BR112014016066B1

BR112014016066B1 - Método para detectar micro-organismos salmonella

Info

Publication number: BR112014016066B1
Application number: BR112014016066-0A
Authority: BR
Inventors: Christine A Binsfeld; Adam J. Stanenas; Mara S. Celt; Patrick A. Mach
Original assignee: 3M Innovative Properties Company
Priority date: 2011-12-28
Filing date: 2012-12-18
Publication date: 2021-04-27
Also published as: US20170247738A1; JP6192658B2; BR112014016066A2; US10519481B2; CN104105795B; AU2012362796A1; CN104105795A; BR112014016066A8; EP2798075A1; US9677111B2; WO2013101530A1; EP2798075B1; JP2015503345A; MX2014007889A; US20140356888A1

Abstract

método para detectar micro-organismos salmonella . [001] a presente invenção refere-se a um método de detectar um micro-organismo salmonella. o método inclui o uso de um meio de cultura seletivo, um primeiro sistema indicador que é convertido em um primeiro produto detectável por um micro-organismo salmonella, e um segundo sistema indicador que é convertido em um segundo produto detectável pela atividade enzimática da beta-galactosidase. o método compreende adicionalmente inocular o meio de cultura e incubar o meio de cultura inoculado a uma temperatura acima de 40°c.

Description

REMISSIVA A PEDIDOS DE DEPÓSITO CORRELATOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente provisório U.S. n° 61/580.860, depositado em 28 de dezembro de 2011, que é aqui incorporado, por referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES

[002] A família Enterobacteriaceae inclui um grande número de bactérias metabolicamente diversas, anaeróbicas facultativas que são capazes de fermentar açúcares em ácido láctico e outros produtos finais. A família inclui vários patógenos humanos bem conhecidos, como Escherichia coli, várias subespécies de Salmonella, Yersinia pestis, várias espécies de Klebsiella e várias espécies de Shigella.

[003] O gênero Salmonella inclui duas espécies, S. enterica e S. bongori, que incluem subespécies capazes de causar doenças em seres humanos. Algumas das salmonelas patogênicas podem ser transmitidas aos seres humanos através da ingestão de alimentos ou bebidas contaminadas. A detecção de micro-organismos Salmonella presentes em amostras de alimentos pode ser difícil devido à presença de números relativamente baixos de microorganismos Salmonella na amostra, presença de números relativamente baixos de micro-organismos entéricos intimamente relacionados que não são Salmonella na amostra e/ou presença de materiais que não são micro-organismos (por exemplo, partículas de alimento ou substâncias químicas solúveis) na amostra que podem interferir com o crescimento ou a detecção de micro-organismos Salmonella.

[004] Uma variedade de meios de cultura microbiológicos seletivos e/ou diferenciais foram desenvolvidos para detectar micro-organismos Salmonella em uma amostra e para distingui-los de um ou mais microorganismos não salmonela. Tipicamente, esses meios de cultura incluem um agente seletivo que inibe o crescimento de micro-organismos não-entéricos. Além disso, muitos desses meios de cultura utilizam um ou mais sistemas indicadores diferenciais para distinguir micro-organismos Salmonella de não Salmonella.

[005] Apesar da variedade dos meios de cultura microbiológicos para detectar micro-organismos Salmonella em uma amostra, existe uma necessidade de métodos aprimorados para detectar um micro-organismo Salmonella em uma amostra.

SUMÁRIO

[006] Em geral, a presente descrição está relacionada a um método de detectar um micro-organismo Salmonella. Em particular, o método inclui o uso de um meio de cultura seletivo que inclui um sistema indicador diferencial positivo (isto é, um sistema indicador que inclui um composto indicador que é convertido em um produto detectável por um micro-organismo Salmonella) e um sistema indicador diferencial negativo (isto é, um sistema indicador que inclui um composto indicador que pode ser convertido em um produto detectável pela atividade enzimática da β-galactosidase e, dessa forma, não é convertido em um produto detectável por um micro-organismo Salmonella). Surpreendentemente, os membros da espécie S. bongori não reagem com o segundo sistema indicador em temperaturas de incubação acima de 40°C.

[007] Em um aspecto, a presente descrição apresenta um método para detectar um micro-organismo Salmonella. O método pode compreender fornecer uma amostra a ser testada, um dispositivo de cultura, um meio nutritivo que facilita o crescimento de um micro-organismo entérico Gram-negativo, um primeiro agente seletivo que inibe o crescimento de microorganismos Gram-positivos, um primeiro sistema indicador diferencial que compreende um primeiro composto indicador diferencial que pode ser convertido em um primeiro produto detectável por um membro de um grupo de micro-organismos Salmonella, que inclui um micro-organismo da espécie Salmonella bongori, e um segundo sistema indicador diferencial que compreende um segundo composto indicador diferencial que pode ser convertido em um segundo produto detectável pela atividade enzimática da β- galactosidase. O método pode compreender adicionalmente colocar, no dispositivo de cultura, o meio nutritivo, o primeiro agente seletivo, o primeiro sistema indicador diferencial e o segundo sistema indicador diferencial em contato com uma amostra para formar um dispositivo de cultura inoculado, incubar o dispositivo de cultura inoculado durante um primeiro período de tempo a uma temperatura maior que 40°C, observar o dispositivo de cultura para detectar uma presença ou uma ausência do primeiro produto detectável e observar o dispositivo de cultura para detectar uma presença ou uma ausência do segundo produto detectável; sendo que observar a presença do primeiro produto detectável indica uma possível presença na amostra de um micro-organismo Salmonella; sendo que observar a presença do primeiro produto detectável justaposto ao segundo produto detectável indica uma presença na amostra de um micro-organismo diferente de um membro produtor de β- galactosidase da espécie Salmonella bongori.

[008] . Em qualquer modalidade, o dispositivo de cultura podeser fornecido como um dispositivo de cultura de filme fino com o meio nutritivo, o primeiro agente seletivo, o primeiro sistema indicador diferencial e o segundo sistema indicador diferencial dispostos ali em uma forma substancialmente desidratada. Em qualquer das modalidades acima, observar a ausência do primeiro produto detectável pode indicar uma ausência de um micro-organismo Salmonella na amostra. Em qualquer das modalidades acima, observar o meio nutritivo para detectar a presença do primeiro produto detectável pode compreender observar o dispositivo de cultura para detectar uma primeira cor detectável. Em qualquer das modalidades acima, o primeiro composto indicador diferencial pode compreender um substrato enzimático. Em algumas modalidades, o substrato enzimático pode compreender um substrato enzimático para detectar a atividade enzimática da caprilato esterase ou para detectar a atividade enzimática da α-galactosidase. Em algumas modalidades, o substrato enzimático pode ser selecionado do grupo que consiste em 5-bromo-6-cloro-3-indolil caprilato, 4-nitrofenil caprilato, 2- naftil caprilato, 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-α-D-galactopiranosideo, resorufinil- α-D-galactopiranosideo e 4-nitrofenil-α-D-galactopiranosideo.

[009] Em qualquer das modalidades acima, o primeiro sistema indicador diferencial pode compreender um indicador de pH e pelo menos um carboidrato selecionado do grupo que consiste em melibiose, 2-desoxi-D- ribose, manitol, L-arabinose, dulcitol, maltose, L-ramnose, trealose, D-xilose e sorbitol.

[010] Em qualquer das modalidades acima, o primeiro produto detectável pode ser substancialmente solúvel em água, sendo que observar o primeiro produto detectável pode compreender observar uma zona colorida adjacente à colônia microbiana.

[011] Em qualquer das modalidades acima, observar o segundo produto detectável compreende observar o dispositivo de cultura para detectar uma segunda cor detectável. Em qualquer das modalidades acima, o segundo composto indicador diferencial pode ser selecionado do grupo que consiste em 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosideo, 5-bromo-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo, 5-bromo-6-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosideo, 2-nitrofenil-β-D-galactopiranosideo e 4-nitrofenil-β-D-galactopiranosideo.

[012] Em qualquer das modalidades acima, o primeiro produto detectável pode ser substancialmente solúvel em água e o segundo produto detectável pode ser substancialmente insolúvel em água ou, alternativamente, onde o primeiro produto detectável pode ser substancialmente insolúvel em água e o segundo produto detectável pode ser substancialmente solúvel em água.

[013] Em qualquer das modalidades acima, o primeiro agente seletivo é selecionado do grupo que consiste em um antibiótico, sais biliares, sais biliares n° 3, ácido desoxicólico, ácido cólico, cristal violeta, novobiocina, ácido nalidíxico, polimixina B, estreptomicina, meticilina, cefsoludina ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos agentes seletivos supracitados. Em qualquer das modalidades acima, o dispositivo de cultura pode compreender adicionalmente pelo menos um segundo agente seletivo, onde o pelo menos um segundo agente seletivo inibe o crescimento de pelo menos um micro-organismo entérico Gram- negativo que não é um membro do gênero Salmonella. Em algumas modalidades, o segundo agente seletivo pode ser selecionado do grupo que consiste em um antibiótico e-lactâmico, um antibiótico aminoglicosídeo, um antibiótico quinolona, um antibiótico sulfa, um antibiótico polimixina e uma combinação de quaisquer dois ou mais dos antibióticos anteriormente mencionados. Em algumas modalidades, o pelo menos um segundo agente seletivo compreende uma combinação de ácido nalidíxico, estreptomicina e polimixina B. Em qualquer das modalidades acima, incubar o dispositivo de cultura compreende incubar o dispositivo de cultura a uma temperatura entre 41 e 44°C, inclusive.

[014] Em qualquer das modalidades acima, o método pode compreender adicionalmente fornecer um artigo com um terceiro sistema indicador diferencial que compreende um terceiro composto indicador diferencial que pode ser convertido por um micro-organismo Salmonella em um terceiro produto detectável, colocar o artigo em contato com o dispositivo de cultura inoculado, incubar o dispositivo de cultura inoculado durante um segundo período de tempo e observar o dispositivo de cultura para detectar o terceiro produto detectável, a observação do terceiro produto detectável justaposto ao primeiro produto detectável indica a presença de um micro-organismo Salmonella na amostra.

[015] Em qualquer das modalidades acima, o método pode compreender adicionalmente fornecer um composto indicador não diferencial que pode ser convertido por um micro-organismo entérico em um quarto produto detectável e observar o dispositivo de cultura para detectar uma presença ou uma ausência do quarto produto detectável; em que colocar, no dispositivo de cultura, o meio nutritivo, o primeiro agente seletivo, o primeiro sistema indicador diferencial e o segundo sistema indicador diferencial em contato com uma amostra para formar um dispositivo de cultura inoculado, compreende adicionalmente colocar, no dispositivo de cultura, o meio nutritivo, o primeiro agente seletivo, o primeiro sistema indicador diferencial, o segundo sistema indicador diferencial e o composto indicador não diferencial em contato com a amostra para formar o dispositivo de cultura inoculado.

[016] Em qualquer das modalidades acima, observar o dispositivo de cultura pode compreender observar o dispositivo de cultura visualmente. Em qualquer das modalidades acima, observar o dispositivo de cultura pode compreender criar uma imagem do dispositivo de cultura com o uso de um dispositivo de imagem. Em qualquer das modalidades acima, o método pode compreender adicionalmente analisar a imagem com o uso de um processador. Em qualquer das modalidades acima, o método pode compreender adicionalmente enumerar várias colônias formadas por um micro-organismo pertencente ao grupo.

[017] As palavras "preferencial" e "de preferência" referem-se às modalidades da invenção que possam proporcionar certos benefícios, sob certas circunstâncias. Entretanto, outras modalidades podem, também, ser preferenciais sob as mesmas ou outras circunstâncias. Além disso, a menção de uma ou mais modalidades preferenciais não implica que outras modalidades não sejam úteis e não tem a intenção de excluir outras modalidades do escopo da invenção.

[018] "Micro-organismo salmonela", como usado aqui, refere-sea um ou mais micro-organismos pertencentes ao gênero salmonela.

[019] "Sistema indicador diferencial", como usado aqui, refere- se a um ou mais compostos que são usados para distinguir dois tipos de micro-organismos com base na sua respectiva capacidade de converter um composto indicador diferencial em um produto detectável. Em alguns casos, por exemplo, o composto indicador diferencial (por exemplo, 2-nitrofenil-β-D- galactosídeo) pode ser convertido por um tipo de micro-organismo diretamente no produto detectável (por exemplo, 2-nitrofenol). Em alguns casos, por exemplo, o composto indicador diferencial (por exemplo, 5-bromo- 4-cloro-3-indoxil-α-D-galactopiranosideo) pode ser convertido por um tipo de micro-organismo em um produto intermediárioque, na presença de ar, pode reagir para formar o produto detectável (um tipo de corante índigo). Em alguns casos, por exemplo, o composto indicador diferencial (por exemplo, um carboidrato fermentável, como melibiose) pode ser convertido por um tipo de micro-organismo no produto detectável (por exemplo, ácido láctico), que pode reagir com um outro componente do sistema indicador diferencial (por exemplo, um indicador de pH como vermelho de clorofenol) para produzir uma alteração de cor detectável no outro componente.

[020] "Agente seletivo", como usado aqui, refere-se a um composto químico que inibe mais o crescimento do primeiro micro-organismo ou de um primeiro grupo de micro-organismos que o de um segundo microorganismo ou de um segundo grupo de micro-organismos favorecendo, assim, o crescimento do(s) micro-organismo(s) menos inibido(s).

[021] Os termos "compreende" e as variações do mesmo não têm um significado limitador quando esses termos aparecem na descrição e nas reivindicações.

[022] Para uso na presente invenção, "um", "uma", "o", "a", "pelo menos um", "pelo menos uma", "um ou mais" e "uma ou mais" são usados de maneira intercambiável. Dessa forma, por exemplo, um micro-organismo pode ser interpretado como "um ou mais" micro-organismos.

[023] O termo "e/ou" significa um ou todos os elementos mencionados ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos elementos listados.

[024] Para uso na presente invenção, as citações de intervalos numéricos com extremos incluem todos os números contidos nesta faixa (por exemplo, 1 a 5 inclui 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.).

[025] O sumário anterior da presente invenção não se destina a descrever cada uma das modalidades apresentadas ou todas as implementações da presente invenção. A descrição a seguir exemplifica mais particularmente as modalidades ilustrativas. Em diversos lugares, em todo o pedido, é fornecida orientação através de listas de exemplos, nas quais os exemplos podem ser usados em diversas combinações. Em cada caso, a lista citada serve apenas com um grupo representativo e não deve ser interpretada como uma lista exclusiva.

[026] Detalhes adicionais destas e outras modalidades são demonstrados nos desenhos em anexo e na descrição abaixo. Outras características, objetivos e vantagens se tornarão aparentes a partir da descrição e dos desenhos, e a partir das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[027] A Figura 1 mostra um diagrama de blocos de uma modalidade de método de detecção de um micro-organismo Salmonella de acordo com a presente descrição.

[028] A Figura 2 mostra um diagrama de blocos das etapas analíticas adicionais e das etapas do processo adicionais associadas a uma modalidade do método mostrada na Figura 1.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[029] O gênero Salmonella inclui duas espécies, Salmonella enterica e Salmonella bongori. O parentesco genético das duas espécies foi estudado por Fookes et al. ("Salmonella bongori Provides Insights into the Evolution of the Salmonellae", PLOs Pathogens em www.plospathogens.org, 2011, vol. 7, artigo número e1002191, p 1-16, que está aqui integralmente incorporado, por referência). Embora a subespécie S. enterica seja mais conhecida que a S. bongori pela capacidade de infectar e causar doença em seres humanos, foi observado que S. bongori também causa infecções em seres humanos. Dessa forma, um teste projetado para detectar microorganismos Salmonella potencialmente patogênicos deve ser capaz de detectar ambas as espécies.

[030] A presente descrição refere-se, de modo geral, a um método para detectar micro-organismos Salmonella em uma amostra. Em particular, a presente descrição está relacionada a um método de detecção baseado em crescimento que é capaz de distinguir certos micro-organismos Salmonella produtores de β-galactosidase (por exemplo, membros da espécie S. bongori) de micro-organismos não Salmonella produtores de β-galactosidase (por exemplo, Escherichia coli e outros membros que produzem β-galactosidase da família Enterobacteriaceae). O método da invenção combina um meio de cultura seletivo que inclui uma pluralidade de reagentes indicadores diferenciais com uma temperatura de incubação elevada para diferenciar micro-organismos S. bongori.

[031] A detecção baseada em crescimento e a identificação de Salmonella em geral exige o uso de reações bioquímicas que detectam especificamente cepas de Salmonella na presença de micro-organismos não Salmonella. Infelizmente, a maioria dos sistemas de detecção convencionais não fornecem especificidades adequadas para diferenciar micro-organismos Salmonella de micro-organismos Enterobacteriaceae não Salmonella que podem estar presentes na amostra. Os testes com frequência exigem reagentes e procedimentos adicionais (por exemplo, testes imunológicos ou genéticos) para diferenciar micro-organismos não Salmonella de microorganismos Salmonella encontrados em uma amostra.

[032] Infelizmente, algumas das reações que são comumente usadas para detectar grupos de micro-organismos entéricos não Salmonella (por exemplo, bactérias coliformes) não diferenciam negativamente todas as cepas de Salmonella. Por exemplo, há algumas cepas de Salmonella que são lac positivas (produzem β-D-galactosidase) e, assim, não são diferenciadas negativamente de micro-organismos não Salmonella em testes que usam substratos enzimáticos para a β-galactosidase (por exemplo, 5-bromo-4-cloro-3- indolil-β-D-galactopiranosideo). Os investigadores descobriram que certas cepas de Salmonella β-D-galactosidase positivas não reagem com os substratos enzimáticos para a β-galactosidase quando incubadas a temperaturas elevadas. Além disso, a temperatura de incubação elevada pode inibir o crescimento de alguns micro-organismos não Salmonella produtores de β-galactosidase e/ou não afetam substancialmente a capacidade de detectar a atividade enzimática da β-galactosidase. Assim, a presente descrição fornece um método para a diferenciação de colônias em cultivo de Salmonella bongori de colônias de outros micro-organismos entéricos produtores de β-galactosidase.

[033] A presente descrição apresenta um método para detectar um micro-organismo Salmonella em uma amostra. A Figura 1 mostra uma modalidade de um método 10 de detectar um micro-organismo Salmonella em uma amostra.

[034] O método 10 compreende a etapa 45 de fornecer os componentes do procedimento de teste. Fornecer os componentes do procedimento de teste inclui fornecer uma amostra a ser testada, um dispositivo de cultura, um meio nutritivo que facilita o crescimento de um microorganismo entérico Gram-negativo, um primeiro agente seletivo que inibe o crescimento de micro-organismos Gram-positivos, um primeiro sistema indicador diferencial que compreende um primeiro composto indicador diferencial que pode ser convertido em um primeiro produto detectável por um membro de um grupo de micro-organismos Salmonella, que inclui um microorganismo da espécie Salmonella bongori, e um segundo sistema indicador diferencial que compreende um segundo composto indicador diferencial que pode ser convertido em um segundo produto detectável pela atividade enzimática da β-galactosidase. O método 10 compreende adicionalmente a etapa 50 de colocar os componentes do procedimento de teste em contato para formar um meio nutritivo inoculado. Colocar os componentes do procedimento de teste em contato para formar um meio nutritivo inoculado inclui colocar em contato, no dispositivo de cultura, o meio nutritivo, o agente seletivo, o primeiro sistema indicador diferencial e o segundo sistema indicador diferencial com a amostra para formar um meio de cultura inoculado. O método 10 compreende adicionalmente a etapa 55 de incubar o meio de cultura inoculado durante um primeiro período de tempo a uma temperatura maior que 40°C e a etapa 60 de observar o dispositivo de cultura para detectar uma presença ou ausência do primeiro produto detectável e observar o dispositivo de cultura para detectar uma presença ou uma ausência do segundo produto detectável. Nessas modalidades, observar a presença do primeiro produto detectável indica uma possível presença na amostra de um micro-organismo Salmonella (por exemplo, Salmonella enterica e/ou Salmonella bongori). Observar a presença do primeiro produto detectável justaposto ao segundo produto detectável indica uma presença na amostra de um micro-organismo diferente de um membro produtor de β-galactosidase da espécie Salmonella bongori.

[035] Em algumas modalidades, o método 10 pode compreender adicionalmente a etapa opcional 65 de colocar o meio nutritivo inoculado em contato com um terceiro sistema indicador diferencial que compreende um terceiro composto indicador diferencial que pode ser convertido por um micro-organismo Salmonella em um terceiro produto detectável, conforme descrito aqui.

[036] O terceiro sistema indicador diferencial pode ser colocado em contato com o meio nutritivo inoculado usando uma variedade de procedimentos, inclusive aqueles aqui descritos para colocar o primeiro composto indicador diferencial, o segundo composto indicador diferencial, o terceiro composto indicador diferencial ou o composto indicador não diferencial em contato com a amostra e/ou o meio nutritivo. Além disso, o terceiro sistema indicador diferencial pode ser colocado em contato com o meio nutritivo inoculado após o primeiro período de incubação colocando-se um artigo que compreende o terceiro sistema indicador em contato com o meio nutritivo inoculado. Isso pode ser feito, por exemplo, usando um artigo que tem um revestimento que compreende o terceiro sistema indicador diferencial. Por exemplo, o artigo pode compreender um revestimento e/ou um substrato revestido conforme descrito na patente US n° 6.022.682, que está aqui incorporado na íntegra, a título de referência.

[037] Depois que o terceiro sistema indicador diferencial que compreende um terceiro composto indicador diferencial é colocado em contato com o meio nutritivo inoculado, o método pode incluir a etapa opcional 70 de incubar a placa durante um segundo período de tempo. Durante o segundo período de incubação, um micro-organismo Salmonella, se estiver presente, pode converter o terceiro composto indicador diferencial em um terceiro produto detectável.

[038] Em algumas modalidades, o método 10 pode compreender adicionalmente a etapa opcional (não mostrada) de fornecer um composto indicador não diferencial. Nessas modalidades, colocar em contato, no dispositivo de cultura, a amostra, o meio nutritivo, o primeiro agente seletivo, o primeiro sistema indicador diferencial e o segundo sistema indicador diferencial para formar um meio de cultura inoculado opcionalmente pode compreender adicionalmente colocar em contato, no dispositivo de cultura, a amostra, o meio nutritivo, o primeiro agente seletivo, o primeiro sistema indicador diferencial, o segundo sistema indicador diferencial com um composto indicador não diferencial para formar o meio de cultura inoculado. O composto indicador não diferencial pode ser colocado em contato com os outros componentes do meio de cultura inoculado usando qualquer método adequado inclusive aqueles aqui descritos.

[039] Os compostos indicadores não diferenciais adequados incluem compostos indicadores que são metabolizados por, ou de outro modo reagem com, micro-organismos em cultura, e, assim, produzem um quarto produto detectável que pode fazer com que as colônias microbianas ou o meio nutritivo adjacente às colônias fiquem coloridos ou fluorescentes para facilitar a visualização, a formação de imagens e/ou a quantificação. O indicador não diferencial, e o quarto produto detectável derivado disso, não devem interferir substancialmente com a detecção do primeiro produto detectável ou do segundo produto detectável e/ou do terceiro produto detectável, se estiverem presentes no meio de cultura inoculado. Alguns exemplos não-limitadores de compostos indicadores não diferenciais adequados incluem indicadores redox cromogênicos, como cloreto de trifenil tetrazólio, vermelho de p-tolil tetrazólio, violeta de tetrazólio, azul de veratril tetrazólio e sal dissódico de 5-bromo-4- cloro-3-indolil-fosfato. Em uma modalidade onde um indicador não diferencial é colocado em contato com o meio nutritivo inoculado, observar o dispositivo de cultura para detectar a presença do primeiro e/ou segundo produto detectável pode compreender adicionalmente observar o dispositivo de cultura para detectar uma presença do quarto produto detectável.

[040] As amostras testadas no método da presente descrição incluem uma variedade de amostras que podem ser suspeitas de conter um micro-organismo Salmonella. Amostras de interesse específico incluem matéria-prima, matéria em processamento ou matéria do produto final de operações de processamento de alimento ou bebidas. Outras amostras adequadas incluem, por exemplo, amostras de água (por exemplo, água de superfície, água processada), amostras ambientais (por exemplo, amostras de ar, amostras de superfície de paredes, pisos, ralos, superfícies de contato com alimento, equipamento de processamento) e amostras clínicas. Exemplos não limitadores de amostras clínicas incluem amostras gastrointestinais, amostras retais e amostras fecais. As amostras de teste podem incluir líquidos, assim como sólido(s) dissolvido(s) ou suspenso(s) em um meio líquido.

[041] Os dispositivos de cultura da presente descrição incluem qualquer dispositivo de cultura que é usado para manter um meio nutritivo em um processo para detectar micro-organismos presentes em uma amostra. Em determinadas modalidades preferenciais, o meio nutritivo compreende um agente gelificante para facilitar a enumeração dos micro-organismos. Alguns exemplos não-limitadores de dispositivos de cultura adequados incluem placas de petri, placas multipoços, tubos, frascos, dispositivos de cultura de filme fino (por exemplo, os dispositivos de cultura de filme fino revelados na patentes US n°s 4.565.783, 5.601.998, 5.681.712, 6.265.203 e 6.638.755; cada uma das quais estando aqui incorporada, a título de referência, em sua totalidade) e similares.

[042] Em algumas modalidades, fornecer um dispositivo de cultura pode compreender fornecer um dispositivo de cultura que contém um meio nutritivo que facilita o crescimento de um micro-organismo entérico Gram- negativo, um primeiro agente seletivo que inibe o crescimento de microorganismos Gram-positivos, um primeiro sistema indicador diferencial, que compreende um primeiro composto indicador diferencial que pode ser convertido em um primeiro produto detectável por um membro de um grupo de microorganismos Salmonella que inclui um micro-organismo da espécie Salmonella bongori, e/ou um segundo sistema indicador diferencial que compreende um segundo composto indicador diferencial que pode ser convertido em um segundo produto detectável pela atividade enzimática da β-galactosidase.

[043] Em algumas modalidades, pelo menos um componente selecionado dentre o meio nutritivo que facilita o crescimento de um microorganismo entérico Gram-negativo, o primeiro agente seletivo que inibe o crescimento de micro-organismos Gram-positivos, o primeiro sistema indicador diferencial que compreende um primeiro composto indicador diferencial que pode ser convertido em um primeiro produto detectável por um membro de um grupo de micro-organismos Salmonella que inclui um micro-organismo da espécie Salmonella bongori, e/ou o segundo sistema indicador diferencial que compreende um segundo composto indicador diferencial que pode ser convertido em um segundo produto detectável por uma atividade enzimática da β-galactosidase é fornecido (opcionalmente, no dispositivo de cultura) em um estado substancialmente desidratado. Nessas modalidades, o pelo menos um componente desidratado pode ser reidratado com um líquido aquoso (por exemplo, água, uma solução tampão, um diluente, uma amostra líquida) antes ou durante o contato com a amostra.

[044] Em algumas modalidades, pelo menos um componente selecionado dentre o meio nutritivo que facilita o crescimento de um microorganismo entérico Gram-negativo; o primeiro agente seletivo que inibe o crescimento de micro-organismos Gram-positivos; o primeiro sistema indicador diferencial que compreende um primeiro composto indicador diferencial que pode ser convertido em um primeiro produto detectável por um membro de um grupo de micro-organismos Salmonella que inclui um micro-organismo da espécie Salmonella bongori; e/ou o segundo sistema indicador diferencial que compreende um segundo composto indicador diferencial que pode ser convertido em um segundo produto detectável por uma atividade enzimática da β-galactosidase é misturado com a amostra (por exemplo, dissolvido ou diluído em uma amostra líquida) antes de adicionar o componente ao dispositivo de cultura.

[045] Os meios nutritivos da presente descrição incluem qualquer meio nutritivo que facilite o crescimento de um micro-organismo entérico Gram- negativo. Uma variedade de meios nutritivos adequados são conhecidos na técnica. Meios nutritivos adequados incluem nutrientes proteináceos (por exemplo, produtos de digestão química e/ou enzimática de proteínas animais ou vegetais), que podem fornecer carbono, nitrogênio eenergia para facilitar o crescimento de micro-organismos entéricos Gram-negativos. O meio nutritivo pode compreender outros nutrientes (por exemplo, minerais ou outros componentes), desde que não interfiram substancialmente com a função do primeiro sistema indicador diferencial, com o segundo sistema indicador diferencial e/ou com o terceiro sistema indicador diferencial, se estiverem presentes.

[046] O primeiro sistema indicador diferencial da presente descrição compreende um primeiro composto indicador diferencial que pode ser convertido em um primeiro produto detectável por um micro-organismo Salmonella. De preferência, o primeiro composto indicador diferencial pode ser convertido em um primeiro produto detectável por um membro de um grupo de micro-organismos Salmonella que inclui um micro-organismo da espécie Salmonella bongori. Com mais preferência, o primeiro composto indicador diferencial também é convertido no primeiro produto detectável por um microorganismo Salmonella pertencente a uma espécie diferente de S. bongori (por exemplo, S. enterica). Em algumas modalidades, o primeiro sistema indicador diferencial compreende um primeiro composto indicador diferencial que pode ser convertido em um primeiro produto detectável por pelo menos um microorganismo entérico não Salmonella capaz de crescer no dispositivo de cultura.

[047] Em algumas modalidades, o primeiro composto indicador diferencial é um composto nutritivo (por exemplo, um carboidrato) que pode ser convertido (por exemplo, via fermentação) por um micro-organismo Salmonella em um primeiro produto detectável (por exemplo, um ou mais compostos ácidos, como ácido láctico, por exemplo, e/ou um gás, como, dióxido de carbono, por exemplo). De preferência, o primeiro indicador diferencial compreende um composto nutritivo que é convertido no primeiro produto detectável por uma pluralidade de espécies e/ou subespécies de Salmonella no primeiro produto detectável. Com mais preferência, o primeiro indicador diferencial compreende um composto nutritivo que não é convertido no primeiro produto detectável por muitas espécies de micro-organismos entéricos negativos que não pertencem ao gênero Salmonella. Com mais preferência ainda, o primeiro indicador diferencial compreende um composto nutritivo que não é convertido no primeiro produto detectável por um micro-organismo não Salmonella. Exemplos não limitadores de primeiros indicadores diferenciais adequados incluem um composto selecionado do grupo que consiste em melibiose, 2-desoxi-D-ribose, manitol, L- arabinose, dulcitol, maltose, L-ramnose, trealose, D-xilose e sorbitol.

[048] Em algumas modalidades em que um composto ácido é o primeiro produto detectável, o primeiro sistema indicador diferencial pode compreender adicionalmente um indicador de pH. Inúmeros indicadores de pH para detectar compostos ácidos produzidos por bactérias são conhecidos na técnica. Exemplos não limitadores de indicadores de pH adequados incluem vermelho de fenol, vermelho de clorofenol, vermelho neutro, azul de bromotimol e púrpura de bromotimol. Em algumas modalidades em que o primeiro produto detectável compreende um gás, o gás pode ser detectado, por exemplo, capturando o gás (por exemplo, capturando o gás em um tubo de Durham em um caldo de cultura, capturando o gás em um hidrogel em um dispositivo de cultura de filme fino, conforme descrito no Interpretation Guide for the PETRIFILM Enterobacteriaceae Count Plate, que está aqui integralmente incorporado, por referência).

[049] Em algumas modalidades, o primeiro composto indicador pode compreender um substrato enzimático. Substratos enzimáticos adequados incluem um substrato enzimático cromogênico ou fluorogênico que é convertido (por exemplo, hidrolisado por uma enzima) em um primeiro produto detectável (por exemplo, um produto colorido ou um produto fluorescente) por um membro de um grupo de micro-organismos Salmonella que inclui um micro-organismo da espécie Salmonella bongori. De preferência, o substrato enzimático é convertido no primeiro produto detectável por um micro-organismo Salmonella pertencente a uma espécie diferente de S. bongori (por exemplo, S. enterica). Alguns exemplos não-limitadores de substratos enzimáticos adequados incluem substratos enzimáticos para detectar a atividade enzimática da caprilato esterase ou detectar a atividade enzimática da α-galactosidase. Substratos enzimáticos cromogênicos incluem, por exemplo, um substrato enzimático selecionado do grupo que consiste em 5-bromo-6-cloro-3-indolil caprilato, 4-nitrofenil caprilato, 2-naftil caprilato, 5- bromo-4-cloro-3-indoxil-α-D-galactopiranosideo, resorufinil-α-D-galactopiranosídeo, 4-nitrofenil-α-D-galactopiranosideo e combinações dos mesmos.

[050] Os segundos sistemas indicadores diferenciais da presente descrição compreendem um segundo composto indicador diferencial que pode ser convertido em um segundo produto detectável por uma atividade enzimática da β-galactosidase. Consequentemente, o segundo sistema indicador diferencial distingue micro-organismos que produzem atividade enzimática da β- galactosidase dos micro-organismos que não produzem atividade enzimática da β-galactosidase. Por exemplo, muitas Salmonellae não produzem atividade enzimática da β-galactosidase e podem ser diferenciadas dos membros da família Enterobacteriaceae que utilizam lactose com o uso de um indicador de atividade enzimática da β-galactosidase, conforme revelado por A. Rambach ("New plate medium for facilitated differentiation of Salmonella spp. From Proteus spp. And other enteric bacteria", 1990, Appl. Environ. Microbiol., vol. 56, pp. 301303; que está aqui integralmente incorporado, por referência).

[051] Entretanto, alguns relatos indicam que mais de 90% dos micro-organismos isolados de algumas espécies (por exemplo, S. bongori) e subespécies (por exemplo, S. enterica arizonae e S. enterica diarizonae) de Salmonella produzem atividade enzimática de β-galactosidase (por exemplo, consulte A.M. Littell, "Plating medium for differentiating Salmonella arizonae from other Salmonellae", 1977, Appl. Environ. Microbiol., vol. 33, pp. 485-487; que está aqui integralmente incorporado, por referência). Dessa forma, um meio de cultura e o procedimento correspondente projetado para distinguir micro-organismos Salmonella de micro-organismos não Salmonella com base na atividade enzimática da β-galactosidase podem subestimar erroneamente o número de micro-organismos Salmonella em uma amostra, se salmonelas produtoras de β- galactosidase estiverem presentes na amostra. Os investigadores descobriram um método que, surpreendentemente, é capaz de distinguir alguns micro-organismos Salmonella produtores de β-galactosidase mesmo quando o meio de cultura usado no método precisa de um indicador da atividade enzimática da β- galactosidase para distinguir micro-organismos Salmonella de micro-organismos não Salmonella. Um exemplo não-limitador de um segundo composto indicador diferencial adequado de acordo com a presente descrição é 5-bromo-4-cloro-3- indolil-β-D-galactopiranosideo, 5-bromo-3-indolil-β-D-galactopiranosideo, 5-bromo- 6-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosideo, 2-nitrofenil-β-D-galactopiranosideo, 4- nitrofenil-β-D-galactopiranosideo. Em algumas modalidades, o segundo sistema indicador diferencial compreende lactose e um indicador de pH.

[052] Os métodos da presente descrição usam um primeiro agente seletivo para inibir o crescimento de micro-organismos Gram-positivos, reduzindo assim a competição por nutrientes e facilitando o crescimento de micro- organismos Gram-negativos, como os membros do gênero Salmonella. Exemplos não limitadores de primeiros agentes seletivos adequados incluem um agente seletivo selecionado do grupo que consiste em um antibiótico, sais biliares, sais biliares n° 3, ácido cólico, ácido desoxicólico, cristal violeta, novobiocina, ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos agentes seletivos supracitados.

[053] Os métodos da presente descrição opcionalmente podem usar pelo menos um segundo agente seletivo para inibir o crescimento de pelo menos um micro-organismo entérico Gram-negativo que não seja membro do gênero Salmonella. Em algumas modalidades, o segundo agente seletivo pode também inibir o crescimento de pelo menos um micro-organismo gram-positivo. Vantajosamente, o segundo agente seletivo, em combinação com o primeiro agente seletivo, adicionalmente inibe micro-organismos (micro-organismos Gram-negativos e/ou Gram-positivos), reduzindo, assim, a competição por nutrientes e facilitando o crescimento de um micro-organismo Salmonella. Além disso, o pelo menos um segundo agente seletivo pode também impedir substancialmente o crescimento de um micro-organismo Gram-negativo não Salmonella que de outro modo converteria o primeiro composto diferencial e/ou o terceiro composto diferencial no seu respectivo produto detectável. Dessa forma, o segundo agente seletivo pode reduzir a probabilidade de um microorganismo não Salmonella ser interpretado como um possível micro-organismo Salmonella. Exemplos não limitadores de segundos agentes adequados incluem um agente seletivo selecionado do grupo que consiste em um antibiótico e-lactâmico, um antibiótico aminoglicosídeo, um antibiótico quinolona, um antibiótico sulfa, um antibiótico polimixina e uma combinação de quaisquer dois ou mais dos antibióticos anteriormente mencionados. Em uma modalidade, o pelo menos um segundo agente seletivo compreende uma combinação de ácido nalidíxico, estreptomicina e polimixina B. De preferência, a concentração de cada do pelo menos um segundo agente seletivo no meio nutritivo é selecionada para permitir o crescimento de um micro-organismo Salmonella. Com mais preferência, a concentração de cada do pelo menos um segundo agente seletivo no meio nutritivo é selecionada para permitir o crescimento de todos os micro-organismos Salmonella.

[054] Os métodos da presente descrição compreendem colocar, no dispositivo de cultura, o meio nutritivo, o primeiro agente seletivo, o primeiro sistema indicador diferencial e o segundo sistema indicador diferencial em contato com uma amostra para formar um meio de cultura inoculado. A amostra pode ser colocada em contato no dispositivo de cultura com o meio nutritivo, o primeiro agente seletivo, o primeiro sistema indicador diferencial e o segundo sistema indicador diferencial em qualquer de uma variedade de formas. Por exemplo, em uma modalidade do método, o meio nutritivo, o primeiro agente seletivo, o primeiro sistema indicador diferencial e o segundo sistema indicador diferencial podem ser colocados no dispositivo de cultura como uma mistura em um forma hidratada (por exemplo, em um meio de cultura de ágar hidratado, por exemplo). Nessa modalidade, a amostra (por exemplo, uma amostra líquida, uma amostra sólida, uma amostra líquida e/ou sólida capturada em um filtro, uma amostra sólida suspensa em um meio líquido) pode ser depositada e, opcionalmente, distribuída, em ou sobre a mistura por técnicas que são conhecidas na técnica como, por exemplo, pipetagem, técnicas de inoculação por espalhamento em placa e técnicas de inoculação em placa por estriamento.

[055] Em uma modalidade alternativa, a amostra (por exemplo, que compreende um líquido e/ou material sólido) é colocada em contato e misturada com uma mistura líquida (por exemplo, uma solução de ágar líquida fundida, temperada) que compreende o meio nutritivo, o primeiro agente seletivo, o primeiro sistema indicador diferencial e o segundo sistema indicador diferencial e subsequentemente a mistura é transferida para o dispositivo de cultura.

[056] Em uma outra modalidade alternativa, um ou mais dos componentes (por exemplo, o meio nutritivo, o primeiro agente seletivo, o primeiro sistema indicador diferencial e o segundo sistema indicador diferencial) podem ser dispostos em um dispositivo de cultura em uma forma desidratada, como em um dispositivo de cultura de filme fino similar aos dispositivos de cultura revelados nas patentes US n°s 4.565.783, 5.601.998, 5.681.712, 6.265.203 e 6.638.755. Nessa modalidade, a amostra (por exemplo, uma amostra líquida aquosa ou uma amostra sólida suspensa em um meio de suspensão aquoso) pode ser colocada em contato com os componentes desidratados através da pipetagem da amostra no dispositivo de cultura, por exemplo. Nessa modalidade, um ou mais dos componentes da composição podem ser dissolvidos ou suspensos na amostra antes ou depois de a amostra ser depositada no dispositivo de cultura.

[057] Em ainda outra modalidade alternativa, um ou mais dos componentes (por exemplo, o meio nutritivo, o primeiro agente seletivo, o primeiro sistema indicador diferencial e o segundo sistema indicador diferencial) podem ser dispostos em um dispositivo de cultura em uma forma desidratada, como em um dispositivo de cultura de filme fino, conforme descrito aqui. Um líquido aquoso adequado (por exemplo, água estéril, um tampão estéril, que compreende opcionalmente um ou mais dos componentes) é pipetado no dispositivo de cultura, e o agente gelificante, se estiver presente, no dispositivo de cultura é permitido reidratar. Subsequentemente, a amostra pode ser depositada (por exemplo, por pipetagem, estriamento, colocação de uma membrana filtrante que compreende a amostra) no dispositivo de cultura em contato com os componentes.

[058] Uma pessoa com conhecimentos básicos da técnica vai reconhecer uma variedade de outros procedimentos nos quais os componentes (por exemplo, o meio nutritivo, o primeiro agente seletivo, o primeiro sistema indicador diferencial e o segundo sistema indicador diferencial) podem ser colocados em contato com a amostra em um dispositivo de cultura.

[059] Os métodos da presente descrição compreendem adicionalmente incubar o dispositivo de cultura inoculado durante um primeiro período de tempo. Incubar o dispositivo de cultura inoculado pode compreender manter o dispositivo a uma temperatura elevada (por exemplo, em uma incubadora com temperatura controlada). Incubar o dispositivo de cultura inoculado a uma temperatura elevada (por exemplo, acima de 25°C) facilita o crescimento de micro-organismos entéricos, como micro-organismos do gênero Salmonella. A maioria das técnicas para cultivar micro-organismos Salmonella envolve colocar o dispositivo de cultura em um ambiente de cerca de 37°C (aproximadamente a temperatura corporal de um ser humano). Entretanto, a essa temperatura, os membros da espécie Salmonella bongori são capazes de produzir atividade enzimática da β-D-galactosidase, que é detectável com o uso do segundo sistema indicador diferencial da presente descrição. Entretanto, muitas das Salmonella bongori são capazes de crescer, mas não de produzir atividade enzimática da β-D-galactosidase, que é detectável com o uso do segundo sistema indicador diferencial da presente descrição a temperaturas acima de 40°C. Dessa forma, os métodos da presente descrição compreendem incubar o dispositivo de cultura inoculado a uma temperatura maior que 40°C (por exemplo, a temperaturas acima de ou iguais a 41°C) durante um primeiro período de tempo. Em algumas modalidades, incubar o dispositivo de cultura inoculado compreende incubar o dispositivo de cultura inoculado a uma temperatura entre 41°C e 44°C, inclusive. Em algumas modalidades, incubar o dispositivo de cultura inoculado compreende incubar o dispositivo de cultura inoculado a uma temperatura de 41°C. Em algumas modalidades, incubar o dispositivo de cultura inoculado compreende incubar o dispositivo de cultura inoculado a uma temperatura de 42°C. Em algumasmodalidades, incubar o dispositivo de cultura inoculado compreende incubar o dispositivo de cultura inoculado a uma temperatura de 43°C. Em algumas modalidades, incubar o dispositivo de cultura inoculado compreende incubar o dispositivo de cultura inoculado a uma temperatura de 44°C.

[060] O dispositivo de cultura é incubado durante um primeiro período de tempo suficiente para permitir o crescimento e a multiplicação de micro-organismos entéricos presentes na amostra. Tipicamente, o dispositivo de cultura será incubado durante um primeiro período de 10 horas. Em algumas modalidades, os dispositivos de cultura são incubados durante um primeiro período de tempo de cerca de 14 a cerca de 48 horas. Em algumas modalidades, os dispositivos de cultura são incubados durante um primeiro período de tempo de cerca de 18 a cerca de 48 horas. Em algumas modalidades, os dispositivos de cultura são incubados durante um primeiro período de tempo de cerca de 24 a cerca de 36 horas. Em uma modalidade preferencial, os dispositivos de cultura são incubados durante um primeiro período de tempo de cerca de 24 ± 2 horas.

[061] Os métodos da presente descrição incluem observar o dispositivo de cultura para detectar uma presença ou uma ausência do primeiro produto detectável. O primeiro produto detectável é produzido por um membro de um grupo de micro-organismos Salmonella que inclui um micro-organismo da espécie Salmonella bongori. O membro do grupo converte o primeiro composto indicador diferencial (por exemplo, via fermentação, via atividade metabólica, via uma atividade enzimática) no primeiro produto detectável. Tipicamente, o meio nutritivo é observado após o primeiro período de incubação. Em qualquer modalidade, observar o meio nutritivo para detectar a presença do primeiro produto detectável pode compreender observar o dispositivo de cultura para detectar uma primeira cor detectável. Em algumas modalidades, a primeira cor detectável pode ser detectada por fluorescência (por exemplo, em uma modalidade caracterizada pelo fato de que o primeiro composto indicador diferencial compreende 4-metilumbeliferil-α-D-galactopiranosídeo).

[062] Em uma modalidade onde o primeiro sistema indicador diferencial compreende um carboidrato fermentável e um indicador de pH, a primeira cor detectável pode ser uma zona colorida associada ao indicador de pH próximo (por exemplo, em posição adjacente) a uma colônia de microorganismos capaz de converter o carboidrato em um ou mais produtos ácidos. Dessa forma, à medida que os produtos ácidos se acumulam na colônia e/ou no meio nutritivo ao redor da colônia, uma zona colorida, resultante da interação dos produtos ácidos com o indicador de pH, se forma adjacente à colônia e que, em alguns casos, pode também colorir a colônia. O tamanho da dita zona ácida pode ser controlado pelo uso de um tampão no meio nutritivo, conforme descrito na patente US n° 5.601.998.

[063] Em uma modalidade em que o primeiro composto indicador diferencial compreende um substrato enzimático cromogênico, a primeira cor detectável pode ser uma zona colorida adjacente à colônia do micro-organismo. Por exemplo, a zona colorida pode compreender um produto solúvel em água (por exemplo, 4-nitrofenol) resultante de uma enzima microbiana reagindo com o substrato cromogênico (por exemplo, 4-nitrofenil-a-D-galactopiranosídeo). Alternativamente, a zona colorida pode compreender um produto insolúvel em água (por exemplo, índigo) resultante de uma enzima microbiana reagindo com o substrato cromogênico (5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo).

[064] Os métodos da presente descrição incluem observar o dispositivo de cultura para detectar uma presença ou uma ausência do segundo produto detectável. O segundo produto detectável é produzido por um microorganismo que tem atividade enzimática β-galactosidase. O micro-organismo que tem atividade enzimática β-galactosidase converte o segundo composto indicador diferencial no segundo produto detectável. Tipicamente, o meio nutritivo é observado após o primeiro período de incubação. Em qualquer modalidade, observar o meio nutritivo para detectar a presença do segundo produto detectável pode compreender observar o dispositivo de cultura para detectar uma segunda cor detectável. Em algumas modalidades, a segunda cor detectável pode ser detectada observando a absorbância ou reflectância de luz. Em algumas modalidades, a segunda cor detectável pode ser detectada por fluorescência (por exemplo, em uma modalidade em que o primeiro composto indicador diferencial compreende 4-metilumbeliferil-β-D-galactopiranosideo).

[065] Uma pessoa com conhecimentos básicos da técnica vai reconhecer que, em qualquer modalidade, o primeiro produto detectável não deve interferir substancialmente com a detecção (por exemplo, por mascaramento da cor ou arrefecimento brusco fluorescente) do segundo produto detectável, e o segundo produto detectável não deve interferir substancialmente com a detecção (por exemplo, por mascaramento da cor ou arrefecimento brusco fluorescente) do primeiro produto detectável. Uma pessoa com conhecimentos básicos da técnica vai reconhecer que, em qualquer modalidade em que a primeira cor detectável e a segunda cor detectável são detectadas por fluorescência, o primeiro produto detectável deve compreender um fluoróforo diferente do segundo produto detectável.

[066] Os métodos da presente descrição incluem observar o dispositivo de cultura para detectar um primeiro produto detectável e/ou um segundo produto detectável. Em qualquer modalidade do método, observar o dispositivo de cultura pode compreender observar a mistura que compreende o meio nutritivo; o primeiro agente seletivo; o primeiro sistema indicador diferencial; o segundo ingrediente seletivo; o segundo agente seletivo, se estiver presente e o terceiro sistema indicador diferencial, se estiver presente. Em qualquer modalidade do método, observar o dispositivo de cultura pode compreender observar o dispositivo de cultura visualmente (por exemplo, com o uso de um ou mais olhos humanos).

[067] Adicional ou alternativamente, em qualquer modalidade do método, observar o dispositivo de cultura pode compreender observar o dispositivo de cultura mecanicamente (por exemplo, com o uso de um sistema de formação de imagens, como, por exemplo, o sistema de formação de imagens descrito nas patentes US n°s 6.243.486, 7.496.225 e 7.351.574; cada uma das quais está aqui incorporada integralmente, a título de referência. Nessa modalidade, observar o dispositivo de cultura pode compreender criar uma imagem do dispositivo de cultura com o uso de um dispositivo de imagem. Em adição a criar uma imagem do dispositivo de cultura, o método opcionalmente pode compreender analisar a imagem com o uso de um processador.

[068] Os métodos da presente descrição podem ser usados para detectar e, opcionalmente, enumerar micro-organismos Salmonella em uma amostra. Por exemplo, observar a presença do primeiro produto detectável no dispositivo de cultura pode indicar uma possível presença, na amostra, de um micro-organismo Salmonella (por exemplo, um membro da espécie Salmonella bongori e/ou membro da espécie Salmonella enterica). Entretanto, em métodos de acordo com a presente descrição, observar a presença do primeiro produto detectável justaposto ao segundo produto detectável indica uma presença, na amostra, de um micro-organismo diferente de um membro produtor de β- galactosidase da espécie Salmonella bongori.

[069] O terceiro composto indicador diferencial pode ser qualquer composto indicador adequado para detectar um micro-organismo Salmonella, desde que o terceiro produto detectável derivado dele seja distinguível, de preferência, opticamente distinguível, com mais preferência, visualmente distinguível do primeiro produto detectável do primeiro sistema indicador diferencial e do segundo produto detectável do segundo sistema indicador diferencial. Dessa forma, em uma modalidade, o terceiro sistema indicador diferencial pode compreender um indicador de pH em conjunto com um nutriente (por exemplo, um carboidrato) que pode ser convertido (por exemplo, via fermentação) em um primeiro produto detectável (por exemplo, um composto ácido, como ácido láctico, por exemplo, e/ou um gás, como dióxido de carbono, por exemplo), conforme descrito aqui. Em uma outra modalidade, o terceiro sistema indicador diferencial pode compreender um substrato enzimático cromogênico, conforme descrito aqui. Em ainda outra modalidade, o terceiro sistema indicador diferencial pode ser um substrato enzimático cromogênico, conforme descrito aqui. Qualquer primeiro sistema indicador diferencial aqui descrito pode ser adequado ao uso como um terceiro sistema indicador diferencial, desde que não interfira substancialmente com, e seja distinguível de, o primeiro e o segundo sistemas indicadores de diferenciação e/ou o quarto sistema indicador, se estiverem presentes.

[070] Vantajosamente, o terceiro sistema indicador diferencial pode ser usado como um meio de "confirmar" a presença de um microorganismo Salmonella na amostra. Ou seja, quando uma presença de um primeiro produto detectável é observada no dispositivo de cultura, essa presença pode ser interpretada como uma indicação da possível presença de um microorganismo Salmonella na amostra. Entretanto, quando uma presença de um terceiro produto detectável é observada em justaposição com a presença do primeiro produto detectável (isto é, o primeiro e o terceiro produtos detectáveis estão associados à mesma colônia bacteriana), a observação pode indicar uma maior probabilidade (por exemplo, uma probabilidade significativamente maior) da presença de um micro-organismo Salmonella na amostra.

[071] Incubar o dispositivo de cultura inoculado durante um segundo período de tempo pode compreender manter o dispositivo a uma temperatura elevada (por exemplo, em uma incubadora com temperatura controlada). Incubar o dispositivo de cultura inoculado a uma temperatura elevada (por exemplo, maior que 25°C mas menor que ou igual a cerca de 44°C) pode facilitar a conversão por micro-organismos entéricos (por exemplo, membros do gênero Salmonella) do terceiro composto indicador diferencial no terceiro produto detectável. Em uma modalidade preferencial, o dispositivo de cultura será incubado durante um segundo período de tempo a uma temperatura entre 35 e 42°C, inclusive. Em uma modalidade mais preferencial, o dispositivo de cultura será incubado durante um segundo período de tempo a uma temperatura entre 42°C ± 1 grau C.

[072] Em algumas modalidades, o terceiro sistema indicador diferencial é colocado em contato com o meio nutritivo inoculado após o primeiro período de incubação. Vantajosamente, isso pode reduzir a duração do segundo período de incubação necessário para detectar o terceiro produto detectável. Dessa forma, em algumas modalidades, o segundo período de incubação pode ser de 1 hora a cerca de 6 horas. Em algumas modalidades, o segundo período de incubação pode ser cerca de 2 horas a cerca de 4 horas. Em uma modalidade preferencial, o segundo período de incubação é de 4 horas ± 1 hora.

[073] Quando usado de acordo com a presente descrição, o método pode detectar a presença ou ausência de um micro-organismo Salmonella em uma amostra. A Figura 2 mostra uma modalidade de várias etapas analíticas e as etapas opcionais do processo associadas ao método mostrado na Figura 1. Depois que o dispositivo de cultura é incubado durante um primeiro período de tempo, conforme mostrado na Figura 1, o dispositivo de cultura é observado (etapa 60) para detectar (etapa 100) uma presença ou uma ausência de um primeiro produto detectável e para detectar (etapa 110) uma presença ou uma ausência de um segundo produto detectável. O primeiro e/ou segundo produtos detectáveis podem ser detectados conforme descrito aqui.

[074] Se o primeiro produto detectável não é detectado após um período de incubação suficiente, supõe-se que a amostra de teste não contém um micro-organismo Salmonella, conforme mostrado na etapa 105. Se o primeiro produto detectável for observado, o dispositivo de cultura é adicionalmente observado (etapa 110) quanto à presença do segundo produto detectável justaposto ao primeiro produto detectável. Se o primeiro produto detectável é observado justaposto ao segundo produto detectável, supõe-se que a amostra não contém um micro-organismo salmonela, conforme mostrado na etapa 115.

[075] Se for observado que o primeiro produto detectável está associado à colônia microbiana e o segundo produto detectável não for observado, ou se o segundo produto detectável não estiver justaposto ao primeiro produto detectável adjacente à colônia microbiana, supõe-se que a amostra de teste contém pelo menos um micro-organismo salmonela, conforme mostrado na etapa 118. O micro-organismo Salmonella pode ser um membro da espécie S. bongori ou pode ser um membro não produtor de β-galactosidase da espécie S. enterica. Opcionalmente, o operador pode querer confirmar se um micro-organismo produzindo o primeiro produto detectável é um membro do gênero Salmonella. Isso pode ser realizado, por exemplo, executando-se a etapa opcional 65 de colocar o meio nutritivo inoculado em contato com o terceiro sistema indicador (por exemplo, fornecendo um artigo que compreende o terceiro sistema indicador e colocando o meio nutritivo inoculado em contato com o artigo), como apresentado na presente invenção. A etapa opcional de contato 65 é seguida da etapa opcional 70 de incubar o dispositivo de cultura inoculado durante um segundo período de tempo, conforme descrito aqui. Após o segundo período de incubação, o dispositivo de cultura é observado (etapa 75) para detectar (etapa 120) uma presença ou uma ausência de um terceiro produto detectável, conforme descrito aqui. Se o terceiro produto detectável for observado, pode-se concluir que a colônia microbiana que tem o primeiro e o terceiro produtos detectáveis associados com isso é provavelmente um membro (por exemplo, um membro produtor de α-galactosidase) do gênero Salmonella, conforme mostrado na etapa 125. Se a colônia do micro-organismo não produzir o terceiro produto detectável, supõe-se que a colônia não é um membro do gênero Salmonella (por exemplo, pode ser um micro-organismo entérico não produtor de β-galactosidase), conforme mostrado na etapa 135.

[076] Em qualquer modalidade, o método pode compreender adicionalmente enumerar várias colônias formadas por micro-organismos pertencentes a um grupo (por exemplo, um grupo que consiste em microorganismos salmonela, um grupo que consiste em micro-organismos produtores de β-galactosidase, um grupo que consiste em salmonela produtora de β-galactosidase, um grupo de salmonela não produtora de β-galactosidase). A enumeração pode ser feita simplesmente pela contagem do número de colônias microbianas separadas no dispositivo de cultura de acordo com o sistema indicador ou sistemas indicadores com os quais cada colônia reage.

MODALIDADES

[077] A Modalidade 1 é um método de detectar microorganismos Salmonella, o método compreendendo:forneceruma amostra a ser testada;um dispositivo de cultura;um meio nutritivo que facilita o crescimento de um microorganismo entérico Gram-negativo;um primeiro agente seletivo que inibe o crescimento de micro-organismos Gram-positivos;um primeiro sistema indicador diferencial que compreende um primeiro composto indicador diferencial que pode ser convertido em um primeiro produto detectável por um membro de um grupo de micro-organismos Salmonella que inclui um micro-organismo da espécie Salmonella bongori; eum segundo sistema indicador diferencial que compreende um segundo composto indicador diferencial que pode ser convertido em um segundo produto detectável por uma atividade enzimática da β-galactosidase;colocar, no dispositivo de cultura, o meio nutritivo, o primeiro agente seletivo, o primeiro sistema indicador diferencial e o segundo sistema indicador diferencial em contato com uma amostra para formar um meio de cultura inoculado;incubar o dispositivo de cultura inoculado durante um primeiro período de tempo a uma temperatura acima de 40°C;observar o dispositivo de cultura para detectar uma presença ou uma ausência do primeiro produto detectável eobservar o dispositivo de cultura para detectar uma presença ou uma ausência do segundo produto detectável;sendo que observar a presença do primeiro produto detectável indica uma possível presença na amostra de um micro-organismo Salmonella;sendo que observar a presença do primeiro produto detectável justaposto ao segundo produto detectável indica uma presença na amostra de um micro-organismo diferente de um membro produtor de β-galactosidase da espécie Salmonella bongori.

[078] A Modalidade 2 é o método da Modalidade 1, em que o dispositivo de cultura é fornecido como um dispositivo de cultura de filme fino com o meio nutritivo, o primeiro agente seletivo, o primeiro sistema indicador diferencial e o segundo sistema indicador diferencial dispostos ali em uma forma substancialmente desidratada.

[079] A Modalidade 3 é o método da Modalidade 1 ou da Modalidade 2, em que observar a ausência do primeiro produto detectável indica uma ausência de um micro-organismo Salmonella na amostra.

[080] A Modalidade 4 é o método de qualquer uma das Modalidades anteriores, em que observar o meio nutritivo para detectar a presença do primeiro produto detectável compreende observar o dispositivo de cultura para detectar uma primeira cor detectável.

[081] A Modalidade 5 é o método de qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o primeiro composto indicador diferencial compreende um substrato enzimático.

[082] A Modalidade 6 é o método da Modalidade 5, em que o substrato enzimático compreende um substrato enzimático para detectar a atividade enzimática da caprilato esterase ou para detectar a atividade enzimática da α-galactosidase.

[083] A Modalidade 7 é o método da Modalidade 6, em que o substrato enzimático é selecionado do grupo que consiste em 5-bromo-6- cloro-3-indolil caprilato, 4-nitrofenil caprilato, 2-naftil caprilato, 5-bromo-4- cloro-3-indoxil-α-D-galactopiranosideo, resorufinil-α-D-galactopiranosideo e 4- nitrofenil-α-D-galactopiranosideo.

[084] A Modalidade 8 é o método de qualquer uma das Modalidades de 5 a 7, em que o primeiro produto detectável é substancialmente insolúvel em água.

[085] A Modalidade 9 é o método de qualquer uma das Modalidades de 1 a 6, em que o primeiro sistema indicador diferencial compreende um indicador de pH e pelo menos um carboidrato selecionado do grupo que consiste em melibiose, 2-desoxi-D-ribose, manitol, L-arabinose, dulcitol, maltose, L-ramnose, trealose, D-xilose e sorbitol.

[086] A Modalidade 10 é o método de qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o primeiro produto detectável é substancialmente solúvel em água, em que observar o primeiro produto detectável compreende observar uma zona colorida adjacente a uma colônia microbiana.

[087] A Modalidade 11 é o método de qualquer uma das Modalidades anteriores, em que observar o segundo produto detectável compreende observar o dispositivo de cultura para detectar uma segunda cor detectável.

[088] A Modalidade 12 é o método de qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o segundo composto indicador diferencial é selecionado do grupo que consiste em 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D- galactopiranosídeo, 5-bromo-3-indolil-β-D-galactopiranosideo, 5-bromo-6-cloro-3- indolil-β-D-galactopiranosideo, 2-nitrofenil-β-D-galactopiranosideo e 4-nitrofenil-β- D-galactopiranosídeo.

[089] A Modalidade 13 é o método de qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o primeiro produto detectável é substancialmente solúvel em água e o segundo produto detectável é substancialmente insolúvel em água ou, alternativamente, em que o primeiro produto detectável é substancialmente insolúvel em água e o segundo produto detectável é substancialmente solúvel em água.

[090] A Modalidade 14 é o método de qualquer uma das Modalidades de 1 a 13, em que o primeiro agente seletivo é selecionado do grupo que consiste em um antibiótico, sais biliares, sais biliares n° 3, ácido desoxicólico, ácido cólico, cristal violeta, novobiocina, ácido nalidíxico, polimixina B, estreptomicina, meticilina, cefsoludina ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos agentes seletivos supracitados.

[091] A Modalidade 15 é o método de qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o dispositivo de cultura compreende adicionalmente pelo menos um segundo agente seletivo, em que o pelo menos um segundo agente seletivo inibe o crescimento de pelo menos um micro-organismo entérico Gram-negativo que é não é um membro do gênero Salmonella.

[092] A Modalidade 16 é o método da Modalidade 15, em que o segundo agente seletivo é selecionado do grupo que consiste em um antibiótico e-lactâmico, um antibiótico aminoglicosídeo, um antibiótico quinolona, um antibiótico sulfa, um antibiótico polimixina e uma combinação de quaisquer dois ou mais dos antibióticos anteriormente mencionados.

[093] A Modalidade 17 é o método da Modalidade 16, em que o pelo menos um segundo agente seletivo compreende uma combinação de ácido nalidíxico, estreptomicina e polimixina B.

[094] A Modalidade 18 é o método de qualquer uma das Modalidades anteriores, em que incubar o dispositivo de cultura compreende incubar o dispositivo de cultura a uma temperatura entre 41 e 44°C, inclusive.

[095] A modalidade 19 é o método de qualquer uma das modalidades anteriores que compreende adicionalmente:fornecer um artigo com um terceiro sistema indicador diferencial que compreende um terceiro composto indicador diferencial que pode ser convertido por um micro-organismo Salmonella em um terceiro produto detectável;colocar o artigo em contato com o dispositivo de cultura inoculado;incubar o dispositivo de cultura inoculado durante um segundo período de tempo; eobservar o dispositivo de cultura para detectar o terceiro produto detectável;em que observar o terceiro produto detectável justaposto ao primeiro produto detectável indica a presença de um micro-organismo Salmonella na amostra.

[096] A Modalidade 20 é o método de qualquer uma das Modalidades anteriores, que compreende adicionalmente:

[097] fornecer um composto indicador não diferencial que pode ser convertido por um micro-organismo entérico em um quarto produto detectável; e

[098] observar o dispositivo de cultura para detectar uma presença ou uma ausência do quarto produto detectável;

[099] em que colocar, no dispositivo de cultura, o meio nutritivo, o primeiro agente seletivo, o primeiro sistema indicador diferencial e o segundo sistema indicador diferencial em contato com uma amostra para formar um dispositivo de cultura inoculado compreende adicionalmente colocar, no dispositivo de cultura, o meio nutritivo, o primeiro agente seletivo, o primeiro sistema indicador diferencial, o segundo sistema indicador diferencial e o composto indicador não diferencial em contato com a amostra para formar o dispositivo de cultura inoculado.

[0100] A Modalidade 21 é o método de qualquer uma das Modalidades anteriores, em que observar o dispositivo de cultura compreende observar o dispositivo de cultura visualmente.

[0101] A Modalidade 22 é o método de qualquer uma das Modalidades anteriores, em que observar o dispositivo de cultura compreende criar uma imagem do dispositivo de cultura com o uso de um dispositivo para formação de imagens.

[0102] A Modalidade 23 é o método da Modalidade 22, que compreende adicionalmente analisar a imagem com o uso de um processador.

[0103] A Modalidade 24 é o método de qualquer uma das Modalidades anteriores, que compreende adicionalmente enumerar várias colônias formadas por micro-organismos pertencentes ao grupo.

[0104] Exemplos

[0105] Os objetivos e vantagens desta invenção são ilustrados, ainda, pelos exemplos a seguir, porém, os materiais e as quantidades particulares relatados nestes exemplos, bem como outras condições e detalhes, não devem ser interpretados para limitador indevidamente esta invenção. Exceto onde indicado em contrário, todas as partes e porcentagens se encontram em uma base de peso, toda água é água destilada e todos os pesos moleculares são pesos moleculares médios ponderais.

[0106] Materiais. Os materiais utilizados na preparação dosexemplos são mostrados na Tabela 1.

[0107] As cepas bacterianas usadas nos Exemplos estão listadasna Tabela 2. As cepas bacterianas com uma designação de "FSD" seguida de um número foram isoladas de uma amostra de alimento ou de um ambiente de processamento de alimento. A identidade da S. agona FSD122 foi confirmada pela análise de sequência de DNA. As cepas bacterianas com uma designação de "ATCC" seguida de um número foram obtidas a partir da American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA.

EXEMPLO 1. PREPARAÇÃO DE UM DISPOSITIVO DE CULTURA DE FILME FINO PARA SALMONELLA.

[0108] Um dispositivo de cultura de filme fino foi preparado de acordo com o procedimento descrito no pedido de patente US n° de série 61/488.492 (n° do documento do procurador 67673US002) depositado em 20 de maio de 2011, que está aqui incorporado na íntegra, a título de referência. A composição em pó usada para preparar o substrato de papel revestido de pó foi feita misturando 2 partes, em peso, de 2-desoxi-D-ribose (2DDR; Research Products International Corp.; Mt. Prospect, IL, EUA) e 98 partes de goma guar (M150 goma guar MEYPROGAT, Meyhall Chemical AG). Antes do revestimento com pó, o papel foi revestido com o adesivo contendo TTC.

[0109] A mistura do caldo de revestimento foi preparada pela adição dos materiais mencionados na Tabela 3 em 1 litro de água desionizada em um recipiente e foi misturada de acordo com o método descrito no Exemplo 1 da patente US n° 6.022.682.

[0110] Uma mistura do agente seletivo foi preparada pela adição de0,1 g de IPTG, 2,0 g de ureia, 5,0 g melibiose (Sigma), 0,005 g de sal de sódio de ácido nalidíxico, 0,005 g de sal de sulfato de estreptomicina e 0,00075 g de sal de sulfato de polimixina B em 30 mL de água desionizada estéril em um tubo de centrifugação estéril de 50 ml e submetida a vórtice para misturar. A mistura do caldo foi resfriada a cerca de 40°C e a mistura do agente seletivo foi adicionada com mistura vigorosa. Um filme de cobertura foi preparado por aplicar o caldo como revestimento sobre o lado tratado por corona de um filme de poliéster de 0,073 mm (2,9 mil).

[0111] O dispositivo de cultura foi montado de acordo com a patente US n° 6.022.682, com o elemento de base, um espaçador de espuma com um círculo de 7,3 cm de diâmetro cortado a partir do centro para fazer uma cavidade, e a placa de cobertura aderida com o uso de uma fita adesiva de transferência. As placas medem aproximadamente 10,3 cm por 10,2 cm com um poço circular expondo a mistura revestida com caldo seca ao redor do centro da placa.

EXEMPLO 2. EFEITO DA TEMPERATURA DE INCUBAÇÃO SOBRE A ATIVIDADE DA B- GALACTOSIDASE PRODUZIDA POR VÁRIAS CEPAS DE ENTEROBACTERIACEAE.

[0112] Os dispositivos de cultura são feitos de acordo com o Exemplo 1. O meio de cultura em cada dispositivo de cultura foi hidratado com 1 mililitro de tampão de Butterfield estéril antes do uso. Os dispositivos foram mantidos à temperatura ambiente durante pelo menos uma hora antes de serem inoculados para permitir a expansão do hidrogel.

[0113] Uma colônia de culturas puras individuais (em tubos com TSA inclinados) de cada uma das cepas mencionadas na Tabela 2 foi transferida para frascos estéreis individuais contendo 1,0 mL de água peptonada tamponada e incubada a 37°C durante 24±2 horas para produzir uma suspensão bacteriana pura de cada cepa. Cada suspensão de Salmonella foi diluída a 1:100 em tampão de Butterfield. A suspensão de E. coli não foi diluída. Cada suspensão diluída e não diluída foi, então, inoculada por estriamento no meio com uma alça de plástico estéril de 10 microlitros. Um conjunto de dispositivos de cultura inoculados, cada um semeado por estriamento com uma bactéria diferente, foi preparado dessa forma. O conjunto de dispositivos de cultura foi, então, vedado em uma bolsa de plástico e incubado por imersão em banho-maria. As bolsas foram incubadas por esse método às seguintes temperaturas: 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C e 45°C. As temperaturas do banho-maria foram controladas em ±0,1°C e as bolsas foram imersas durante 24 ±2 horas. Duas réplicas de cada bactéria foram testadas. Os dispositivos de cultura incubados foram removidos das bolsas e as observações são mostradas na Tabela 4.

[0114] Os resultados indicam que a cepa de teste Salmonellaenterica serovar agona não produziu atividade da β-galactosidase em nenhuma temperatura de 39°C a 45°C. Os resultados adicionalmente indicam que as cepas de teste E. coli, Citrobacter freundii, Salmonella enterica subsp. arizonae e Salmonella enterica subsp. diarizonae, todas produziram atividade da β- galactosidase em cada temperatura entre 39°C e 45°C. Os resultados adicionalmente indicam que as cepas de teste de Salmonella bongori produziram atividade da β-galactosidase a uma temperatura menor que ou igual a 40°C, mas não produziram atividade da β-galactosidase a temperaturas acima de 40°C.

EXEMPLO 3. O USO DE UM ARTIGO DE DETECÇÃO COM UM INDICADOR DIFERENCIAL PARA CONFIRMAR A PRESENÇA DE UM MICRO-ORGANISMO SALMONELLA.

[0115] Um artigo de detecção (disco) foi preparado conforme descrito no Exemplo 1 da publicação internacional PCT n° WO2012/092181; que está aqui incorporado na íntegra, a título de referência.

[0116] Os dispositivos de cultura de filme fino (feitos conforme descrito no Exemplo 1) que continham um suposto resultado positivo (Salmonella typhimurium ATCC 14028 e Salmonella bongori FSD 122 inoculadas em dispositivos de cultura e incubadas conforme descrito no Exemplo 2) foram abertos, e um disco foi rolado (para minimizar as bolhas de ar) em uma superfície de gel. As placas foram fechadas e incubadas a 42°C durante 4 horas. O disco foi analisado quanto a uma mudança de cor na área adjacente às colônias para confirmar se as colônias reagiram com o indicador (5-bromo-4-cloro-3-indolil-α-D-galactopiranosideo) presente no artigo de detecção. Uma alteração na cor da colônia de vermelho ou castanho para azul ou azul escuro indica a presença de um micro-organismo Salmonella nas colônias. Os resultados do teste são mostrados na Tabela 5.

[0117] A descrição completa de todas as patentes, pedidos depatente, publicações e materiais disponíveis na forma eletrônica citados na presente invenção, está aqui incorporada a título de referência. Em caso de inconsistência entre a descrição do presente pedido e a(s) descrição(ões) de qualquer documento aqui incorporado a título de referência, a descrição do presente pedido deve prevalecer. A descrição detalhada e os exemplos apresentados anteriormente foram fornecidos apenas por uma questão de clareza. Nenhuma limitação desnecessária deve ficar implícita a partir disso. A invenção não se limita aos detalhes exatos mostrados e descritos, visto que variações óbvias aos versados na técnica estarão incluídas na invenção definida pelas reivindicações.

[0118] Todos os cabeçalhos são para a comodidade do leitor e não devem ser usados para limitar o significado do texto que segue os cabeçalhos, a menos que esteja especificado.

[0119] Várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Essas e outras modalidades estão no escopo das reivindicações a seguir.

Claims

1. MÉTODO PARA DETECTAR MICRO-ORGANISMOSSALMONELLA, caracterizado pelo método compreender:fornecer,uma amostra a ser testada;um dispositivo de cultura;um meio nutritivo que facilita o crescimento de um microorganismo entérico Gram-negativo;um primeiro agente seletivo que inibe o crescimento de micro-organismos Gram-positivos;um primeiro sistema indicador diferencial que compreende um primeiro composto indicador diferencial que pode ser convertido em um primeiro produto detectável por um membro de um grupo de micro-organismos Salmonella que inclui um micro-organismo da espécie Salmonella bongori; eum segundo sistema indicador diferencial que compreende um segundo composto indicador diferencial que pode ser convertido em um segundo produto detectável por uma atividade enzimática de β-galactosidase;colocar no dispositivo de cultura, o meio nutritivo, o primeiro agente seletivo, o primeiro sistema indicador diferencial e o segundo sistema indicador diferencial, em contato com uma amostra para formar um dispositivo de cultura inoculado;incubar o dispositivo de cultura inoculado durante um primeiro período de tempo a uma temperatura acima de 40°C;observar o dispositivo de cultura para detectar uma presença ou uma ausência do primeiro produto detectável; eobservar o dispositivo de cultura para detectar uma presença ou uma ausência do segundo produto detectável;em que observar a presença do primeiro produto detectável indica uma possível presença na amostra de um micro-organismo Salmonella;em que observar a presença do primeiro produto detectável justaposto ao segundo produto detectável indica uma presença na amostra de um micro-organismo diferente de um membro produtor de β- galactosidase da espécie Salmonella bongori.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo dispositivo de cultura ser fornecido como um dispositivo de cultura de filme fino com o meio nutritivo, o primeiro agente seletivo, o primeiro sistema indicador diferencial e o segundo sistema indicador diferencial dispostos ali em uma forma substancialmente desidratada.

3. MÉTODO, de acordo com uma qualquer uma dasreivindicações 1 a 2, caracterizado por observar que a ausência do primeiro produto detectável indica uma ausência de um micro-organismo Salmonella na amostra.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 3, caracterizado pelo primeiro composto indicador diferencial compreender um substrato enzimático, em que o substrato enzimático compreende um substrato enzimático para detectar a atividade enzimática da caprilato esterase ou para detectar a atividade enzimática da α- galactosidase.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 4, caracterizado pelo primeiro sistema indicador diferencial compreender um indicador de pH e pelo menos um carboidrato selecionado a partir do grupo que consiste em melibiose, 2-desoxi-D-ribose, manitol, L- arabinose, dulcitol, maltose, L-ramnose, trealose, D-xilose e sorbitol.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 5, caracterizado pelo primeiro produto detectável ser substancialmente solúvel em água e o segundo produto detectável ser substancialmente insolúvel em água ou, alternativamente, em que o primeiro produto detectável ser substancialmente insolúvel em água e o segundo produto detectável ser substancialmente solúvel em água.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 6, caracterizado pelo dispositivo de cultura compreender adicionalmente pelo menos um segundo agente seletivo, em que o pelo menos um segundo agente seletivo inibe o crescimento de pelo menos um micro-organismo entérico Gram- negativo que não é um membro do gênero Salmonella.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 7, caracterizado por incubar o dispositivo de cultura compreende incubar o dispositivo de cultura a uma temperatura entre 41 e 44°C, inclusive.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, caracterizado por compreender adicionalmente:fornecer um artigo com um terceiro sistema indicador diferencial que compreende um terceiro composto indicador diferencial que pode ser convertido por um micro-organismo Salmonella em um terceiro produto detectável;colocar o artigo em contato com o dispositivo de cultura inoculado;incubar o dispositivo de cultura inoculado durante um segundo período de tempo; eobservar o dispositivo de cultura para detectar o terceiro produto detectável;em que observar o terceiro produto detectável justaposto ao primeiro produto detectável indica a presença de um micro-organismo Salmonella na amostra.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por compreender adicionalmente:fornecer um composto indicador não diferencial que pode ser convertido por um micro-organismo entérico em um quarto produto detectável; eobservar o dispositivo de cultura para detectar uma presença ou uma ausência do quarto produto detectável;em que colocar, no dispositivo de cultura, o meio nutritivo, o primeiro agente seletivo, o primeiro sistema indicador diferencial e o segundo sistema indicador diferencial em contato com uma amostra para formar um dispositivo de cultura inoculado, compreende adicionalmente colocar, no dispositivo de cultura, o meio nutritivo, o primeiro agente seletivo, o primeiro sistema indicador diferencial, o segundo sistema indicador diferencial e o composto indicador não diferencial em contato com a amostra para formar o dispositivo de cultura inoculado.