CN108374037B - 一种小肠结肠炎耶尔森氏菌的显色培养基及其应用 - Google Patents

一种小肠结肠炎耶尔森氏菌的显色培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种小肠结肠炎耶尔森氏菌的显色培养基及其应用，培养基中含有胰蛋白胨、酵母浸出粉、阿拉伯糖、山梨醇、去氧胆酸钠、丙酮酸钠、三号胆盐、氯化钠、五水合硫代硫酸钠、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、七水硫酸镁、中性红。该显色培养基可用于小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测试剂盒和快速检测板的制备。本发明中提供的显色培养基及快速检测试剂盒、快速检测板可实现不同样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测，操作简单，灵敏度高。

Description

一种小肠结肠炎耶尔森氏菌的显色培养基及其应用
技术领域
本发明属于微生物检测领域，涉及微生物显色培养基，还涉及用显色培养基制作的快速检测板和检测试剂盒。
背景技术
小肠结肠炎耶尔森氏菌是一种革兰氏阴性杆菌或球菌，广泛存在于自然界如湖泊、土壤和植被及家禽、家畜和其他动物中，并可通过多种途径传播，由小肠结肠炎耶尔森氏菌引起的临床症状主要表现为急性腹痛、腹泻、呕吐等肠胃现象及结节性红斑、关节炎、骨髓炎、肝炎败血症等并发症。
传统检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法包括增菌培养、理化鉴定、血清分析等一系列复杂过程，且这种方法适用于设备齐全的检测实验室中所用，存在检测周期长，实验准备材料时间长，不能满足食品安全检验市场大批量检验需求。随着技术的发展多种分子生物学方法也被应用到小肠结肠炎耶尔森氏菌快速检测中，比如通过检测相关基因来定性分析，或是胶体金免疫法，此类方法检测成本高，设备要求昂贵，并且对检测人员的操作有一定的技术要求，在食品原材料检验市场推广尚有较大难度。
CN105203766A中公开了一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌测试条，将免疫反应的特异性、层析方法的快速性及彩色乳胶颗粒作为示踪物的直观性等优点结合在一起，有效解决了现有技术检测方法费时、繁琐、特异性差的问题。但是测试条的制备方法比较复杂，包括制备纯化单克隆抗体、制备活化乳胶颗粒、制备标记物、包被硝酸纤维膜、测试条组装等步骤，成本较高，对制作人员有一定的技术要求，不利于测试条的大规模推广应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小肠结肠炎耶尔森氏菌的显色培养基及其快速检测板和检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种小肠结肠炎耶尔森氏菌的显色培养基，每1L培养基中含有胰蛋白胨5～20g、酵母浸出粉1～8g、阿拉伯糖1～10g、山梨醇0.5～5g、去氧胆酸钠5～20g、丙酮酸钠0.5～3g、三号胆盐2～12g、氯化钠1～10g、五水合硫代硫酸钠1～8g、精氨酸1～10g、赖氨酸1～10g、鸟氨酸1～10g、七水硫酸镁0.01～0.05g、中性红0.01～0.05g，显色培养基的pH值为6.8～7.6。
进一步地，每1L培养基中含有胰蛋白胨5～20g、酵母浸出粉5～8g、阿拉伯糖5～10g、山梨醇3～5g、去氧胆酸钠5～10g、丙酮酸钠1～3g、三号胆盐2～8g、氯化钠1～5g、五水合硫代硫酸钠2～5g、精氨酸1～5g、赖氨酸1～5g、鸟氨酸1～5g、七水硫酸镁0.01～0.05g、中性红0.02～0.05g，显色培养基的pH值为6.8～7.6。
一种小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测试剂盒，含有选择性增菌液和本发明中所述的显色培养基。
进一步地，每1L选择性增菌液中含有胰蛋白胨1～12g、乳糖5～20g、草酸钠1～5g、山梨醇0.5～5g、丙酮酸钠1～5g、氯化钠1～10g、脱氧胆酸钠1-5g、抗生素0.15～0.5g，选择性增菌液pH值为6.8～7.6。
进一步地，每1L选择性增菌液中含有胰蛋白胨6～12g、乳糖15～20g、草酸钠3～5g、山梨醇3～5g、丙酮酸钠1～4g、氯化钠4～6g、脱氧胆酸钠3～5g、抗生素0.15～0.2g，选择性增菌液pH值为6.8～7.6。
进一步地，抗生素包含头孢磺啶钠、头孢他啶、头孢唑肟、头孢哌酮钠、头孢曲松钠、新生霉素和两性霉素。
一种小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测板，其结构由下到上依次为：凹槽板、吸水凝胶层、培养基层和封膜，培养基层由吸附有本发明中所述的显色培养基的滤纸构成。
进一步地，吸水凝胶层中含有卡拉胶、琼脂粉、瓜尔胶、聚丙烯酸树脂、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠中的任意一种或几种。
本发明的有益效果是：本发明使用小肠结肠炎耶尔森氏菌显色培养基制作的快速检测卡和检测试剂盒，制作方法简单、灵敏度高、结果准确、成本低，检测方法也简单易操作，可以实现不同样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速定性检测，也可实现定性分析，检测试剂盒含有选择性增菌液，通过增菌液培养，可有效抑制待测样品中的杂菌生长，进一步提高检测结果的准确性。
附图说明
图1为加标鱼肉样品的检测结果；
图2为不加标鱼肉样品的检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但并不局限于此。
检测板的结构由下到上依次为：凹槽板、吸水凝胶层、培养基层和封膜，培养基层由吸附有显色培养基的滤纸构成。
检测板的制作步骤如下：
1)将吸水凝胶粉末，包含但不限于卡拉胶、琼脂粉、瓜尔胶、聚丙烯酸树脂、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠中的任意一种或几种以5～15％(W/V)溶解于水，添加0.4～0.8％助溶剂，置于沸水中加热30～50min，冷却备用；
2)取4～8g吸水凝胶平铺于凹槽板底，干燥处理后置于干燥环境中保存备用；
3)显色培养基浸润滤纸，冷藏2h；
4)将显色培养基浸润滤纸放置于平铺有吸水凝胶的凹槽板中，干燥处理后使用塑料封膜封贴凹槽板，Co 60辐照消毒后冷藏保存。
选择性增菌液配方：
增菌液1：每1L中含有：胰蛋白胨1g、乳糖5g、草酸钠1g、山梨醇0.5g、丙酮酸钠1g、氯化钠1g、脱氧胆酸钠1g、抗生素0.15g，选择性增菌液pH值为6.8；
增菌液2：每1L中含有：胰蛋白胨12g、乳糖20g、草酸钠5g、山梨醇5g、丙酮酸钠5g、氯化钠10g、脱氧胆酸钠5g、抗生素0.5g，选择性增菌液pH值为7.0；
增菌液3：每1L中含有：胰蛋白胨6g、乳糖15g、草酸钠3g、山梨醇3g、丙酮酸钠3g、氯化钠4g、脱氧胆酸钠3g、抗生素0.17g，选择性增菌液pH值为7.6；
增菌液4：每1L中含有：胰蛋白胨12g、乳糖20g、草酸钠5g、山梨醇5g、丙酮酸钠4g、氯化钠6g、脱氧胆酸钠5g、抗生素0.2g，选择性增菌液pH值为7.3。
实施例1
一种小肠结肠炎耶尔森氏菌的显色培养基，1L显色培养基中含有胰蛋白胨5g、酵母浸出粉1g、阿拉伯糖1g、山梨醇0.5g、去氧胆酸钠5g、丙酮酸钠0.5g、三号胆盐2g、氯化钠1g、五水合硫代硫酸钠1g、精氨酸1g、赖氨酸1g、鸟氨酸1g、七水硫酸镁0.01g、中性红0.01g，显色培养基的pH值为6.8。
将上述中性红以外的成分溶于水，加热溶解冷却后加入中性红水溶液然后定容至1L即可。
实施例2
一种小肠结肠炎耶尔森氏菌的显色培养基，1L显色培养基中含有胰蛋白胨20g、酵母浸出粉8g、阿拉伯糖10g、山梨醇5g、去氧胆酸钠20g、丙酮酸钠3g、三号胆盐12g、氯化钠10g、五水合硫代硫酸钠8g、精氨酸10g、赖氨酸10g、鸟氨酸10g、七水硫酸镁0.05g、中性红0.05g，显色培养基的pH值为7.0。
将上述中性红以外的成分溶于水，加热溶解冷却后加入中性红水溶液然后定容至1L即可。
实施例3
一种小肠结肠炎耶尔森氏菌的显色培养基，1L显色培养基中含有胰蛋白胨5g、酵母浸出粉5g、阿拉伯糖5g、山梨醇3g、去氧胆酸钠5g、丙酮酸钠1g、三号胆盐2g、氯化钠1g、五水合硫代硫酸钠2g、精氨酸1g、赖氨酸1g、鸟氨酸1g、七水硫酸镁0.01g、中性红0.02g，显色培养基的pH值为7.5。
将上述中性红以外的成分溶于水，加热溶解冷却后加入中性红水溶液然后定容至1L即可。
实施例4
一种小肠结肠炎耶尔森氏菌的显色培养基，1L显色培养基中含有胰蛋白胨20g、酵母浸出粉8g、阿拉伯糖10g、山梨醇5g、去氧胆酸钠10g、丙酮酸钠3g、三号胆盐8g、氯化钠5g、五水合硫代硫酸钠5g、精氨酸5g、赖氨酸5g、鸟氨酸5g、七水硫酸镁0.05g、中性红0.05g，显色培养基的pH值为7.6。
将上述中性红以外的成分溶于水，加热溶解冷却后加入中性红水溶液然后定容至1L即可。
实施例5
一种小肠结肠炎耶尔森氏菌的显色培养基，1L显色培养基中含有胰蛋白胨15g、酵母浸出粉7g、阿拉伯糖7g、山梨醇4g、去氧胆酸钠8g、丙酮酸钠2.5g、三号胆盐6g、氯化钠4g、五水合硫代硫酸钠4g、精氨酸3g、赖氨酸3g、鸟氨酸3g、七水硫酸镁0.04g、中性红0.04g，显色培养基的pH值为7.2。
将上述中性红以外的成分溶于水，加热溶解冷却后加入中性红水溶液然后定容至1L即可。
实施例6
小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测板，凹槽板材料为PET塑料，吸水凝胶层由瓜尔胶组成，培养基层中的滤纸材料为天然纤维素，其均匀吸附有实施例1配制的显色培养基，封膜材料为聚苯乙烯。
实施例7
小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测板，凹槽板材料为PET塑料，吸水凝胶层由卡拉胶、琼脂粉组成，培养基层中的滤纸材料为全合成材料，其均匀吸附有实施例2配制的显色培养基，封膜材料为聚丙烯。
实施例8
小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测板，凹槽板材料为PET塑料，吸水凝胶层由聚丙烯酸树脂、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠组成，培养基层中的滤纸材料为天然纤维素，其均匀吸附有实施例3配制的显色培养基，封膜材料为聚丙烯。
实施例9
小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测板，凹槽板材料为PET塑料，吸水凝胶层由琼脂粉组成，培养基的滤纸材料为天然纤维素，其均匀吸附有实施例4配制的显色培养基，封膜材料为聚乙烯。
实施例10
小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测板，凹槽板材料为PET塑料，吸水凝胶层由海藻酸钠组成，培养基层中的滤纸材料为天然纤维素，其均匀吸附有实施例5配制的显色培养基，封膜材料为聚乙烯。
实施例11
小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测试剂盒，含有选择性增菌液1和实施例1中的显色培养基。
实施例12
小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测试剂盒，含有选择性增菌液2和实施例2中的显色培养基。
实施例13
小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测试剂盒，含有选择性增菌液3和实施例3中的显色培养基。
选择性增菌液增菌效果
称取25g自然冻融后的鸡胸脯肉8份，分别放入225mL增菌液1中得到8组样品，样品1为空白对照组，样品2～8分别接种不同的菌株，接种的菌株种类及接种菌浓度见表1，实验设置3次重复。
将待测样品在26℃低速振荡培养48h，并于24h及48h对待测样品PCA计数检测，结果如表1(表中计数数值为平均值)：
Figure BDA0001659879830000051
Figure BDA0001659879830000061
由表1可知，选择性增菌液对目标菌株有良好的筛选作用。
增菌液与检测板特异性实验
将大肠杆菌O157NCTC12900，金黄葡萄球菌ATCC6538，表皮葡萄球菌CMCC(B)26069，普通变形杆菌CMCC(B)49027，痢疾志贺氏菌CMCC(B)51105，肠炎沙门氏菌CMCC(B)50335，蜡样芽孢杆菌CMCC(B)63303作为实验检测菌。
取100mL选择性增菌液2共9份，编号1～9，1号增菌液为空白对照组，2～8号增菌液分别接种实验检测菌，接种菌种类见表2，9号增菌液为阳性对照组，接种小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC(B)52204，接种菌浓度控制在10-100CFU/mL。
26℃低速振荡培养24h，碱处理，然后稀释104、105、106倍，取1mL稀释液加到实施例7中的检测板中，待其均匀吸收后，倒置放于30℃培养箱中培养48h。实验设置3组重复。结果如表2，“+”表示阳性结果，出现红色菌点，“－”表示阴性结果，未出现红色菌点。
Figure BDA0001659879830000062
由表2可知，非目标菌通过增菌液增菌后，在检测板上培养未生长，而目标菌则正常生长，表明增菌液与检测板特异性良好。
自然样品加标目标菌检测结果
取225mL选择性增菌液3共5份，编号1～5。1号为空白对照，2号和3号各加入自然冻融后的鱼肉25g，4号和5号各加入自然冻融后的鸡胸脯肉25g，3号和5号接种小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC(B)52204，接种菌浓度控制在10-100CFU/mL。
26℃低速振荡培养24h，碱处理，然后稀释104、105、106倍，取稀释液1mL加到实施例8中的检测板中，待其均匀吸收后，倒置放于30℃培养箱中培养48h。PCA计数检测结果如表3、图1、图2所示。“－”表示阴性结果，未出现红色菌点。
Figure BDA0001659879830000071
自然样品及加标样品的实验结果表明，检测结果有良好的定量分析效果。
自然样品加标多种菌株检测
取225mL增菌液2共4份，编号1～4，1号和2号中分别加入25g自然冻融后的猪瘦肉，3号和4号中分别加入25g自然冻融后的牛瘦肉，1号和3号样品中接种小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC(B)52204、大肠杆菌O157NCTC12900、金黄葡萄球菌ATCC6538、蜡样芽孢杆菌CMCC(B)63303和肠炎沙门氏菌CMCC(B)50335，接种菌浓度控制在10-100CFU/mL，2号和4号为空白对照，不接种菌株。样品与菌液混合均匀后立即取样加到相应菌株检测平皿中，平皿类型见表4中的检测装置1～5，每个平皿中加样1mL，待其均匀吸收后，倒置放于30℃培养箱中培养48h。剩余样品置于26℃低速振荡培养48h，碱处理，取样1mL加到实施例6中的检测板中，待其均匀吸收后，倒置放于30℃培养箱中培养48h。结果如表4。“+”表示阳性结果，出现红色菌点，“-”表示阴性结果，未出现红色菌点：
Figure BDA0001659879830000072
Figure BDA0001659879830000081
由表4可知，在实际样品中即使存在其他类型菌株，亦能筛选出目标菌。
检测板与国标法检测平皿检测结果对比：
取225mL增菌液1共7份，编号1～7，1号为空白对照，2～7号中分别加入25g各待测样品，具体见表5，1～7号接种小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC(B)52204，接种菌浓度控制在10-100CFU/mL。
26℃低速振荡培养24h，碱处理，稀释103～105倍，取样1mL加到实施例9中的检测板与国标法检测平皿(CIN-1培养基平皿)中，检测板在30℃培养箱中培养24h，CIN-1培养基平皿置于26℃培养箱培养24～48h，然后检测菌落浓度，最后计算得出检测板的符合率。结果如表5：
Figure BDA0001659879830000082
检测板与国标法的平均符合率达到99.8％，具有较好的应用表现。
检测试剂盒与其他同类检测方法时间比较
取小肠结肠炎耶尔森氏菌稀释菌液(活菌数量在1-100CFU/ml)1ml，分别接种到增菌液中，于26℃低速振荡增菌培养，分别在8h、16h、24h取样加到检测平皿内，于30℃培养24h，观察各培养基的菌落状态。四个试验使用的增菌液和培养基如下：
试验1:
增菌液：增菌液3；检测平皿：实施例9中的检测平皿；
试验2
增菌液：改良磷酸盐缓冲液；检测平皿：含有CIN-1培养基的检测平皿；
试验3
增菌液：改良磷酸盐缓冲液；检测平皿：含有改良Y培养基的检测平皿；
试验4
增菌液：氯苯酚替卡西林氯酸钾增菌液；检测平皿：含有SSDC琼脂的检测平皿；
Figure BDA0001659879830000091
注：+表示阳性可检出，-表示未检出，-+表示部分检出。
通过4种培养方式对比，可知本法可检出所需时间最快，仅需26～32h即可观察结果。

Claims (4)

1.一种小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测试剂盒，含有选择性增菌液和显色培养基；
其中：
每1 L显色培养基中含有胰蛋白胨5～20 g、酵母浸出粉1～8 g、阿拉伯糖1～10 g、山梨醇 0.5～5 g、去氧胆酸钠5～20 g、丙酮酸钠0.5～3 g、三号胆盐2～12 g、氯化钠1～10g、五水合硫代硫酸钠1～8 g、精氨酸1～10 g、赖氨酸1～10 g、鸟氨酸1～10 g、七水硫酸镁0.01～0.05 g、中性红0.01～0.05 g，显色培养基的pH值为6.8～7.6；
每1 L选择性增菌液中含有胰蛋白胨1～12 g、乳糖5～20 g、草酸钠1～5 g、山梨醇0.5～5 g、丙酮酸钠1～5 g、氯化钠1～10 g、脱氧胆酸钠1～5 g、抗生素0.15～0.5 g，选择性增菌液pH值为6.8～7.6。
2.根据权利要求1所述的快速检测试剂盒，其特征在于，每1 L显色培养基中含有胰蛋白胨5～20 g、酵母浸出粉5～8 g、阿拉伯糖5～10 g、山梨醇3～5g、去氧胆酸钠5～10 g、丙酮酸钠1～3 g、三号胆盐2～8 g、氯化钠1～5 g、五水合硫代硫酸钠2～5 g、精氨酸1～5 g、赖氨酸1～5 g、鸟氨酸1～5 g、七水硫酸镁0.01～0.05 g、中性红0.02～0.05 g，显色培养基的pH值为6.8～7.6。
3.根据权利要求1所述的快速检测试剂盒，其特征在于，每1 L选择性增菌液中含有胰蛋白胨6～12 g、乳糖15～20 g、草酸钠3～5 g、山梨醇3～5g、丙酮酸钠1～4 g、氯化钠4～6g、脱氧胆酸钠3～5 g、抗生素0.15～0.2 g，选择性增菌液pH值为6.8～7.6。
4.根据权利要求1～3任一项所述的快速检测试剂盒，其特征在于，抗生素包含头孢磺啶钠、头孢他啶、头孢唑肟、头孢哌酮钠、头孢曲松钠、新生霉素和两性霉素。
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