CN103343157A - 一种用于检测血液病原菌的细菌培养液 - Google Patents

Abstract

本发明公开的一种用于检测血液病原菌的细菌培养液，包括细菌生长所需的营养物质、抗凝血剂和拮抗抗生素试剂，三种成份的质量浓度比为35～52∶1～10∶5～20，该培养液与传统的血液增菌肉汤、手工双向需氧血培养瓶等血液微生物培养工具中的培养基相比，细菌繁殖快，从而缩短血液检测时间；另外，细菌代谢产物可以通过和培养液中碳酸氢盐反应转变成能被仪器识别的化学讯号，使血液检测准确度高，因此在血液临床检验领域拥有广泛的应用前景。

Description

一种用于检测血液病原菌的细菌培养液

技术领域

本发明属于血液检测技术领域，具体是一种用于检测血液病原菌的细菌培养液。 

背景技术

全自动需氧血培养瓶是一种应用于医学临床检验领域的新型微生物培养系统，是与全自动血培养仪配套使用的新一代微生物检测试剂。它由瓶体、固体传感器和培养液等三部分组成，与全自动血培养仪器结合使用即可快速检测血液或其他标本中是否感染细菌、真菌及分枝杆菌，从而为临床迅速有效地进行抗感染治疗提供诊断依据。全自动血培养系统最早在上个世纪九十年代由美国BD公司，法国梅里埃公司等开始研发，目前已经批量生产和销售，对中国处于技术保密状态，国外进口产品价格昂贵，给我国的医疗机构及患者带来沉重的经济负担。目前我国国内只有上海奥普生物技术公司等少数生物企业从事此项研究，尚未形成产业化。研制质量优良，价格便宜的自动培养瓶，打破国际垄断，不仅具有良好的经济效益，并且能够降低患者负担，减少医疗费用，具有广泛的社会效益。 

现在培养瓶中最重要的部分之一的培养液多数是增菌肉汤，它的检测原理是提供细菌生长的必要营养物质，使致病的细菌快速生长，从而代谢的产物通过和化学试剂反应释放出能够被仪器识别的物理和化学信号，来检测出血液致病的病原体，随着检测仪器的迅速发展，其精度及灵敏度也显著的提高，而且抗生素类的药物的发展及普遍使用，从而使培养液也必须发生相适应的变化，现在培养液的要求是使细菌繁殖的更快，还要拮抗中和血液内抗生素，从而确保检测高效、省时、准确度高。 

发明内容

在检测血液病原菌技术中，为了解决需氧型细菌在血液中的生长速度不够快，导致检测时间长的技术缺陷，本发明公开了一种用于检测血液病 原菌的细菌培养液，实现显著提高细菌繁殖的速度，且能够拮抗中和血液中的抗生素，从而使细菌生长的速度快，缩短血液的检测时间目的；另外，细菌代谢产物可以通过和培养液中碳酸氢盐反应转变成能被仪器识别的化学讯号，使血液检测准确度高，因此在血液临床检验领域拥有广泛的应用前景。 

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为，该培养液包括细菌生长所需的营养物质、抗凝血剂与拮抗抗生素试剂，三种成份的质量浓度比为35～52∶1～10∶5～20。 

所述细菌生长所需的营养物质可以由蛋白胨、胰胨、牛肉膏粉、心脑浸粉、葡萄糖中的一种或多种混合物与维生素和碳酸氢盐组成，其质量浓度比为15～26∶0.01～0.10∶0.30～0.75； 

所述维生素可以由维生素A、维生素D、维生素E、B族维生素、维生素C中的一种或多种混合维生素组成； 

所述碳酸氢盐由碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、碳酸氢铵中的一种或多种组成；抗凝血剂可以为肝素、乙二胺四乙酸盐、枸椽酸钠其中的任意的一种；能够与血液中抗生素发生拮抗中和作用的试剂可以是聚茴香脑磺酸、对氨基苯甲酸、硫酸镁、吸附抗生素复合树脂中的一种或多种混合试剂；除此之外，在制备培养液时还需加入盐或酸液、碱液之类用以提供适合细菌生长的PH环境。 

以上所述的细菌类型为需氧型细菌。 

如上述配方选择带有葡萄糖作为细菌生长的营养物质，则在制备培养液中应注意，除成份中的葡萄糖、吸附抗生素复合树脂和碳酸氢盐外，全部称量混合，加热溶解，溶解后需将溶液进行常温冷却，待稍冷却时加入葡萄糖和无菌蒸馏水；再将培养液高压蒸气灭菌，同时冷却至室温；将碳酸氢盐称量溶于无菌蒸馏水中，单独盛于不能漏气且可以高压灭菌的溶器内，高压蒸气灭菌，冷却至室温；在无菌操作台中将两者混合，用盐、酸液或碱液调节PH值至7.2-7.3后，将培养液分装于血培养瓶内用灭菌锅进行灭菌，冷却至室温，调节瓶内气压至规定范围，封口，批检、质控后 培养液即可使用。 

本发明的有益效果是，本发明培养液中所用到的成份，蛋白胨和胰胨：主要作为细菌生长的氮源、也可为碳源，它特点为易溶于水，又是双性化合物，具有一定的缓冲作用；牛肉膏粉：主要作为细菌生长的氮源、也可为碳源，它含有多种能刺激细菌生长的物质如：肌酸、黄嘌呤、尿酸、腺苷酸、次黄嘌呤、核苷酸、脲、谷氨酰胺、β-丙氨酸、肝糖、磷酸己糖、乳酸、琥珀酸、无机盐；心脑浸粉：细菌提供生长所需的营养。氯化钠：提供无机盐；葡萄糖：细菌生长碳源主要供应者；维生素B6：提供细菌生长的生长因子；聚茴香脑磺酸：抑制血液中不利于细菌生长的物质，如抗生素一类的，同时具有抗凝作用；对氨基苯甲酸：能中和血液中磺胺类药物的抑菌作用；硫酸镁：能破坏血液中存在的四环素、金霉素、土霉素、多粘菌素及链霉素的抑菌作用；吸附抗生素的复合树脂：能吸附多种抗生素，特别是β-内酰类抗生素；枸椽酸钠：主要防止血液凝血凝固；碳酸氢钠：能把细菌生长过程中代谢产物转变成能被仪器和血培养瓶底所识别的化学讯号、缓冲溶液中红细胞存活能利用葡萄糖所产生的酸、提供细胞生长必要二氧化碳气体。 

综上各成份的作用，在检测血液中致病的病原体时，利用本发明的需氧型细菌的培养液可以加速细菌的生长，从而缩短检测时间，使用方便。 

具体实施方式

以下结合具体实施方式进一步说明本发明的内容。 

实施例一：本发明的用于检测血液病原菌的细菌培养液，其成份包括细菌生长所需的营养物质、抗凝血剂与拮抗抗生素试剂，三种成份的质量浓度比为35∶1∶5。 

所述细菌生长所需的营养物质包括蛋白胨、胰胨、牛肉膏粉、葡萄糖中的一种或多种混合物、维生素和碳酸氢盐，其质量浓度比为15∶0.10∶0.30。 

所述维生素由维生素A、维生素D、维生素E、B族维生素、维生素E中的一种或多种混合维生素组成。维生素可以由一种或多种任意比例混合组成，只要保证培养液中含有维生素即可。 

所述碳酸氢盐由碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、碳酸氢铵中的一种或多种组成。选用的碳酸氢盐任意一种或任意比例混合即可，不会影响培养液的作用。 

所述抗凝血剂为肝素、乙二胺四乙酸盐、枸椽酸钠中的一种。 

所述拮抗抗生素试剂为聚茴香脑磺酸、对氨基苯甲酸、硫酸镁、吸附抗生素复合树脂中的一种或多种混合试剂，可选用一种拮抗抗生素，也可使用多种按任意比例混合，只要培养液中存在拮抗抗生素的作用即可。 

该培养液是对需氧型细菌培养的。 

该培养液的制备方法是，除成份中葡萄糖、混合树脂和碳酸氢钠，其余所有成份装入玻璃容器中，用无菌蒸馏水50m1加热溶解，完全溶解后，需将溶液进行常温冷却，稍冷却后加入葡萄糖和无菌蒸馏水，加入的无菌蒸馏水至900毫升；再将培养液高压蒸气灭菌15min后，冷却至室温；将称量好的碳酸氢盐溶于装在烧杯中的无菌蒸馏水，单独盛于密闭且可以高压灭菌的容器内，高压蒸气灭菌15min，冷却至室温；在无菌操作台将两者混合于玻璃容器中，用盐酸或氢氧化钠调节PH值至7.2-7.3后，另加入吸附抗生素的混合树脂，将培养液定容至1000m1，将培养液分装于血培养瓶内用灭菌锅进行灭菌，冷却至室温，调节瓶内气压至规定范围，封口，批检、质控后培养液即可使用，上述各成份用的量按照成份所公开的量为准。 

上述各个成份的作用：蛋白胨和胰胨：主要作为细菌生长的氮源、也可为碳源，它特点为易溶于水，又是双性化合物，具有一定的缓冲作用；牛肉膏粉：主要作为细菌生长的氮源、也可为碳源，它含有多种能刺激细菌生长的物质如：肌酸、黄嘌呤、尿酸、腺苷酸、次黄嘌呤、核苷酸、脲、谷氨酰胺、β-丙氨酸、肝糖、磷酸己糖、乳酸、琥珀酸、无机盐；心脑浸粉：细菌提供生长所需的营养。氯化钠：提供无机盐；葡萄糖：细菌生 长碳源主要供应者；维生素B6：提供细菌生长的生长因子；聚茴香脑磺酸：抑制血液中不利于细菌生长的物质，如抗生素一类的，同时具有抗凝作用；对氨基苯甲酸：能中和血液中磺胺类药物的抑菌作用；硫酸镁：能破坏血液中存在的四环素、金霉素、土霉素、多粘菌素及链霉素的抑菌作用；吸附抗生素的复合树脂：能吸附多种抗生素，特别是β-内酰类抗生素；枸椽酸钠：主要防止血液凝血凝固；碳酸氢钠：能把细菌生长过程中代谢产物转变成能被仪器和血培养瓶底所识别的化学讯号、缓冲溶液中红细胞存活能利用葡萄糖所产生的酸、提供细胞生长必要二氧化碳气体。 

利用该培养液检测血液中致病细菌的原理：培养液提供血液中致病细菌生长所需的营养物质，为了能够使血液始终呈液体状态需加入抗凝血剂防止血液凝固，另外，为了使细菌生长迅速，还需加入拮抗抗生素试剂来避免血液中抗生素的干扰。细菌在本培养液中生长，它有各种各样代谢产物，例如：葡萄糖被细菌利用后，能产生丙酮酸、乙酰甲基甲醇、琥珀酸、乳酸、(甲、乙、丙、丁)酸、乙醇、乙酸以及完全分解成二氧化碳和H2蛋白质的代谢产物主要有：氨、CO₂和各种有机酸、胺类等。这些代谢产物均能使培养液中的PH发生变化，代谢产物与碳酸氢钠发生如下化学反应： 

每一血液培养瓶底部都含有Novel颜色感应器，当血液培养瓶内有微生物生长代谢释放出CO₂或H⁺后，使培养液中的PH发生变化，同时瓶底部含有Novel颜色感应器之酸碱值也跟着改变，颜色也随之变化，颜色的变化讯号传送至血培养仪中，从而达到检测的目的。 

实施例二：本发明的用于检测血液病原菌的细菌培养液，其成份包括细菌生长所需的营养物质、抗凝血剂与拮抗抗生素试剂，三种成份的质量浓度比为52∶10∶20。 

所述细菌生长所需的营养物质包括蛋白胨、胰胨、牛肉膏粉、葡萄糖中的一种或多种混合物、维生素和碳酸氢盐，其质量浓度比为26∶0.01∶0.75。 

所述维生素由维生素A、维生素D、维生素E、B族维生素、维生素E中的一种或多种混合维生素组成。维生素可以由一种或多种任意比例混合组成，只要保证培养液中含有维生素即可。 

所述碳酸氢盐由碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、碳酸氢铵中的一种或多种组成。选用的碳酸氢盐任意一种或任意比例混合即可，不会影响培养液的作用。 

所述抗凝血剂为肝素、乙二胺四乙酸盐、枸椽酸钠中的一种。 

所述拮抗抗生素试剂为聚茴香脑磺酸、对氨基苯甲酸、硫酸镁、吸附抗生素复合树脂中的一种或多种混合试剂，可选用一种拮抗抗生素，也可使用多种按任意比例混合，只要培养液中存在拮抗抗生素的作用即可。 

以上所述的细菌类型为需氧型细菌。 

制备方法同实施例一。 

实施例三：本发明的用于检测血液病原菌的细菌培养液，其成份包括细菌生长所需的营养物质、抗凝血剂与拮抗抗生素试剂，三种成份的质量浓度比为40∶5∶10。 

所述细菌生长所需的营养物质包括蛋白胨、胰胨、牛肉膏粉、葡萄糖中的一种或多种混合物、维生素和碳酸氢盐，其质量浓度比为18∶0.06∶0.52。 

所述维生素由维生素A、维生素D、维生素E、B族维生素、维生素E中的一种或多种混合维生素组成。维生素可以由一种或多种任意比例混合组成，只要保证培养液中含有维生素即可。 

所述碳酸氢盐由碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、碳酸氢铵中的一种或多种组成。选用的碳酸氢盐任意一种或任意比例混合即可，不会影响培养液的作用。 

所述抗凝血剂为肝素、乙二胺四乙酸盐、枸椽酸钠中的一种。 

所述拮抗抗生素试剂为聚茴香脑磺酸、对氨基苯甲酸、硫酸镁、吸附抗生素复合树脂中的一种或多种混合试剂，可选用一种拮抗抗生素，也可使用多种按任意比例混合，只要培养液中存在拮抗抗生素的作用即可。 

以上所述的细菌类型为需氧型细菌。 

以下通过检测血液中需氧型细菌在培养液中的生长来进一步说明本发明的有益效果， 

试验内容：将所选菌株(由脑膜炎奈瑟球菌ATCC13090白色假丝酵母ATCC18804流感嗜血杆菌ATCC19418金黄色葡萄球菌ATCC25923肺炎链球菌ATCC6305化链球菌ATCC19615铜绿假单胞菌ATCC27853大肠ATCC25922粪产碱菌ATCC8750)冻干粉末加营养肉汤孵育复苏，接种血平板，白色念珠接于沙保弱平板，挑取单个菌落传代。以无菌生理盐水配置0.5麦氏单位菌悬液(细菌相当于1.5×108CFU/ml、白色念菌相当于1×106CFU/m1，并稀释至100CFU/m1(高)，10CFU/ml(中)和1CFU/ml(低)个浓度，将上述菌种置入装有本发明培养液的培养瓶中1m1，另对照瓶选用法国梅里埃公司生产—BacT/ALERT需氧瓶自血培养瓶中加入1ml，然后无菌抽取健康人群血4～9m1(各浓度均做6个瓶子)其中0小时、12小时、24小时分别放入BACT/ALERT3D240加速血液培养仪各2瓶，延时12小时和24小时是放置在室温情况下仪器读数影响情况。报阳取出并记录时间，阴性直至5天，生长时间取平均值。现有的培养液大多只能检测偏酸的细菌报阳，而本发明也能检测出偏碱的细菌报阳，如上述选择的菌株。 

结果见下表：0小时 

室温放置12小时、24小时后放入血培养仪检出阳性率不受影响，.报阳时间当时未作记录.因主观察延时放入仪器有否影响检测结果 

结果见下：12小时、24小时 

Claims (7)

1.一种用于检测血液病原菌的细菌培养液，其特征在于，该培养液包括细菌生长所需的营养物质、抗凝血剂与拮抗抗生素试剂，三种成份的质量浓度比为35～52∶1～10∶5～20。

2.根据权利要求1所述的用于检测血液病原菌的细菌培养液，其特征在于，所述细菌生长所需的营养物质包括蛋白胨、胰胨、牛肉膏粉、葡萄糖中的一种或多种混合物、维生素和碳酸氢盐，其质量浓度比为15～26∶0.01～0.10∶0.30～0.75。

3.根据权利要求2所述的用于检测血液病原菌的细菌培养液，其特征在于，所述维生素由维生素A、维生素D、维生素E、B族维生素、维生素E中的一种或多种混合维生素组成。

4.根据权利要求2所述的用于检测血液病原菌的细菌培养液，其特征在于，所述碳酸氢盐由碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、碳酸氢铵中的一种或多种组成。

5.根据权利要求1所述的用于检测血液病原菌的细菌培养液，其特征在于，所述抗凝血剂为肝素、乙二胺四乙酸盐、枸椽酸钠中的一种。

6.根据权利要求1所述的用于检测血液病原菌的细菌培养液，其特征在于，所述拮抗抗生素试剂为聚茴香脑磺酸、对氨基苯甲酸、硫酸镁、吸附抗生素复合树脂中的一种或多种混合试剂。

7.根据权利要求1所述的用于检测血液病原菌的细菌培养液，其特征在于，所述细菌的类型为需氧型细菌。