CN101270383A - 一种番茄酱主要腐败微生物的检验方法 - Google Patents

Abstract

公开了一种番茄酱中主要腐败微生物的检验方法。针对国内外没有报道检测番茄酱中主要腐败微生物的方法。通过对采用前增菌培养，按重量体积百分比计，取番茄酱8％～12％，加入200mL～250mL生理盐水，混合均匀制成混悬液，将8％～12％混悬培养液分别接种于平酸菌增菌培养液或嗜热耐酸杆菌琼脂培养液和胰大豆胨肉汤培养液或改良BCP培养液中，在35℃～37℃中培养24－48h，分离培养和前增菌相同的培养液，经过系列生化试验，鉴定确定番茄酱中主要存在芽孢菌、葡萄球菌为主要腐败微生物。对促进番茄酱产业的快速发展，维护国际市场中番茄酱贸易的优势地位，均具有重要意义。

Description

一种番茄酱主要腐败微生物的检验方法

发明领域

本发明涉及食品检验技术领域。具体的说，本发明涉及一种番茄酱中主要腐败微生物的检验方法领域。

背景技术

当前进出口番茄酱中微生物检测的项目主要是霉菌，其检验方法是采用标准GB/T4789.15-2003，对其它微生物项目的检测很少涉及。随着国际贸易的日益发展，对商品检测技术的要求越来越高，很多国家和地区要求增加番茄酱中主要腐败微生物的检测，而目前相关的研究工作在中国仍是一片空白。

番茄酱属酸性罐头食品(pH4.5以下)，在其中存活的微生物多为耐酸、抗热性极强的杆菌、球菌等，它们的存在常常会导致罐头食品的腐败。国外有文献报道，尼日利亚乳酸菌是番茄酱中的优势微生物，但是近年报道，世界各地番茄酱中的优势微生物并不是尼日利亚乳酸菌，其缺乏相应科学数据支持。而经过大量试验研究表明，经新疆进出口的番茄酱其微生物的种群构成与国外报道不相同。番茄酱中的微生物种类很丰富，近6年对新疆进出口番茄酱中微生物研究中分离出的芽孢杆菌占50％，葡萄球菌占25％，其它杆菌占15％，酵母菌占3％，乳酸菌占2％及霉菌占1％，大肠菌群、厌氧菌等占4％。数据表明芽孢杆菌为优势菌群，其次为葡萄球菌。可见当前番茄酱中主要腐败微生物为芽孢杆菌及葡萄球菌，而当前国内外还没有报道建立一套完整的检测番茄酱中主要腐败微生物中芽孢杆菌和葡萄球菌的方法。

国内外没有公开报道番茄酱中微生物指标的具体检测方法标准体系。我国有关番茄酱中微生物检验方法的标准有GB4789.15-94、GB4789.26-94，这两个标准只描述了番茄酱罐头直接镜检霉菌数和商业无菌的检测方法。因此，探索和研究引起番茄酱中腐败微生物的种类，建立番茄酱中主要腐败微生物的检验方法体系，对促进番茄酱产业的快速发展，维护国际市场中番茄酱贸易的优势地位，均具有重要意义。

发明内容

针对目前进出口番茄酱中微生物检测的项目主要是霉菌，关于番茄酱中霉菌的检测方法，国外已有文献报道；对其它微生物项目的检测很少涉及，随着国际贸易的日益发展，对商品检测技术的要求越来越高，很多国家和地区要求增加番茄酱中主要腐败微生物的检测，关于番茄酱中芽孢杆菌及葡萄球菌检测方法，未见国内外文献报道，而目前相关的研究工作在中国仍是一片空白。而本领域熟知，番茄酱罐头虽经高温处理，但仍有很多微生物如芽孢菌等难以灭活。

本发明研究表明，将分离出的枯草芽孢杆菌及地衣芽孢杆菌分别接入番茄酱中，37℃培养24h后，均能引起番茄酱总酸量增加，还原糖量减少，从而导致番茄酱发生酸败现象。这两种菌均属于能主体引起番茄酱腐败的微生物。实验证明，部分葡萄球菌也能导致番茄酱腐败变质。

本发明提供了一种番茄酱中主要腐败微生物的检验方法。

本发明具体提供了番茄酱中主要腐败微生物的检验方法，建立了番茄酱中芽孢杆菌、葡萄球菌主要腐败菌的检验方法。

本发明的技术方案：通过对进出口的番茄酱开展了各类微生物的分离培养研究。研究中发现，进出口番茄酱中主要存在芽孢菌、葡萄球菌以及极少量的酵母菌。将分离培养出的微生物进行鉴定后，对其特性进行了相关资料的查询，均为能引起番茄酱腐败的微生物种类。为此，本发明建立了番茄酱中芽孢菌和葡萄球菌的分离培养方法。

本领域所熟知，腐败微生物(Corruptmicroorgnisms)主要作为判定番茄酱中被污染程度的标志，本发明通过将袋装或罐装番茄酱，经过一定条件的培养后(如培养基成分、培养温度和时间、PH、需氧性质等)，所培养分离出的主要芽孢杆菌、葡萄球菌。

本发明具体提供了一种番茄酱中主要腐败微生物的检验步骤如下：

一、增菌培养

1.检样处理：以本领域所熟知的无菌操作，按重量体积百分比(g/100mL)计，取番茄酱8％～12％，加入200mL～250mL生理盐水，混合均匀制成混悬液。

2.增菌培养：按重量体积百分比(g/100mL)计，将8％～12％混悬培养液将接种于相应的培养液，即吸取20mL～30mL上述混悬液，接种于平酸菌增菌培养液或嗜热耐酸杆菌琼脂培养液和胰大豆胨肉汤培养液或改良BCP培养液中，在35℃～37℃中培养24-48h。

二、分离培养和鉴定

1.本领域熟知，在其他食品中分离目标菌，一般前增菌培养基与分离培养基有所差异，导致生产步骤复杂，生产成本加大，本发明前增菌和分离培养基均相同，都采用平酸菌增菌培养液或嗜热耐酸杆菌琼脂培养液和胰大豆胨肉汤培养液或改良BCP培养液。

2.本发明中培养基的筛选是基于根据番茄酱属酸性罐头的特征，从广谱性芽孢杆菌和葡萄球菌的分离培养基角度，在众多培养基中确定了分离效果最好的四种培养基：平酸菌增菌培养液或嗜热耐酸杆菌培养液和胰大豆胨肉汤培养液或改良BCP培养液。而在检测其它食品中芽孢杆菌和葡萄球菌的分离方法不完全适合番茄酱中两种菌的分离。

3.将上述培养物，划线转种于平酸菌增菌培养基平板或嗜热耐酸杆菌琼脂培养基平板和胰大豆胨肉汤培养基或改良BCP培养基中，35℃～37℃中分别培养24-48h，观察菌体形态。

4.生化特性：经过单糖发酵试验、Voges-Proskauer(V-P)试验、甲基红试验、接触酶实验、柠檬酸盐反应、石蕊牛奶的反应和革兰氏染色方法，这些方法都是熟知的常用技术手段，通过上述系列实验得知：

芽孢杆菌可利用葡萄糖、麦芽糖、乳糖及柠檬酸盐，接触酶阳性，石蕊牛奶呈还原胨化反应。

葡萄球菌：不能分解乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖；甲基红阳性；V-P为弱阳性。

三、结果报告：结合上述特征及相应数据，结合相应菌体的菌落特点，可以清楚的判断，从番茄酱中检出或未检出芽孢杆菌、葡萄球菌。

本发明上述生产方法中选用的菌种，为已公开报道的。

本发明中所涉及到的％均以体积重量百分比计。

本发明引用了：GB/T4789.28-2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂。

通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果。

1.通过本发明提供的检测检验方法，经革兰氏染色呈阳性，能够准确的判定袋装或罐装番茄酱中有腐败微生物存在，以及科学判定作为流通的番茄酱商品被污染的程度。

2.本发明建立了增菌培养体系，有效的将番茄酱中的主要腐败菌检验出来。

3.在食品等商品中分离目标菌，一般前增菌培养基与分离培养基有所差异，导致其工艺步骤复杂，其生产成本加大，本发明前增菌和分离培养基均相同。

附图说明：

图1所示为芽孢杆菌对番茄酱液还原糖量的影响，选取四种代表性的芽孢杆菌在番茄酱液中37℃培养24h，对番茄酱液还原糖量的影响，其中枯草芽孢杆菌-◆，矮小芽孢杆菌-■，地衣芽孢杆菌-▲，淀粉液化芽孢杆菌-×。

图2所示为芽孢杆菌对番茄酱液总酸量的影响，选取四种代表性的芽孢杆菌在番茄酱液中37℃培养24h，对番茄酱液还原糖量的影响，其中枯草芽孢杆菌-◆，矮小芽孢杆菌-■，地衣芽孢杆菌-▲，淀粉液化芽孢杆菌-×。

图3所示为葡萄球菌对番茄酱总酸量的变化情况，选取两种代表性的葡萄球菌接种菌液后番茄酱总酸量的变化情况，其中腐生葡萄球菌-◆-，沃氏葡萄球菌-■-。

图4所示为葡萄球菌对番茄酱还原糖量的变化情况，选取两种代表性的葡萄球菌接种菌液后番茄酱还原糖量的变化情况，其中腐生葡萄球菌-◆-，沃氏葡萄球菌-■-菌液后番茄酱。

图5所示为番茄酱中芽孢杆菌检验流程图。

图6所示为番茄酱中葡萄球菌检验流程图。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，则按100Kg饮料重量为基准，％皆指重量百分比。

本发明中设备和材料有：36℃±1℃的恒温培养箱、高压蒸气灭菌锅、0℃～4℃冰箱、10×～100×显微镜、最大称重达2000g，感量0.1g的天平、1ml(具0.01ml刻度)和10ml(具0.1ml刻度)的灭菌吸管、16mm×160mm和18mm×180mm的灭菌试管、直径90mm的灭菌培养皿、pH计、pH试纸、酒精灯、灭菌剪子和镊子等。

实施例一：番茄酱中芽孢杆菌、葡萄球菌的分离与鉴定

通过对六种番茄酱进行35℃～37℃前增菌，将前增菌液培养24h后转入嗜热耐酸芽孢杆菌和平酸菌增菌琼脂培养基。将分离出的菌株经VITEK-32生化鉴定，结果为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和矮小芽孢杆菌。

通过从袋装番茄酱和罐装番茄酱进行35℃～37℃前增菌，将前增菌液培养24h后转入胰大豆胨肉汤培养基和改良BCP培养基。将分离出的菌株经VITEK-32生化鉴定，结果为腐生葡萄球菌和沃氏葡萄球菌。

从新疆进出口的Y6、Y10、Y19、Y 35、Y 36、Y41、Y53、Y56、Y65等二十多批番茄酱，按无菌操作取番茄酱25g，加入225mL生理盐水，混合均匀制成混悬液，以体积比将10％混悬培养液在35℃～37℃将接种于相应的培养液，经平酸菌增菌培养液或嗜热耐酸杆菌琼脂培养液和胰大豆胨肉汤培养液或改良BCP培养液中，在35℃～37℃进行增菌培养24-48h。采用相同的前增菌和分离培养基，进行培养，划线转种于平酸菌增菌培养基平板或嗜热耐酸杆菌琼脂培养基平板和胰大豆胨肉汤培养基或改良BCP培养基中，在35℃～37℃条件下分别培养24-48h。观察获得的菌落特征，将上述可疑菌落做涂片染色，进行显微镜观察判断菌体形态。

观察菌体形态：芽孢杆菌呈表面粗糙皱褶、不透明、白色，为革兰氏阳性芽孢杆菌，单个细胞0.7μm～0.8μm×2μm～3μm、着色均匀；无荚膜，全身鞭毛，能活动，芽孢呈椭圆或柱状；葡萄球菌呈圆形、凸起、边缘整齐、表面光滑、湿润、有光泽、不透明菌落。菌落直径在1mm～5mm，为革兰氏阳性球菌，直径0.4μm～1.2μm，呈葡萄串状排列。

通过利用葡萄糖、麦芽糖、乳糖及柠檬酸盐，接触酶阳性，石蕊牛奶呈还原胨化反应，判断芽孢杆菌；通过分析不能分解乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，甲基红阳性，V-P为弱阳性，判断葡萄球菌。参见附图5、6

上述试验步骤都可分离出芽孢菌和葡萄球菌，分离出的微生物采用VITEK-32进行鉴定。结果表明：芽孢菌类主要有枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、矮小芽孢杆菌(Bacillus.pumilus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)等；葡萄球菌主要有腐生葡萄球菌(Staptococcussaprophyticus)和沃氏葡萄球菌(Staptococcus warneri)等，这些菌种与现有公开报道的同类菌种相同。

实施例二：

按照实施例一所述试验步骤，参见附图5、6，其中，按重量体积百分比计(g/100mL)，以无菌操作取番茄酱8％，加入200mL生理盐水，混合均匀制成混悬液，以体积比将10％混悬培养在35℃将接种于相应的培养液，经相应培养基在35℃进行增菌培养24-48h。采用相同的前增菌和分离培养基，进行培养、转种，在35℃～37℃分别培养24-48h。都可分离出芽孢菌和葡萄球菌，分离出的微生物采用VITEK-32进行鉴定。结果表明：芽孢菌类主要有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、矮小芽孢杆菌(Bacillus.pumilus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)等；葡萄球菌主要有腐生葡萄球菌(Staptococcussaprophyticus)和沃氏葡萄球菌(Staptococcus warneri)等，这些菌种与现有公开报道的同类菌种相同。

实施例三：

按照实施例一所述试验步骤，参见附图5、6，其中，按重量体积百分比计(g/100mL)，以无菌操作取番茄酱12％，加入250mL生理盐水，混合均匀制成混悬液，以体积比将10％混悬培养液37℃将接种于相应的培养液，经相应培养基在37℃进行增菌培养24-48h。采用相同的前增菌和分离培养基，进行培养、转种，在35℃～37℃分别培养24-48h。都可分离出芽孢菌和葡萄球菌，分离出的微生物采用VITEK-32进行鉴定，出芽孢菌和葡萄球菌与现有公开报道的同类菌种相同。

实施例四：

按照实施例一所述试验步骤，参见附图5、6，其中，按重量体积百分比计(g/100mL)，以无菌操作取番茄酱10％加入240mL生理盐水，混合均匀制成混悬液，以体积比将10％混悬培养液36℃将接种于相应的培养液，经相应培养基在35.5℃、进行增菌培养24-48h。采用相同的前增菌和分离培养基，进行培养、转种，在35℃～37℃分别培养24-48h。都可分离出芽孢菌和葡萄球菌，分离出的微生物采用VITEK-32进行鉴定，出芽孢菌和葡萄球菌与现有公开报道的同类菌种相同。

实施例五：

按照实施例一所述试验步骤，参见附图5、6，其中，按重量体积百分比计(g/100mL)，以无菌操作取番茄酱9％加入205mL生理盐水，混合均匀制成混悬液，以体积比将10％混悬培养液36.5℃将接种于相应的培养液，经相应培养基在35℃进行增菌培养24-48h。采用相同的前增菌和分离培养基，进行培养、转种，在35℃～37℃分别培养24-48h。都可分离出芽孢菌和葡萄球菌，分离出的微生物采用VITEK-32进行鉴定，出芽孢菌和葡萄球菌与现有公开报道的同类菌种相同。

实施例六：芽孢杆菌对番茄酱品质的影响

对分离自番茄酱的枯草芽孢杆菌、矮小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和淀粉液化芽孢杆菌分别重新接入番茄酱液，37℃培养24h，每4h测定一次番茄酱中总酸量和还原糖量的变化，结果参见附图图1、图2。

参见附图图1、图2表明，在培养8h-16h时有大量酸产生，还原糖量急剧降低，证明这四株菌均能导致番茄酱腐败变质。

实施例七：葡萄球菌对番茄酱品质的影响

对分离自番茄酱的腐生葡萄球菌和沃氏葡萄球菌分别重新接入番茄酱液中，37℃培养24h，每4h测定一次番茄酱中总酸量和还原糖量的变化，结果参见附图图3、图4。

由参见附图图3、图4可见，腐生葡萄球菌在0h-8h和12h-24h时总酸量急剧增加，还原糖量迅速降低；沃氏葡萄球菌在0h-16h时总酸量急剧增加，在0h-8h和16h-24h还原糖量迅速降低，最终导致番茄酱腐败变质。

实施例八：培养分离芽孢杆菌选用培养基的筛选

采用同一批番茄酱、同一培养条件，根据番茄酱特性，选用熟知的各类培养基，本发明选用最具代表性的五种培养基：嗜热耐酸杆菌培养基、脂耐热嗜酸杆菌琼脂、营养肉汤、甘露醇卵黄多粘菌素琼脂和平酸菌增菌培养液。其培养条件都为熟知的技术。通过培养发现，选用平酸菌增菌培养基和嗜热耐酸杆菌培养基有菌生长，参见表一。具体选用培养基的组分及培养条件如下：

平酸菌增菌培养基：

1.成分

胰蛋白胨      5.0g

酵母浸膏      5.0g

葡萄糖                  5.0g

可溶性淀粉              2.0g

磷酸氢二钾              4.0g

1％溴甲酚紫酒精溶液     1.0mL

蒸馏水                  1000mL

2.制法

将上述成分混合，加热并轻轻搅拌溶解，分装后，121℃高压灭菌15min，pH7.0±0.2。加入2％的琼脂即为固体培养基。

嗜热耐酸杆菌培养基：

成分

酵母浸膏          5.0g，

蛋白胨            5.0g，

葡萄糖            5.0g

磷酸氢二钾        4.0g

蒸馏水            1000mL

制法

将上述成分混合，加热并轻轻搅拌溶解，分装后，121℃高压灭菌15min，pH7.0±0.2。加入2％的琼脂即为固体培养基。

表一：芽孢杆菌分离用培养基

嗜热耐酸杆菌培养基	脂耐热嗜酸杆菌琼脂培养基	营养肉汤培养基	甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基	平酸菌增菌培养基
					有菌生长	无菌生长	无菌生长	无菌生长	有菌生长

实施例九：培养分离葡萄球菌选用培养基的筛选

采用同一批番茄酱、同一培养条件，根据番茄酱特性，选用熟知的各类培养基，本发明选用最具代表性的五种培养基：胰大豆胨肉汤培养液、改良BCP培养液、营养肉汤、叠氮钠血琼脂和血琼脂。其培养条件都为熟知的技术。通过培养发现，选用胰大豆胨肉汤培养液和改良BCP培养液有菌生长，参见表二。

具体选用培养基的组分及培养条件如下：

胰大豆胨肉汤培养液：胰蛋白胨   17g

大豆胨                         3g

葡萄糖                         2.5g

氯化钠                         5g

磷酸氢二钾                     2.5g

蒸馏水                     1000ml

pH＝7.1-7.5

制法：

将上述成分混合，加热并轻轻搅拌溶解，分装后，121℃高压灭菌15min，pH7.0±0.2。加入2％的琼脂即为固体培养基。

改良BCP培养液：蛋白胨     10.0g

牛肉浸膏                  3g

氯化钠                    5.0g

葡萄糖                    10g

碳酸钙                    1％

蒸馏水                    1000ml

pH＝7.0±0.2

制法：

将上述成分混合，加热并轻轻搅拌溶解，分装后，121℃高压灭菌15min，pH7.0±0.2。加入2％的琼脂即为固体培养基。

表二：葡萄球菌分离用培养基

胰大豆胨肉汤培养液	改良BCP培养液	营养肉汤	叠氮钠血琼脂	血琼脂
					有菌生长	有菌生长	无菌生长	无菌生长	无菌生长

实施例十：芽孢杆菌与葡萄球菌常见生化反应方法

1.单糖发酵试验

(1)将葡萄糖(乳糖或麦芽糖或蔗糖等)加入蛋白胨水培养基内，使其最终浓度为0.5％，并加入一定量酚红指示剂及小倒管，制成单糖发酵管。

(2)将细菌按照液体接种方法分别接种于单糖发酵管内，置37℃培养箱，培养18-24小时。

(3)观察结果：接种细菌经37℃培养18-24小时，若能分解糖产酸则酚红指示剂由红变黄，若能分解甲酸有CO₂和H₂等气体形成，小倒管内则聚集有气泡；不分解，则指示剂不变色。

注：蔗糖应采用过滤除菌

2.V-P(Voges-Proskauer)试验

(1)接种细菌于葡萄糖蛋白胨水中。

(2)置37℃培养48小时后，取出分别加入40％KOH 1mL和6％α-奈酚溶液1mL，摇匀，静置试管架上5-15分钟。

(3)观察结果：培养液变为红色为阳性，不变色为阴性。

3.甲基红试验

(1)接种细菌于葡萄糖蛋白胨水中。

(2)置37℃培养2-3天取出，分别滴加甲基红试剂2-3滴，混匀。

(3)观察结果：培养液变为红色为阳性，黄色为阴性。

4.接触酶实验：

(1)挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加2mL3％过氧化氢溶液。

(2)观察结果：于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。

5.柠檬酸盐反应

(1)取幼龄菌种接种于柠檬酸盐斜面培养基上，37℃培养3-7天。

(2)观察结果：培养基呈碱性(蓝色)者为阳性反应，不变者则为阴性

6.石蕊牛奶的反应

(1)取菌液接入5～10ml的石蕊牛奶培养基中，在37℃培养48小时。

(2)观察结果：石蕊应还原为无色，牛奶应呈正常凝固现象，培养基上层表面应呈紫红色环。

7.革兰氏染色方法

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：

(1)涂片固定。

(2)草酸铵结晶紫染1分钟。

(3)自来水冲洗。

(4)加碘液覆盖涂面染1分钟。

(5)水洗，用吸水纸吸去水分。

(6)加95％酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分。

(7)蕃红染色液(稀)(或沙黄)染10秒钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。

(8)染色的结果：革兰氏阳性菌体呈紫色，阴性菌体呈红色。

实施例十一：番茄酱中主要腐败微生物分布

通过多年从进出口的各类番茄酱分离腐败微生物，导致腐败的微生物分布如表三所示：

表三：汇总多年来从番茄酱中分离微生物结果

通过上述系列实验，利用统计学分析手段得知，进出口番茄酱中微生物研究中分离出的芽孢杆菌占50％，葡萄球菌占25％，其它杆菌占15％，酵母菌占3％，乳酸菌占2％及霉菌占1％，大肠菌群、厌氧菌占4％，说明导致番茄酱主要腐败菌为芽孢杆菌和葡萄球菌。

Claims (2)

1、一种番茄酱中主要腐败微生物的检验方法，通过选择合适的培养基或培养液培养、分离培养，经过单糖发酵试验、Voges-Proskauer试验、甲基红试验、接触酶实验、柠檬酸盐反应、石蕊牛奶的反应和革兰氏染色方法检验，鉴定获得具体腐败微生物的方法，其特征在于，

A.采用前增菌培养，按重量体积百分比计，取番茄酱8％～12％，加入200mL～250mL生理盐水，混合均匀制成混悬液，将8％～12％混悬培养液分别接种于平酸菌增菌培养液或嗜热耐酸杆菌琼脂培养液和胰大豆胨肉汤培养液或改良BCP培养液中，在35℃～37℃中培养24-48h；

B.分离培养和鉴定采用与步骤A前增菌相同平酸菌增菌培养液或嗜热耐酸杆菌琼脂培养液和胰大豆胨肉汤培养液或改良BCP培养液；

C.将上述培养物划线分别转种于平酸菌增菌培养基或嗜热耐酸杆菌琼脂培养基和胰大豆胨肉汤培养基或改良BCP培养基的平板中，35℃～37℃中分别培养24-48h。

2、如权利要求1所述的番茄酱中主要腐败微生物的检验方法，其特征在于，优先按无菌操作取番茄酱25g，加入225mL生理盐水，混合均匀制成混悬液，将10％混悬培养液在36℃将接种于相应的培养液，分别经平酸菌增菌培养液或嗜热耐酸杆菌琼脂培养液和胰大豆胨肉汤培养液或改良BCP培养液中，在36℃进行增菌培养24-48h。

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