CN102268378B - 一种好氧菌高产菌株的高通量筛选方法 - Google Patents

Abstract

一种用于微生物诱变育种、发酵工程领域以实现对菌种高通量筛选的方法，尤其是一种好氧菌高产株的高通量筛选方法，采用了深孔板培养和检测技术。

Description

一种好氧菌高产菌株的高通量筛选方法

技术领域

本发明涉及一种用于微生物诱变育种、发酵工程领域以实现对菌种高通量筛选的方法，尤其是一种高耗氧丝状真菌的高通量筛选方法。

背景技术

头孢菌素类抗生素是国外60年代发展起来的新型β-内酰胺类抗生素，具有抗菌谱更广、耐β-内酰胺酶、很少发生过敏反应，目前已成为全世界最畅销的的抗感染药物。目前在生产量上，我国已成为头孢菌素生产的大国，但是国内由于头孢菌素C生产技术水平低、成本高而使头孢菌素类药物发展缓慢，主要原因之一是其合成原料头孢菌素C发酵生产水平低(国内实际水平30,000u/ml左右，国外40,000u/ml)、杂质组分高造成头孢菌素C成本高，且头孢菌素C转化成7-氨基头孢烷酸(7-ACA)时只能采用污染较大的化学法。因此优良的头孢菌素C高产菌株是发酵生产头孢菌素C的关键。

从当前我国生物技术产业来看，目前我国高产的工业生产菌种的获得主要还是采用随机选育，包括自然选育、诱变育种和以原生质体融合为代表的杂交育种技术，筛选工作量大，费时费力。这是因为产量性状受多基因决定，一次诱变和筛选很难有大幅度提高，需要多轮诱变筛选才能获得稳定、高产的单菌落培养物(菌株)，每轮都是一个大量筛选的过程，这一点不同于以发现化合物为目标的菌种筛选。因此，扩大筛选量可以有效减少随机筛选的盲目性特点，是提高育种效率的一个重要方面，可以说筛选是菌种选育过程成败的一个关键步骤，但无论是随机筛选还是推理选育，都受到人力物力等诸多因素的限制，使得筛选效率很低，势必造成漏筛。因此，需要建立新的筛选方法以提高筛选效率。

近几年用于微生物菌种高通量筛选装置及其相关技术不断发展和成熟。特别是欧美等发达国家开发出全自动高通量筛选工作站，应用最先进的计算机技术和机器人技术，能够实现高效高通量筛选，但是此类大型设备价格相当昂贵，即使在发达国家，也只有财力雄厚的大型实验室具备购买能力，国内企业近期内根本无法承受。因此，使用现有的通用低成本仪器设备，自主开发简便、快速、精准、高效的高通量筛选技术具有重要现实意义。

发明内容：

本发明提供了一种高通量筛选好氧菌高产菌株的方法，包括：

I.提供目标菌混合体；

II.将所述混合体等分成多份混合体子集，转移至深孔板培养令其生产目标产物，每孔一个混合体子集；

III.采用比浊法检测目标产物产量，鉴定高产混合体子集；

IV.对混合体子集进行稀释培养获取单菌落；

V.培养单菌落令其生产目标产物，并通过检测目标产物产量来鉴定高产菌株。

某些实施方式中，步骤II到III重复一次或多次。

某些实施方式中，所述目标产物是头孢菌素C。

某些实施方式中，所述菌种是好氧丝状真菌，尤其是头孢菌素C(CPC)生产菌株，例如顶头孢霉、产黄头孢霉、头孢霉。

某些实施方式中，所述混合体子集含有10-50个菌株或孢子，优选10-30个，例如20个。

某些实施方式中，所述深孔板为24孔、48孔或96孔深孔板。

某些实施方式中，步骤III用酶标仪检测深孔板上各孔的目标产物产量。

本文所述不同实施方式中的特征可以任意组合而同样达到本发明的目的，提供本发明的效果。

附图说明：

图1-①本发明实施方式之一由出发菌株诱变获得高产混合体子集的流程图。

图1-②本发明之一有高产混合体子集获得纯种高产菌株的流程图。

图2：本发明实施方式之一测绘的比浊法标准曲线。

具体实施方式

本发明的目的是提供一种将微孔板培养技术和酶标仪检测结合于一体的简便、快速、精准、高效的完整高通量筛选技术。

本发明方法适用于各种好氧菌，尤其是好氧丝状真菌，例如头孢菌素C(CPC)生产菌株。举例来说，所述头孢菌素C生产菌株包括顶头孢霉(例如可购自广东省微生物研究所菌种保藏中心的GIM3.49(其它编号：AS3.2059)、产黄头孢霉(例如可购自中国高校工业微生物资源和信息中心(CICIM-CU)的CICIM F1008)、头孢霉(例如可购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)的ACCC30146)等。需要说明的是，虽然以下将以头孢菌素C生产菌株为例来说明本发明实施方式、特点和优点，但本领域技术人员将明显看出，本发明方法普遍适用于各种好氧菌，尤其是好氧丝状真菌。

本发明可从目标菌的非均一菌群混合体中筛选出均一的高产子集，乃至稳定的高产单株。作为本发明待筛选原料的混合体可以是分离自自然界的初筛产物，也可以是人工诱变的产物，例如紫外诱变。菌群混合体的形式可以是细胞悬液或孢子悬液。

本发明是基于多孔板培养和检测技术的高通量筛选方法。本发明选用深孔板，例如24孔、48孔、96孔或更多孔的深孔板，平衡了装液量、混合效果、供氧强度和筛选通量等多项要求。

本发明方法的步骤之一是将所述菌群混合体等分成多份混合体子集，转移至深孔板培养，每孔一个混合体子集，令其生产目标产物。实施方式之一将所述混合体悬液根据深孔板的装液量(单孔)等分成若干份，分别转移至各板各孔，每一孔含一个混合体子集。各子集可以用板号、行号和列号的组合来标记。为了减轻后续稀释分离和单菌落培养工作负荷，尽量细分孢子悬液。每份混合体子集的孢子数和菌株数可以为10-50个，优选10-30个，例如20个。这可以通过预实验，例如对混合体悬液进行常规稀释分离和平板记数来估算。

以获取目标产物为目的的孔板培养技术是本领域所熟知的。根据感兴趣的目标菌种，相关的种子培养基、发酵培养基、培养条件和培养时间等均可参照现有技术中的相关教导，予以采纳或加以调整和改进，这些调整和改进都属于领域技术人员的常规技能。

本发明方法的步骤之一是检测各孔中混合体子集培养物的目标产物产量以确定高产混合体子集。微生物代谢产物的各种检测方法是本领域技术人员所熟知的，均可用于本发明。较常用的有高效液相色谱(HPLC)，管碟法和比浊法等。本发明实施方式之一优选比浊法。比浊法是将一定量的抗生素加至接种有试验微生物的液体培养基内，混匀后，经短期培养(4-5小时)，测定培养基的浊度。本发明实施方式之一以48孔板为检定菌培养容器，以酶标仪为检测仪器，实现了高通量的检测，不仅快速而且其成本低廉，与常规的管碟法(2005版中国药典)相比，大大缩短了分析时间(从18小时缩短到4小时)，每个样品只需要50ul分析量，450ul培养基。更重要的是一次检测样品数量可达到成百上千份，而且仅需1人操作。

找出最高产量的混合体子集，找到其对应的种子培养板和培养孔。可以重复前文所述深孔板培养和检测步骤，从而进一步细分子集。

在检定高产混合体子集后，可由种子板上对应的种子培养物进行常规的稀释分离，获取单菌落。然后，分别培养和检测各单菌落的生产能力，从中筛得高产突变株。作为实施方式之一，可将各单菌落转移至深孔板培养令其生产目标产物，每孔一个单菌落，然后通过孔板检测技术例如酶标仪检测各孔培养物的目标产物产量，鉴定高产突变株。作为另一实施方式，也可以对分离的单菌落采用常规的摇瓶培养和检测，例如HLPC检测等。

可选的是，还可以对筛选出的高产突变菌株进行遗传稳定特性检测。例如，可以通过传代培养来检测，例如连续传5代，对每一代进行摇瓶发酵培养，收集发酵液，测定产物产量，由此可判断遗传稳定特性。

以下将通过实施例对本发明进行更为具体的说明。可以理解的是，其中所用具体试剂、条件、设备都仅为本发明实施方式的示例，不作为对本申请请求保护之范围的限定。

实施例1：采用比浊法高通量检测头孢菌素C产量的可行性

比浊法：

向检测培养基(g/100ml：蛋白胨1.0g、牛肉浸膏0.3g、氯化钠0.5g、pH7.2～7.4)中添加5％(v/v)粪产碱杆菌(Bacillus foecalis alkaligenes)(ATCC31555，美国典型培养物保藏中心)以无菌水配制的菌悬液(OD₆₀₀＝1.5)，混匀后，分装至48深孔板中，每孔装450μl。向每孔中加含有头孢菌素C的待测样品50μl，不加待测样品的作为空白对照。37℃，220rpm，培养4-5h，以空白对照的OD₆₀₀达到0.6为终点。酶标仪600nm波长测定吸光值。根据标准曲线计算样品中头孢菌素C的浓度。

标注曲线的绘制：

准确称取头孢菌素C标准品(sigma公司，C3270-5G)，用磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钾0.41g，磷酸氢二钾5.59g，1000ml水，pH7.8)稀释到1000u/ml，然后将其依次稀释到10、20、30、40、50、60、70、80、90、100u/ml。如上所述，将各浓度的标准品稀释液加入粪产碱杆菌培养物，培养，测定OD₆₀₀。以剂量浓度(C)的对数为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线。如图2所示，曲线的二元拟合方程为：Y＝-0.1031X+0.6912，R＝0.9931。

对50份不同来源的头孢菌素C样品分别用比浊法和高效液相色谱(HPLC)测定了CPC浓度，结果见表1

表1：比浊法与HPLC分别测定CPC样品的结果比较(U/ml)

样品号	比浊法	HPLC	样品号	比浊法	HPLC	样品号	比浊法	HPLC
									1	6716	6080	18	5019	4568	35	4641	3123
2	6436	5900	19	10585	8890	36	4202	3211
									3	11364	9987	20	4983	5012	37	4843	4543
4	6436	6210	21	5163	4523	38	6255	5234
									5	7419	7985	22	9052	7348	39	10890	9789
6	7211	6534	23	5274	6121	40	4084	3980
									7	5785	5023	24	7262	5341	41	3777	3544
8	4385	5534	25	5427	3710	42	4323	4015
									9	9447	8568	26	6959	6756	43	4026	3684
10	7109	6512	27	8312	8234	44	3276	3121
									11	5465	4778	28	3723	3544	45	10890	9935
12	9650	8567	29	5127	4476	46	9380	9012
									13	6300	5890	30	4385	3990	47	7109	6241
14	9447	9056	31	5583	5132	48	8799	6820
									15	5868	5006	32	4511	4323	49	8613	6665
16	4385	4012	33	7525	7354	50	5703	4231
									17	5623	5123	34	7579	7245

两中测定结果的相关系数达0.95(excel软件统计)，比浊法可以用于快速检测CPC产量。

实施例2：深孔板用于发酵产头孢菌素C的可行性

用购自将东省微生物研究所菌种保藏中心的头孢菌素C生产菌顶头孢霉AS3.2059(GIM3.49)作新鲜斜面培养。长好后，从该新鲜斜面用接种针挑一环至含有50ml种子培养基的500ml摇瓶中，28℃，220rpm培养72小时。种子转接到发酵培养基时，按照10％接种量接种至48深孔板中，每孔含有700μl发酵培养基。接种后加盖上，置于摇床28℃，220rpm培养144小时。同时做500ml摇瓶发酵，接种量10％，装液量30ml，5个平行，28℃，220rpm培养144小时。

发酵结束后分别检测各孔及摇瓶的头孢菌素C产量和考察是否染菌情况。离心取上清液进行稀释。按照实施例1中所述比浊法检测各个样品100倍稀释液(取0.1ml上清液到9.9ml磷酸缓冲液，即为稀释100倍)的OD₆₀₀，结果见表2。

除非另做说明，本文各实施例所用种子培养基和发酵培养基成分如下：

种子培养基(g/100ml)：葡萄糖0.5、蔗糖3.5、玉米浆干粉5.0、蛋氨酸0.05、硫酸铵0.8、碳酸钙0.5、豆油0.5ml，pH6.5；

发酵培养基(g/100ml)：淀粉7.0、糊精3.0、玉米浆干粉5.0、蛋氨酸0.6、尿素0.3、硫酸铵1.3、硫酸镁0.3、磷酸二氢钾0.9、碳酸钙1.0、豆油2.0，pH6.2。

表2：48深孔板的孔间平行性

RSD：相对标准偏差

平行样的OD₆₀₀均在0.350附近，没有出现染菌现象，孔间相对标准偏差RSD＜5％，说明孔间平行性良好，48深孔板与摇瓶的对应性也很好。

实施例3：48深孔板与摇瓶之间的氧气传递和混合效果比较

1.氧气传递系数采用亚硫酸钠氧化法，实验原理：一定温度和通气条件下，亚硫酸钠在催化剂硫酸钴的作用下被氧化成硫酸钠，整个反应过程中，反应体系的pH会不断下降，当pH将至5.5左右时，反应体系基本由蓝色完全变成黄色，利用指示剂溴百里香酚蓝的颜色变化来确定Na₂SO₃完全氧化的时间t，

Na₂SO₃+0.5O₂-Na₂SO₄

k_La公式推导：

OTR_max＝C_Na2SO4×v_O2/t×v_Na2SO4＝K_La×C^* _O2 (1)

OTR_max＝K_La×L_O2×P_G (2)

其中：C^* _O2：一定温度下，氧气在气液界面的浓度；

L_O2＝9*10^-4mol/L/bar，P_G＝0.2095bar；

C_Na2SO4：反应体系初始的亚硫酸钠浓度；

v_O2：化学反应方程式中氧气的化学计量数系数；

v_Na2SO4：化学反应方程式中亚硫酸钠的化学计量数系数；

t：溶液变色经历的时间。

最终得到k_La＝C_Na2SO4×v_O2/t×v_Na2SO4/L_O2×P_G＝1326/t(h^-1)

2.本实例所用反应体系如下：0.5M亚硫酸钠、10^-7M硫酸钴、0.012M磷酸缓冲液、2.4×10^-5M溴百里香酚蓝、2M硫酸

3.本实例所用实验步骤如下：将去离子水煮沸去氧后冷却；将反应体系溶解混合，用2M硫酸调节初始pH至8.0，滴加溴百里酚蓝(2-3滴/30mL)，48深孔板装液体积为700μl/孔，反应开始后记录反应体系颜色从蓝色到黄色的时间。

4.实验结果见表3

表3：48深孔板每孔的k_La值与500ml摇瓶比较

5.混合测定原理与方法：根据指示剂在酸碱溶液变色的原理(溴百里香酚蓝在碱性溶液中呈现蓝色，酸性溶液中呈现黄色)，用秒表记录颜色消失的时间。确定酸碱的浓度，按照以下表格中记载的装量将混有指示剂的pH为3的硫酸溶液装于摇瓶和48深孔板，按照比例从上端滴加3M氢氧化钠碱性溶液，从滴落第一滴碱溶液时开始计时，直到颜色变化完全，记录整个时间，重复实验5次。

6.混合实验结果见表4

表4：48深孔板与500ml混合效果比较

从表3、4可以看出，同样的振幅和转速下，48深孔板的供氧和混合效果可以达到甚至超过500ml摇瓶的效果。48深孔板完全可以作为好氧微生物的培养容器。

实施例4：高通量筛选头孢菌素C高产株

(1)出发菌株孢子悬液的制备

室温下，用20ml无菌水将新鲜制备的头孢菌素C生产菌顶头孢霉AS3.2059(GIM3.49)斜面上的孢子全部刮洗下，倒入装有玻璃珠的三角瓶中，振荡使孢子充分分散，然后用无菌脱脂棉过滤，即制成诱变用的出发菌株孢子悬液。取0.1ml制得的出发菌株孢子悬液涂平板计算孢子悬液中含有孢子，约1.6×10⁶个孢子。

除非另做说明，本文各实施例中的头孢菌素C生产株斜面与平板培养基的配方(g/100ml)：蛋白胨1.0、麦芽提取物1.2、麦芽糖4.0、琼脂1.8，pH7.0。

(2)诱变处理

取15ml出发菌株孢子悬液置于直径9cm的带搅拌子的平皿中，开启磁力搅拌器，距离15W紫外灯30cm处，照射2分钟。然后加入等量体积的1.2％氯化锂溶液(15ml)，混匀静置20分钟。诱变后孢子悬液涂布于平板上，同时未经诱变的孢子悬液涂布于另一平板上，待出现单菌落后数单菌落个数，诱变的单菌落个数/未经诱变的单菌落个数＝存活率，100％-存活率＝致死率。致死率达98％。

(3)发酵

将30ml诱变后的孢子悬液，等分1500份，全部接种于含有500μl/孔种子培养基的48深孔板，制作成共32块板种子培养板。每孔一份20μl，据致死率估算，大约含有20个孢子，称为一个混合体子集。220rpm、28℃培养72小时。

按照10％的接种量，孔孔对应地将种子板上各孔中的混合体子集转接于另一批含有700μl/孔发酵培养基的48深孔板，220rpm、28℃培养144小时。

含剩余种子培养物的种子培养板暂时用封口膜封住保存于4℃冰箱，待发酵结束，产物检测结果出来后转接于新鲜斜面培养基保藏。

(4)产物检测

产物检测采用实施例1所述的比浊法。无菌水洗下新鲜粪产碱杆菌(ATCC31555)斜面(斜面培养基配方g/100ml：蛋白胨1.0g、牛肉浸膏0.3g、氯化钠0.5g、琼脂1.8，pH7.2～7.4)制成检测菌悬液，无菌水稀释OD₆₀₀到1.5。以5％的接种量混入检测培养基(g/100ml：蛋白胨1.0g、牛肉浸膏0.3g、氯化钠0.5g、pH7.2～7.4)，450μl/孔分装于48深孔板，制作成检测板，与培养板对应，共计32块。

将步骤(3)所得的发酵产物用多孔道移液器稀释到线性范围(10-80U/ml)(根据同批诱变菌群混合体多次发酵后产物检测的经验值来估算)作为待检分析物。按50μl/孔加到检测板上，37℃、培养4～5小时(空白对照的OD₆₀₀达到0.6为终点)。用酶标仪整板读取各孔的OD₆₀₀值。每个混合体子集做三个平行，取平均值。用实施例1绘制的标准曲线计算样品浓度。

诱变后1500份混合体子集经发酵和检测，其中75份有产物，检测结果见表5

表5：诱变后存活的混合体子集检测结果

编号	菌株编号	CPC(U/ml)		编号	菌株编号	CPC(U/ml)
							1	出发菌株	12094		41	I-7-E5	3704
2	I-2-A2	4454		42	I-7-F1	8669

3	I-2-A4	5205		43	I-7-F4	8133
							4	I-2-B1	16401		44	I-7-G4	9305
5	I-2-B6	17358		45	I-7-G5	7906
							6	I-2-C1	4091		46	I-7-H4	10059
7	I-2-C6	13642		47	I-8-A4	8981
							8	I-2-D1	13167		48	I-8-B6	9988
9	I-2-E2	11187		49	I-8-D2	4485
							10	I-2-F2	13642		50	I-8-H2	10422
11	I-2-H1	18240		51	I-8-H4	9848
							12	I-2-H3	12267		52	I-9-H5	8367
13	I-2-H4	12180		53	I-9-H6	7740
							14	I-3-A5	12709		54	I-10-A2	9641
15	I-3-B5	16170		55	I-10-A3	10059
							16	I-3-E2	11187		56	I-10-A5	10059
17	I-3-F5	18240		57	I-10-A6	7417
							18	I-3-G6	17731		58	I-10-B2	9918
19	I-3-H5	13739		59	I-10-B3	8367
							20	I-3-H6	4781		60	I-10-B5	8486
21	I-4-C4	7210		61	I-10-C2	11924
							22	I-4-D4	13074		62	I-10-C5	11108
23	I-4-G2	17358		63	I-10-C6	13167
							24	I-5-A4	4391		64	I-10-D2	14034
25	I-5-A5	7523		65	I-10-D5	5955
							26	I-5-A6	11428		66	I-10-D6	8730
27	I-5-B5	15064		67	I-10-E2	8855
							28	I-5-F6	13167		68	I-10-E3	7262
29	I-6-D2	15172		69	I-10-E5	10422
							30	I-7-A1	14852		70	I-10-E6	10131
31	I-7-A3	11267		71	I-10-F2	9778
							32	I-7-A6	13739		72	I-10-F5	8918
33	I-7-B1	18501		73	I-10-G2	6302
							34	I-7-B3	19032		74	I-10-G3	9988
35	I-7-C1	14335		75	I-10-G5	8855
							36	I-7-C4	15388		76	I-10-H5	11756
37	I-7-C5	14234
							38	I-7-D1	16285
39	I-7-D5	16056
							40	I-7-E1	17358

注：I表示第一代诱变，数字表示板号，其后的英文字母表示孔的行好(A-H)和列号(1-6)

从表5可以看出，相比出发菌株，诱变得到的混合体子集I-7-B1，效价从12000左右提高到18500U/ml，提高了50％。下一步对I-7-B1进行高通量分离纯化，找出高产菌株。

(5)高产菌株的分离纯化

将菌株混合体子集I-7-B1从种子培养基中涂布于新鲜平板培养基上，30℃培养10天左右。等单菌落长出后，分别转接于新鲜斜面培养基上，30℃培养10天后。摇瓶发酵(500ml摇瓶，发酵培养基装量30ml，接种量10％(v/v)，28℃，220rpm，发酵144h)。产物由HPLC检测，获得高产菌株II-5-D2。

表6 混合体子集I-7-B1分离得到的单菌落发酵检测结果

编号	菌株编号	CPC(U/ml)		编号	菌株编号	CPC(U/ml)
							1	II-5-H4	10741		10	II-6-F1	10604
2	II-5-D2	18776		11	II-6-B1	10073
							3	II-5-D5	9387		12	II-5-D4	9881
4	II-6-B6	9596		13	II-8-B4	8850
							5	II-6-D6	14447		14	II-5-C4	14327
6	II-6-A1	16901		15	II-4-F3	17895
							7	II-5-E2	17265		16	II-5-F6	12425
8	II-6-C1	17536		17	II-7-E5	15324
							9	II-10-G2	13854		18	II-2-A2	12200

II表示第二阶段分离纯化，数字表示平板号，英文字母与数字的组合表示平板上长出的单菌落编号。

从表6可以看出，高产混合体子集分离得到18个单菌落，摇瓶发酵后，产量分布较均匀，其中II-5-D2产量最高，相比出发菌株，效价从12000提高到18776U/ml，提高幅度超过50％。

以上，结合具体实施例对本发明进行了详尽的说明。本领域技术人员不难理解，本发明的实施方式决不限于或以上任何具体实施例、具体步骤、具体设备和具体数值或数值范围，根据在此公开的本发明要旨所进行的各种等同修改和替换都术语本申请权利要求所限定的范围之内。此外，本申请提及的所有文献都以引用并参考的方式纳入作为在本发明说明书的内容。

Claims (10)

1.一种高通量筛选好氧丝状真菌高产菌株的方法，包括：

I.提供目标菌混合体；

II.将所述混合体等分成多份混合体子集，转移至深孔板培养令其生产目标产物，每孔一个混合体子集；

III.采用比浊法检测目标产物产量，鉴定高产混合体子集；

IV.对混合体子集进行稀释培养获取单菌落；

V.培养单菌落令其生产目标产物，并通过检测目标产物产量来鉴定高产菌株。

2.如权利要求1所述的方法，其中的步骤II到III重复一次或多次。

3.如权利要求1所述的方法，所述目标产物是头孢菌素C。

4.如权利要求1所述的方法，筛选的是头孢菌素C高产菌株。

5.如权利要求1所述的方法，筛选的高产菌株属于顶头孢霉、产黄头孢霉、头孢霉。

6.如权利要求1所述的方法，所述混合体子集含有10-50个菌株或孢子。

7.如权利要求1所述的方法，所述混合体子集含有10-30个菌株或孢子。

8.如权利要求1所述的方法，所述混合体子集含有20个菌株或孢子。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，所述深孔板为24孔、48孔或96孔深孔板。

10.如权利要求1所述的方法，步骤III用酶标仪检测深孔板上各孔的目标产物产量。

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