CN114317364A

CN114317364A - 一株高地芽孢杆菌及其在产高稳定性碱性果胶酶中的应用

Info

Publication number: CN114317364A
Application number: CN202111680723.7A
Authority: CN
Inventors: 张海波; 张鸽; 刘好宝; 邓帅军
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2041-12-30
Also published as: CN114317364B

Abstract

本发明公开了一株高地芽孢杆菌及其在产高稳定性碱性果胶酶中的应用，属于微生物技术领域。提高果胶酶的稳定性和获得一株可以发酵产高稳定性碱性果胶酶的菌株。本发明提供了一种高地芽孢杆菌，保藏号为CGMCC NO.22763，该菌株可以通过发酵产碱性果胶酶，该酶的最适反应温度为60℃，但在45℃下保温180min仍具有84％的酶活；最适反应pH为10.0，并且具有较宽的pH稳定性，在4℃条件，将该酶与不同pH的缓冲液混匀放置24h后，剩余酶基本保持100％的酶活，具有较好的稳定性。对于扩展碱性果胶酶在工业中的实际应用具有重要的意义。

Description

一株高地芽孢杆菌及其在产高稳定性碱性果胶酶中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高地芽孢杆菌及其在产高稳定性碱性果胶酶中的应用。

背景技术

果胶酶作为四大酶制剂之一，具有很大的市场需求量。果胶酶除可以从动植物中提取外，还可以通过微生物发酵获得，尤其随着基因工程等技术的发展，微生物发酵产果胶酶逐步引起研究者们的关注。常见的微生物包括真菌、细菌、酵母以及放线菌等，其中真菌来源的果胶酶一般最适反应pH偏酸性，而细菌发酵的果胶酶一般最适pH偏碱性。碱性果胶酶在茶和咖啡的发酵、污水处理、纺织精练以及废弃物处理中应用广泛。但碱性果胶酶在应用中，一般需要作用较长时间，生产实际的工艺条件要求碱性果胶酶具有良好的pH稳定性。目前，研究多集中于真菌产的酸性果胶酶，其一般在酸性环境中具有相对稳定的活性，但在碱性条件下稳定性较差；而目前细菌来源的碱性果胶酶一般报道在其最适反应pH范围前后较小的范围内具有相对好的稳定性，但酶保持稳定酶活的时间相对较短。碱性果胶酶的稳定性进一步限制了酶的应用。寻找可以在宽范围pH条件下稳定的果胶酶以及在可以在较长时间内保持稳定的果胶酶对于扩展碱性果胶酶在工业中的实际应用具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是为了提高果胶酶的稳定性和获得一株可以发酵产高稳定性碱性果胶酶的菌株。

本发明提供一种高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，所述高地芽孢杆菌的命名为高地芽孢杆菌CAS-WZS-08，于2021年6月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.22763。

本发明提供了一种微生物制剂，所述微生物制剂含上述的高地芽孢杆菌。

上述的高地芽孢杆菌或上述微生物制剂生在产果胶酶中的应用。

本发明提供了一种生产果胶酶的方法，所述方法是将上述高地芽孢杆菌在37℃温度下、在氧气含量为10％-21％的条件下，至少发酵24-48h时间。

进一步地限定，用于发酵的培养基的成分含有果胶、硫酸铵、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、无水硫酸镁和无水硫化亚铁。

本发明提供了上述产果胶酶的方法产的果胶酶。

本发明提供了上述的高地芽孢杆菌在分解果胶中的应用。

进一步地限定，所述应用的步骤为利用上述的高地芽孢杆菌生产果胶酶，再将果胶酶按照10U/g的量加入到含有质量分数为0.2％的果胶的体系中，在60℃下反应30min。

进一步地限定，所述筛选方法包括如下步骤：将待筛选样品菌悬液稀释涂布于果胶筛选平板中，37℃下培养获得待鉴定菌株后，再次将待鉴定菌的单菌落，接种至LB试管培养基中，37℃条件下培养获得种子液，将待筛选菌株的种子液点接至功能性筛选培养基中，最后将筛选平板置于37℃，15％氧气和85％氮气条件下培养，获得目的菌株。

进一步地限定，所述功能性的筛选培养基成分为果胶、硫酸铵、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、无水硫酸镁和无水硫化亚铁。

本发明提供上述的筛选方法在固态发酵中功能微生物的筛选中的应用。

有益效果：本发明通过借助低氧筛选压力和果胶碳源的筛选压力获得了一株高地芽孢杆菌杆菌，该菌株可以通过发酵产碱性果胶酶。该酶的最适反应温度为60℃，但在45℃下保温180min仍具有84％的酶活；最适反应pH为10.0，并且具有较宽的pH稳定性，在4℃条件，将该酶与不同pH的缓冲液混匀放置24h后，剩余酶基本保持100％的酶活，具有较好的稳定性。

【生物材料保藏】：高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，分类命名为CAS-WZS-08，已于2021年06月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.22763，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1为半乳糖醛酸标准曲线；其中，横坐标是半乳糖醛酸浓度，纵坐标是OD₅₄₀；

图2为高地芽孢杆菌分泌的果胶酶的酶学性质：最适反应温度(A)；最适反应pH(B)；温度稳定性(C)；pH稳定性(D)结果；

图3为高地芽孢杆菌CAS-WZS-08比对的进化树分析图。

具体实施方式

果胶筛选培养基制备：果胶筛选培养基成分：果胶2g/L，硫酸铵10g/L，氯化钠2g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，无水硫酸镁0.3g/L，无水硫化亚铁0.1g/L，pH7.0，琼脂15g/L，115℃灭菌30min。

菌悬液的制备：将待筛选样品按照5％(w/v)的量置于含有无菌蒸馏水的三角瓶中，37℃，180rpm/min下进行振荡30-60min，获得菌悬液原液，梯度稀释后获得待涂布液。取100ul涂布于果胶培养基中。

LB试管培养基制备：按照胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母提取物5g/L的培养配置LB培养基，每个试管中加入3ml培养基，121℃下灭菌20min，获得待使用LB培养基试管。

实施例1.高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)的筛选和鉴定

1.筛选：从雪茄烟叶中分离出的高地芽孢杆菌：

(1)初筛：将雪茄烟叶剪碎后置于纯水中，振荡培养后获得菌悬液，将菌悬液稀释涂布于果胶筛选培养平板上，随后将筛选平板置于37℃培养箱中静置培养24h，待平板表面长出可见菌落。

初筛选菌落的纯培养：将筛选平板中生长的菌落划线至筛选平板中，进一步在37℃下培养，获得筛选菌落的纯培养。

(2)复筛：复筛菌株的菌液制备：将步骤(1)中获得的纯培养菌株的单菌落，接种至LB试管培养基中，37℃，180rpm/min下培养10h，获得种子液。将待筛选菌株的种子液取1ul点接至果胶筛选培养基中，随后用封口膜将平板封好。

(3)筛选平板的培养：将筛选平板置于密封效果好的自封袋中，向自封袋中充入含有15％氧气，85％氮气的气体。为保证自封袋中气体为设定氧气含量，在第一次充气结束后，将自封袋中气体排空，再次充入低氧气体，随后封好自封袋封口，并测试是否漏气。测试结束后将自封袋一同置于培养箱中培养，24h后查看平板结果，5-8个平板重复。

(4)低氧下产果胶酶能力的鉴定：低氧条件下培养结束后向培养基中加入0.1％的刚果红染液，染色60min，结束后弃掉染液，随后向培养基中加入1mol/L的氯化钠溶液，洗脱2h，观察是否有透明圈产生，确定菌株在低氧条件下产果胶酶的情况。

结果：高地芽孢杆菌CAS-WZS-08菌株可以产生明显的透明圈。

2.鉴定：16S rRNA鉴定方法：

表1.菌落PCR体系表1所示：27F引物序列如SEQ ID NO.1所示和1492R的引物序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

SEQ ID NO.2：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’

表1菌落PCR体系

PCR反应程序为：98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸15s；循环次数为30。将PCR结果进行DNA电泳检测，检测条带大小正确的送至北京擎科生物科技有限公司青岛分公司进行一代测序，获得16S的序列如SEQ ID NO.3所示。测序结果提交至NCBI数据库中进行检索Blast比对，获得菌株信息结果：为进化树图如图3所示，由进化树结果可知，筛选菌株CAS-WZS-08与高地芽孢杆菌亲缘关系较进，目的菌株鉴定为高地芽孢杆菌。

实施例2.高地芽孢杆菌分泌果胶酶

1.高地芽孢杆菌的发酵：

种子液制备：将获得的菌株接种至含有LB培养基的试管中，37℃，180rpm/min下培养10h，获得一级种子液。将一级种子液按照2％的接种量接种至含有50ml LB液体培养基的三角瓶中，37℃，180rpm/min下培养4h，获得二级种子液。将二级种子液按照2％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中进行发酵24h。

2.酶液收集：

发酵结束后，取发酵液置于12000rpm/min下离心5min，获得上清，即为粗酶液。

3.果胶酶酶活的测定：

(1)标准曲线制备按照以下步骤进行：

半乳糖醛酸溶液(1mg/mL)：称取0.1g半乳糖醛酸，用pH9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液定容至100ml。按照以下表格1配置不同浓度的反应管。

表1.半乳糖醛酸标准曲线

按表中体系加入试剂，沸水煮沸5min，随后立即用流水冷却至室温，后定容至25ml。以0号作为对照管，测定540nm处的吸光值，绘制标准曲线。标准曲线制备结果如图1所示：

(2)发酵样品的酶活测定与比较：取粗酶液20ul，加入0.2％(w/v)果胶底物中(pH＝10.0，50mmol/L甘氨酸-氢氧化钠)，在60℃下反应30min，结束后加入500ul DNS试剂，最后置于100℃金属浴中煮沸5min，结束后将反应管置于冷水中，室温后在540nm处测定样品中的吸光度。去掉对比有值，确定筛选菌株产果胶酶的能力。

(3)果胶酶酶学性质测定

①果胶酶的最适反应温度

反应体系为50ul粗酶液+500ul果胶底物，在不同温度下反应30min，反应结束后加入500ul DNS试剂，金属浴煮沸5min，结束后置于冷水中冷却，比较不同温度下果胶酶活力的大小。

果胶酶的温度稳定性实验

(1)将阳离子交换柱分离后的部分纯化酶液分别置于60℃、55℃、50℃、45℃、40℃、35℃以及30℃，间隔30min取样，是为待测样品。

(2)将取样结束的样品按照反应体系添加，在最适反应温度下进行反应，测定在540nm处的吸光值。以初始样品的吸光值为100％，酶活的样品为ck。

(3)反应体系：粗酶液50ul+500ul，pH9.0，50mmol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配置的0.2％(w/v)的果胶溶液中，60℃反应30min，结束后加入500ul DNS试剂，金属浴煮沸5min，结束后置于冷水中终止反应。

结果如图2中的A和C所示：由结果A可知，在反应温度为60℃之前，酶活的大小随着温度的升高而升高，60℃时到达顶点；当温度超过60℃时，酶活降低。该结果说明，果胶酶的最适反应温度为60℃。温度稳定性的结果如图C所示，由结果可知，将酶液置于不同温度下，测定剩余酶活以此表征该酶在该温度下的稳定性，当温度低于45℃时，酶活较稳定；当温度高于45℃时，酶活下降较快，尤其是当温度达到60℃时，保温30min后，剩余酶活仅为初始酶活的一半以下。

②果胶酶的最适反应pH

将50ul粗酶液与不同pH的缓冲液配置的果胶底物(0.2％，w/v)置于最适反应温度下反应，30min后加入500ul DNS试剂，金属浴煮沸5min，结束后置于冷水中冷却，比较不同缓冲液配置果胶底物下果胶酶活力的大小。

果胶酶的pH稳定性实验

1)将粗酶液与不同pH的缓冲液进行混匀，获得不同pH缓冲液下的样品，随后将其置于4℃冰箱中，静置24h后测定剩余酶活的活力，以初始下的酶活为初始样品的酶活，以水同等稀释下的酶活进行灭活后为对照校零。

2)测定反应体系：20ul待测液+500ul底物，60℃下反应30min，加入500ul DNS试剂后，金属浴中100℃下煮沸5min，结束后冷却，最后在540nm处测定不同样品的吸光度。

结果如图2中的B和D所示：由图B结果可知，该果胶酶在pH为10条件下，酶活最高，当pH低于10时，随着pH的升高，酶活逐渐升高，但不同的缓冲液对酶活有影响；当pH大于10时，酶活急剧降低。图D结果显示，该果胶酶在不同pH缓冲液下放置时，具有较好的稳定性，仅在pH＝3的条件下没有酶活，其余条件下剩余酶活都较高，证明该酶具有较宽的pH稳定性。

总之，本发明的高地芽孢杆菌产的果胶酶的最适反应温度为60℃，但在45℃下保温180min仍具有84％的酶活(以初始酶活为100％，45℃下保温180min的酶活所占初始酶活的比例)；最适反应pH为10.0，并且具有较宽的pH稳定性，在4℃条件，将该酶与不同pH的缓冲液混匀放置24h后，剩余酶基本保持100％的酶活，具有较好的稳定性。

实施例3.高地芽孢杆菌分泌的果胶酶分解果胶

高地芽孢杆菌生产果胶酶，再将果胶酶按照10U/g的量加入到含有质量分数为0.2％的果胶的体系中，在60℃下反应30min得到半乳糖醛酸。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 一种高地芽孢杆菌及其在产高稳定性碱性果胶酶中的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1445

<212> DNA

<213> Bacillus altitudinis

<400> 3

ggcggcgggc tatactgcaa gtcgagcgga cagaagggag cttgctcccg gatgttagcg 60

gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac 120

cggagctaat accggatagt tccttgaacc gcatggttca aggatgaaag acggtttcgg 180

ctgtcactta cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa 240

ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc 300

cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag 360

caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca 420

agtgcaagag taactgcttg caccttgacg gtacctaacc agaaagccac ggctaactac 480

gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa 540

gggctcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc ggggagggtc 600

attggaaact gggaaacttg agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt gtagcggtga 660

aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc tgtaactgac 720

gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 780

aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag tgctgcagct aacgcattaa 840

gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga cgggggcccg 900

cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg 960

acatcctctg acaaccctag agatagggct ttcccttcgg ggacagagtg acaggtggtg 1020

catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1080

cttgatctta gttgccagca ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg 1140

gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc 1200

tacaatggac agaacaaagg gctgcgagac cgcaaggttt agccaatccc acaaatctgt 1260

tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc tagtaatcgc 1320

ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac 1380

gagagtttgc aacacccgaa gtcggtgagg taacctttat ggagccagcc gccgaagggt 1440

tttca 1445

Claims

1.一种高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，其特征在于，所述高地芽孢杆菌的命名为高地芽孢杆菌CAS-WZS-08，于2021年6月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.22763。

2.一种微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂含有权利要求1所述的高地芽孢杆菌。

3.权利要求1所述的高地芽孢杆菌或权利要求2所述微生物制剂生在产果胶酶中的应用。

4.一种生产果胶酶的方法，其特征在于，所述方法是将权利要求1中的高地芽孢杆菌在37℃温度下、在氧气含量为10％-21％的条件下，至少发酵24-48h时间。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，用于发酵的培养基的成分含有果胶、硫酸铵、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、无水硫酸镁和无水硫化亚铁。

6.权利要求4或5所述的方法产的果胶酶。

7.权利要求1所述的高地芽孢杆菌在分解果胶中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用的步骤为利用权利要求1所述的高地芽孢杆菌生产果胶酶，再将果胶酶按照10U/g的量加入到含有质量分数为0.2％的果胶的体系中，在60℃下反应30min。

9.权利要求1所述的高地芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括如下步骤：将待筛选样品菌悬液稀释涂布于果胶筛选平板中，37℃下培养获得待鉴定菌株后，再次将待鉴定菌的单菌落，接种至LB试管培养基中，37℃条件下培养获得种子液，将待筛选菌株的种子液点接至功能性筛选培养基中，最后将筛选平板置于37℃，15％氧气和85％氮气条件下培养，获得目的菌株。

10.权利要求9所述的筛选方法在固态发酵中功能微生物的筛选中的应用。