contacto con el medio nutriente inoculado con el artículo) , como se describe en la presente. El paso opcional de puesta en contacto 65 se sigue por el paso opcional 70 de incubar el dispositivo de cultivo inoculado durante un segundo período de tiempo, como se describe en la presente. Después del segundo período de incubación, el dispositivo de cultivo se observa (paso 75) para detectar (paso 120) la presencia o ausencia de un tercer producto detectable, como se describe en la presente. Si se observa el tercer producto detectable, se puede concluir que la colonia microbiana que tiene el primero y tercero productos detectables asociados con éste es probablemente un miembro (por ejemplo, un miembro productor de a-galactosidasa) del género Salmonella, como se muestra en el paso 125. Si la colonia de -microorganismos no produce el tercer producto detectable, se presume que la colonia no es un miembro del género Salmonella (por ejemplo, puede ser un microorganismo entérico no productor de ß-galactosidasa) , como se muestra en el paso 135.
En cualquier modalidad, el método puede comprender adicionalmente enumerar varias colonias formadas por microorganismos que corresponden a un grupo (por ejemplo, un grupo que consiste de microorganismos Salmonella, un grupo que consiste de microorganismos productores de ß-galactosidasa, un grupo que consiste de Salmonellas productoras de ß-galactosidasa, un grupo de Salmonella no productoras de ß-galactosidasa) . La enumeración se puede hacer simplemente al contar el número de colonias microbianas separadas en el dispositivo de cultivo de acuerdo al sistema indicador o sistemas indicadores con los cuales reacciona cada colonia.
Modalidades La modalidad 1 es un método para detectar microorganismos de Salmonella, el método que comprende: proporcionar; una muestra que se va a probar; un dispositivo de cultivo; un medio nutriente que facilita el crecimiento de un microorganismo entérico Gramnegativo; un primer agente selectivo que inhibe el crecimiento de microorganismos Grampositivos ; un primer sistema indicador diferencial que comprende un primer compuesto indicador diferencial que se puede convertir a un primer producto detectable por un miembro de un grupo de microorganismos de Salmonella que incluye un microorganismo de la especie Salmonella bongori; y un segundo sistema indicador diferencial que comprende un segundo compuesto indicador diferencial que se puede convertir a un segundo producto detectable por una actividad enzimática de ß-galactosidasa; poner en contacto en el dispositivo de cultivo el medio nutriente, el primer agente selectivo, el primer sistema indicador diferencial, y el segundo sistema indicador diferencial con una muestra para formar un dispositivo de cultivo inoculado; incubar el dispositivo de cultivo inoculado durante un primer período de tiempo a una temperatura mayor de 40 centígrados; observar el dispositivo de cultivo para detectar la presencia o ausencia del primer producto detectable; y observar el dispositivo de cultivo para detectar la presencia o ausencia del segundo producto detectable; en donde la observación de la presencia del primer producto detectable indica una posible presencia en la muestra de un microorganismo de Salmonella; en donde la observación de la presencia del primer producto detectable yuxtapuesto con el segundo producto detectable indica la presencia en la muestra de un microorganismo diferente de un miembro productor de ß-galactosidasa de la especie Salmonella bongori .
La modalidad 2 es el método de la modalidad 1, en donde el dispositivo de cultivo se proporciona como un dispositivo de cultivo de película delgada con el medio nutriente, el primer agente selectivo, el primer sistema indicador diferencial, y el segundo sistema indicador diferencial colocado en el mismo en una forma sustancialmente deshidratada .
La modalidad 3 es el método de la modalidad 1 o de la modalidad 2, en donde la observación de la ausencia del primer producto detectable indica la ausencia de un microorganismo de Salmonella en la muestra.
La modalidad 4 es un método de cualquiera de las modalidades precedentes, en donde la observación del medio nutriente para detectar la presencia del primer producto detectable comprende observar el dispositivo de cultivo para detectar un primer color detectable.
La modalidad 5 es el método de cualquiera de las modalidades precedentes, en donde el primer compuesto indicador diferencial comprende un sustrato enzimático.
La modalidad 6 es el método de la modalidad 5, en donde el sustrato enzimático comprende un sustrato enzimático para detectar la actividad enzimática de caprilato-esterasa o para detectar la actividad enzimática de a-galactosidasa .
La modalidad 7 es el método de la modalidad 6, en donde el sustrato enzimático se selecciona del grupo que consiste de caprilato de 5-bromo-6-cloro-3-indolilo, caprilato de 4-nitrofenilo, caprilato de 2-naftilo, 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-o¡-D-galactopiranósido, resorufinil-a-D-galactopiranósido, y 4 -nitrofenil -a-D-galactopiranósido .
La modalidad 8 es el método de cualquiera de las modalidades 5 hasta 7, en donde el primer producto detectable es sustancialmente insoluble en agua.
La modalidad 9 es el método de cualquiera de las modalidades 1 hasta 6, en donde el primer sistema indicador diferencial comprende un indicador de pH y al menos un carbohidrato seleccionado del grupo que consiste de melibiosa, 2-desoxi-D-ribosa, manitol, L-arabinosa, dulcitol, maltosa, L-ramnosa, trehalosa, D-xilosa, y sorbitol .
La modalidad 10 es el método de cualquiera de las modalidades precedentes, en donde el primer producto detectable es sustancialmente soluble en agua, en donde la observación del primer producto detectable comprende observar una zona coloreada adyacente a una colonia microbiana .
La modalidad 11 es el método de cualquiera de las modalidades precedentes, en donde la observación del segunda producto detectable comprende observar el dispositivo de cultivo para detectar un segundo color detectable.
La modalidad 12 es el método de cualquiera de las modalidades precedentes, en donde el segundo compuesto indicador diferencial se selecciona del grupo que consiste de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-P-D-galactopiranósido, 5-bromo-3-indolil-p-D-galactopiranósido, 5-bromo-6-cloro-3-indolil-P -D-galactopiranósido, 2-nitrofenil-p-D-galactopiranósido, y 4 -nitrofenil -ß-D-galactopiranósido .
La modalidad 13 es el método de cualquiera de las modalidades precedentes, en donde el primer producto detectable es sustancialmente soluble en agua y el segundo producto detectable es sustancialmente insoluble en agua o de manera alternativa, en donde el primer producto detectable es sustancialmente insoluble en agua y el segundo producto detectable es sustancialmente soluble en agua.
La modalidad 14 es el método de cualquiera de las modalidades 1 hasta 13, en donde el primer agente selectivo se selecciona del grupo que consiste de un antibiótico, sales biliares, sales biliares No. 3, ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido desoxicólico, violeta cristalina, novobiocina, ácido nalidíxico, polimixina B, estreptomicina, meticilina, cefsoludina, o una combinación de cualquiera dos o más de los agentes selectivos anteriores.
La modalidad 15 es el método de cualquiera de las modalidades precedentes, en donde el dispositivo de cultivo comprende además al menos un segundo agente selectivo, en donde el por lo menos un segundo agente selectivo inhibe el crecimiento de al menos un microorganismo entérico Gramnegativo que no es un miembro del género Salmonella .
La modalidad 16 es el método de la modalidad 15, en donde el segundo agente selectivo se selecciona del grupo que consiste de un antibiótico de ß-lactama, un antibiótico aminoglucósido, un antibiótico de quinolona, un antibiótico sulfa, un antibiótico de polimixina, y una combinación de cualquiera de dos o más de los antibióticos anteriores.
La modalidad 17 es el método de la modalidad 16, en donde el por lo menos un segundo agente selectivo comprende una combinación de ácido nalidíxico, estreptomicina y polimixina B.
La modalidad 18 es el método de cualquiera de las modalidades precedentes, en donde la incubación del dispositivo de cultivo comprende incubar el dispositivo de cultivo a una temperatura entre 41-44 centígrados, inclusive.
La modalidad 19 es el método de na cualquiera de las modalidades precedentes, que comprende además: proporcionar un artículo con un tercer sistema indicador diferencial que comprende un tercer compuesto indicador diferencial que se puede convertir por un microorganismo de Salmonella a un tercer producto detectable ; poner en contacto el artículo con el dispositivo de cultivo inoculado; incubar el dispositivo de cultivo inoculado durante un segundo período de tiempo; y observar el dispositivo de cultivo para detectar el tercer producto detectable; en donde la observación del tercer producto detectable yuxtapuesto con el primer producto detectable indica la presencia en la muestra de un microorganismo de Salmonella .
La modalidad 20 es el método de cualquiera de las modalidades precedentes, que comprende además: proporcionar un compuesto indicador no diferencial que se puede convertir por un microorganismo entérico a un cuarto producto detectable; y observar el dispositivo de cultivo para detectar la presencia o ausencia del cuarto producto detectable; en donde la puesta en contacto en el dispositivo de cultivo del medio nutriente, el primer agente selectivo, el primer sistema indicador diferencial, y el segundo sistema indicador diferencial con una muestra para formar un dispositivo de cultivo inoculado comprende además poner en contacto en el dispositivo de cultivo el medio nutriente, el primer agente selectivo, el primer sistema indicador diferencial, el segundo sistema indicador diferencial, y el compuesto indicador no diferencial con la muestra para formar el dispositivo de cultivo inoculado.
La modalidad 21 es el método de cualquiera de las modalidades previas, en donde la observación del dispositivo de cultivo comprende observar visualmente el dispositivo de cultivo.
La modalidad 22 es el método de cualquiera de las modalidades precedentes, en donde la observación del dispositivo de cultivo comprende crear una imagen del dispositivo de cultivo usando un dispositivo formador de imágenes .
La modalidad 23 es el método de la modalidad 22, que comprende además analizar la imagen usando un procesador .
La modalidad 24 es el método de cualquiera de las modalidades precedentes, que comprende además enumerar varias colonias formadas por microorganismos que corresponden al grupo.
Ej emplos Los objetos y ventajas de esta invención se ilustran adicionalmente por los siguientes ejemplos, pero los materiales particulares y las cantidades de los mismos, citadas en estos ejemplos, así como otras condiciones y detalles, no se deben considerar como que limitan indebidamente esta invención. A menos que se indique de otro modo, todas las partes y porcentajes son a base del peso, toda el agua es agua destilada, y todos los pesos moleculares son peso molecular promedio en peso .
Materiales . En la tabla 1 se muestran los materiales utilizados en la preparación de los ejemplos.
Tabla 1. Materiales Las cepas bacterianas usadas en los ejemplos se listan en la tabla 2. Las cepas bacterianas con una designación de "FSD" seguido por un número se aislaron de una muestra alimenticia o de un ambiente de procesamiento de alimentos. La identidad de S. agona FSD 122 se confirmó por análisis de secuencia de ADN. Las cepas bacterianas con una designación de "ATCC" seguido por un número se obtuvieron de la American Type Culture Collection, Manassas, VA.
Tabla 2. Lista de cepas bacterianas Ejemplo 1. Preparación de un dispositivo de cultivo de película delgada de Salmonella Se preparó un dispositivo de cultivo de película delgada de acuerdo al procedimiento descrito en la solicitud de Patente U.S. No. de Serie 61/488,492 (Documento de abogado No. 67673US002) presentada el 20 de Mayo del 2011; que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. La composición en polvo usada para preparar el sustrato de papel revestido con polvo se hizo al mezclar 2 partes en peso de 2-desoxi-D-ribosa (2DDR; Research Products International Corp.;. Mt . Prospect, IL) y 98 partes de goma de guar (goma de guar M150 MEYPROGATR, Meyhall Chemical AG) . Antes del revestimiento con polvo, el papel se revistió con el adhesivo que contiene TTC.
La mezcla de revestimiento en caldo se preparó al adicionar los materiales listados en la tabla 3 a 1 litro de agua desionizada en un recipiente, y se mezcló de acuerdo al método descrito en el ejemplo 1 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,022,682.
Tabla 3. Ingredientes para mezcla de revestimiento en caldo Se preparó una mezcla de agente selectivo al adicionar 0.1 g de IPTG, 2.0 g de urea, 5.0 g de Melibiosa (Sigma) , 0.005 g de sal sódica de ácido nalidíxico, 0.005 g de sal de sulfato de estreptomicina y 0.00075 g de sal de sulfato de polimixina B a 30 mi de agua desionizada estéril en un tubo centrífuga estéril 50 mL y se sometió a vórtice para mezclar. La mezcla en caldo se enfrió a aproximadamente 40°C y la mezcla de agente selectivo se adicionó con mezclado vigoroso. Se preparó una película de cubierta al revestir el caldo sobre el lado tratado con efecto corona de una película de poliéster de 2.9 milésimas de pulgada (0.07366 mm) .
El dispositivo de cultivo se montó de acuerdo a la Patente de los Estados Unidos No. 6,022,682; con el miembro base, un separador de espuma que tiene un círculo con diámetro de 7.3 cm cortado desde el centro para proporcionar una concavidad, y la placa de cubierta adherida conjuntamente usando una cinta adhesiva de transferencia. Las placas midieron aproximadamente 10.3 cm por 10.2 cm con una concavidad circular que expone la mezcla seca revestida en caldo alrededor del centro de la placa.
Ejemplo 2. Efecto de la temperatura de incubación en la actividad de ß-galactosidasa producida por varias cepas de Enterobacteriaceae Se produjeron dispositivos de cultivo de acuerdo al ejemplo 1. El medio de crecimiento en cada dispositivo de cultivo se hidrató con 1 mililitro de amortiguador estéril de Butterfield antes del uso. Los dispositivos se mantuvieron a temperatura ambiente durante al menos una hora antes de inocularlos a fin de permitir que se hinchara el hidrogel .
Una colonia de cultivos puros individuales (en TSA inclinados) de cada una de las cepas listadas en la tabla 2 se transfirió a frascos estériles individuales que contienen 1.0 mi de agua con peptona amortiguada y se incubó a 37°C durante 24 ± 2 horas para producir una suspensión bacteriana puro de cada cepa. Las suspensiones de Salmonella se diluyeron cada una 1:100 en amortiguador de Butterfield. No se diluyó la suspensión de E. coli. Cada suspensión diluida y no diluido entonces se inoculó al rayar con una aza de plástico estéril de 10 microlitros. Se preparó de esta manera un conjunto de dispositivos de cultivo inoculado, cada uno rayado con una diferente bacteria. El conjunto de dispositivos de cultivo entonces se selló en una bolsa de plástico y se incubó al sumergir en un baño de agua. Las bolsas se incubaron con este método a las siguientes temperaturas: 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C y 45°C. Las temperaturas del baño de agua se controlaron a ± 0.1°C y se sumergieron las bolsas durante 24 + 2 horas. Se probaron dos réplicas de cada bacteria. Los dispositivos de cultivo incubados se removieron de las bolsas y en la tabla 4 se muestran las observaciones.
Tabla 4. Resultados observados Los resultados indican que la cepa de prueba de Salmonella entérica serovar agona no produce actividad de ß-galactosidasa a ninguna temperatura desde 39 °C a 45 °C. Los resultados indican más bien que las cepas de prueba de E. coli, Citrobacter freundii , Salmonella entérica subsp. arizonae y Salmonella entérica subsp. diarizonae produjeron todas actividad de ß-galactosidasa a cada temperatura entre 39°C y 45 °C. Los resultados indican adicionalmente que las cepas de prueba de Salmonella bongori produjeron actividad de ß-galactosidasa a una temperatura menor de igual a 40 °C, pero no producen actividad de ß-galactosidasa a temperaturas por arriba de 40 °C.
Ejemplo 3. El uso de un artículo de detección con un indicador diferencial para confirmar la presencia de un microorganismo de Salmonella Se preparó un artículo de detección (disco) como se describe en el ejemplo 1 de la Publicación Internacional PCT No. WO2012/092181 ; que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.
Los dispositivos de cultivo de película delgada (hechos como se describe en el ejemplo 1) que contuvieron un presunto resultado positivo {Salmonella typhi urium ATCC 14028 y Salmonella bongori FSD 122 inoculados en dispositivos de cultivo e incubados como se describe en el ejemplo 2) se abrieron y se laminó un disco (para reducir al mínimo las burbujas de aire) sobre la superficie de gel . Las placas se cerraron y se incubaron a 42 °C durante 4 horas. El disco se analizó para un cambio de color adyacente a las colonias para confirmar si las colonias reaccionaron con el indicador (5-bromo-4 -cloro-3-indolil-a-D-galactopiranósido) presente en el artículo de detección. Un cambio en el color de la colonia de rojo o café a azul o azul oscuro indicó la presencia de un microorganismo de Salmonella en las colonias. En la tabla 5 se muestran los resultados de la prueba.
Tabla 5. Interpretación de resultados observados en dispositivos de cultivo La descripción completa de todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones, y material electrónicamente disponible citado en la presente se incorpora como referencia. En el caso que exista cualquier inconsistencia entre la descripción de la presente solicitud y las descripciones de los documentos incorporados como referencia, debe regir la descripción de la presente solicitud. La descripción detallada y los ejemplos anteriores se han dado para claridad de entendimiento únicamente. No se van a entender de la misma limitaciones innecesarias. La invención no se limita a los detalles exactos mostrados y descritos, se incluirán variaciones obvias para un experto en la técnica dentro de la invención definida por las reivindicaciones .
Todos los encabezados son para la conveniencia del lector y no se deben usar para limitar el significado del texto que sigue al encabezado, a menos que se especifique de otro modo .
Se pueden hacer varias modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Estas y otras modalidades están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones .
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (10)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un método para detectar microorganismos de Salmonella, caracterizado porque comprende proporcionar: una muestra que se va probar; un dispositivo de cultivo; un medio nutriente que facilita el crecimiento de un microorganismo entérico Gramnegativo ; un primer agente selectivo que inhibe el crecimiento de microorganismos Grampositivos ; un primer sistema indicador diferencial que comprende un primer compuesto indicador diferencial que se puede convertir a un primer producto detectable por un miembro de un grupo de microorganismos de Salmonella que incluye un microorganismo de la especie Salmonella bongori ; y un segundo sistema indicador diferencial que comprende un segundo compuesto indicador diferencial que se puede convertir a un segundo producto detectable por una actividad enzimática de ß-galactosidasa ; poner en contacto en el dispositivo de cultivo el medio nutriente, el primer agente selectivo, el primer sistema indicador diferencial, y el segundo sistema indicador diferencial con una muestra para formar un dispositivo de cultivo inoculado; incubar el dispositivo de cultivo inoculado durante un primer período de tiempo a una temperatura mayor de 40 grados C; observar el dispositivo de cultivo para detectar la presencia o ausencia del primer producto detectable; y observar el dispositivo de cultivo para detectar la presencia o ausencia del segundo producto detectable; en donde la observación de la presencia del primer producto detectable indica la posible presencia en la muestra de un microorganismo de Salmonella; en donde la observación de la presencia del primer producto detectable yuxtapuesto con el segundo producto detectable indica la presencia en la muestra de un microorganismo diferente de un miembro productor de ß-galactosidasa de la especie Salmonella bongori .
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dispositivo de cultivo se proporciona como un dispositivo de cultivo de película delgada con el medio nutriente, el primer agente selectivo, el primer sistema indicador diferencial, y el segundo sistema indicador diferencial colocados en el mismo en una forma sustancialmente deshidratada.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la observación de la ausencia del primer producto detectable indica la ausencia en la muestra de un microorganismo de Salmonella .
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer compuesto indicador diferencial comprende un substrato enzimático, en donde el substrato enzimático comprende un substrato enzimático para detectar actividad enzimática de caprilato-esterasa o para detectar actividad enzimática de cc-galactosidas .
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer sistema indicador diferencial comprende un indicador de pH y al menos un carbohidrato seleccionado del grupo que consiste de melibiosa, 2-desoxi-D-ribosa, manitol, L-arabinosa, dulcitol, maltosa, L-ramnosa, trehalosa, D-xilosa, y sorbitol .
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer producto detectable es sustancialmente soluble en agua y el segundo producto detectable es sustancialmente insoluble en agua o de manera alternativa, en donde el primer producto detectable es sustancialmente insoluble en agua y el segundo producto detectable es sustancialmente soluble en agua.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dispositivo de cultivo comprende además al menos un segundo agente selectivo, en donde el por lo menos un segundo agente selectivo inhibe el crecimiento de al menos un microorganismo entérico Gramnegativo que no es un miembro del género Salmonella .
8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la incubación del dispositivo de cultivo comprende incubar el dispositivo de cultivo a una temperatura entre 41-44 grados C, inclusive.
9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende: proporcionar un artículo con un tercer sistema indicador diferencial que comprende un tercer compuesto indicador diferencial que se puede convertir por un microorganismo de Salmonella a un tercer producto detectable; poner en contacto el artículo con el dispositivo de cultivo inoculado; incubar el dispositivo de cultivo inoculado durante un segundo período de tiempo; y observar el dispositivo de cultivo para detectar el tercer producto detectable; en donde la observación del tercer producto detectable yuxtapuesto con el primer producto detectable indica la presencia en la muestra de un microorganismo de Salmonella .
10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque además comprende: proporcionar un compuesto indicador no diferencial que se puede convertir por un microorganismo entérico a un cuarto producto detectable; y observar el dispositivo de cultivo para detectar la presencia o ausencia del cuarto producto detectable; en donde la puesta en contacto en el dispositivo de cultivo del medio nutriente, el primer agente selectivo, el primer sistema indicador diferencial, y el segundo sistema indicador diferencial con una muestra para formar un dispositivo de cultivo inoculado comprende además poner en contacto en el dispositivo de cultivo el medio nutriente, el primer agente selectivo, el primer sistema indicador diferencial, el segundo sistema indicador diferencial, y el compuesto indicador no diferencial con la muestra para formar el dispositivo de cultivo inoculado.
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