CN111635877B - 一株降解木质素的无色杆菌及其在含木质素废水处理中的应用 - Google Patents

一株降解木质素的无色杆菌及其在含木质素废水处理中的应用 Download PDF

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Abstract

一株降解木质素的无色杆菌及其在含木质素废水处理中的应用，涉及工业废水处理技术领域。本发明所述降解木质素的无色杆菌（Achromobacter sp.）CCZU‑WJ6保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19017，所述菌株可应用于工业含木质素废水的降解，尤其在含木质素废水降解时适用的降解培养条件是：温度20℃~40℃，pH4~9，处理后木质素的浓度大大降低。本发明所述菌株及其应用方法与传统方法相比，处理效率高，适用范围广，操作简单，对设备要求不高，运行成本明显降低，解决真菌处理工业含木质素废水程序复杂、需要碳源的问题。

Description

一株降解木质素的无色杆菌及其在含木质素废水处理中的 应用
技术领域
本发明涉及工业废水处理技术领域，具体涉及一株降解木质素的无色杆菌及其在含木质素废水处理中的应用。
背景技术
碱法制浆工业中会含有大量的木质素，不仅难以有高效快速的方法治理并且还会污染环境。
目前，在造纸工业中通常会采用硫酸盐和亚硫酸盐的方法脱除木质素，这些化学方法都存在着能耗高、效率低和二次污染等问题。对于可溶性木质素的处理，生物处理法是目前最有效的方法之一。通过微生物的降解，使木质素高聚合物转化为可以被细菌利用的小分子，并且在木质素含量降低的同时，可以再次利用含盐废水。生物降解法能够减少能耗和化学试剂用量。
由于木质素降解菌株的分离筛选和生物处理工艺的改进完善，生物的方法处理含木质素废水显示出非常高的竞争优势和应用潜力，并且具有处理成本低、适应性强且处理过程稳定等优点。
但是现有技术中存在降解木质素的微生物不易在复杂的废水环境中生长、细菌相对真菌降解率较低、降解产物抑制微生物生长等技术问题。
发明内容
解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供一株降解木质素的无色杆菌及其在含木质素废水处理中的应用，所述降解木质素的无色杆菌可以用于处理含木质素废水，耗时短，效果显著，且处理成本低，具体应用方法其反应条件温和、工艺简单易行、高效可靠。
技术方案：一株降解木质素的无色杆菌（Achromobacter sp.）CCZU-WJ6，其保藏编号为CGMCC No.19017。该无色杆菌CCZU-WJ6 菌落特征:菌落单一、无色透明、圆形、较为湿润，轻微隆起。革兰氏染色显示为阴性，杆状，不产芽孢。并且该菌株能使苯胺蓝染色剂褪色。菌株来源：本发明中所述的微生物菌株无色杆菌CCZU-WJ6是从腐烂木头中筛选得到的。
上述降解木质素的无色杆菌CCZU-WJ6在处理含木质素废水中的应用。
作为优选，具体应用步骤如下：
步骤一. 无色杆菌湿菌体的制备，将无色杆菌CCZU-WJ6活化培养和发酵培养后得到的发酵培养液，经离心得到无色杆菌CCZU-WJ6湿菌体，用pH 4~9的磷酸盐缓冲液洗涤菌体两次，4℃保存待用；
步骤二.对待处理废水进行预处理，抽滤2~3次将废水中不溶性木质素除去，在废水中加入1~2 mol/L的NaOH调pH 至7.0；
步骤三. 往预处理后废水中投加无色杆菌CCZU-WJ6湿菌体，在步骤二处理后的废水中加入步骤一制备的湿菌体，放入摇床有氧培养，温度20~50℃，摇床转速100~250 r/min条件下培养1~9 d；
步骤四. 无色杆菌处理废水效果的测定，在步骤三中投加步骤一制备的湿菌体后，定时取样测定投加菌株前后废水中污染物的变化值，通过重铬酸钾法测定化学需氧量COD，其中重铬酸钾法的消解条件为120℃消解60 min。
作为优选，所述步骤一中活化培养过程如下：将活化培养基的各组分按照以下浓度配制:酵母浸出粉5~100 g/L，蛋白胨10~100 g/L，NaCl 10~100 g/L，pH自然，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却，接入斜面种子无色杆菌CCZU-WJ6，在20~40℃，摇床转速100~250 r/min的条件下培养1~3天，作为活化培养种子液。
作为优选，所述步骤一中发酵培养的过程如下：将发酵培养基的各组分按照以下浓度配制:酵母浸出粉或蔗糖5~100 g/L，蛋白胨10~100 g/L，NaCl 10~100 g/L，pH 5~9，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却，按接种量体积比3~10% 接种活化培养种子液，在温度20~40℃，摇床转速100~250 r/min的条件下培养1~3天后，得到发酵培养液。
作为优选，所述步骤三中湿菌体加入量为0.1-0.9 g/L。
有益效果：本发明通过从腐烂木头中筛选获得的无色杆菌（Achromobacter sp.）CCZU-WJ6是一种革兰氏阴性、能够使苯胺蓝染色剂褪色的细菌，用磷酸盐缓冲溶液冲洗湿菌体后投加到高含木质素废水中处理废水，废水COD由未处理前的58.54 g/L 降至 34.61g/L以下，尤其是当接菌量为0.5 g/L时，处理时间一天，废水COD去除率达到40.60%以上。在废水中加入0.5~2.0 g/L的湿菌体，可以自行废水处理，成本低廉，对设备要求不高，在工业上是一种有效的降解高难度有机废水的新方法。
保藏信息：本发明的菌种保藏日期为2019年11月27日，保藏编号为：CGMCCNo.19017，分类命名为无色杆菌（Achromobacter sp.）CCZU-WJ6，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
附图说明
图1 为本发明实施例7中接菌量为0.5 g/L、培养时间为6 d时菌处理废水后的全波段扫描图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述，但应该了解的是，这些实施仅为例示说明之用，而不应被解释为本发明实施的限制。
实施例1：无色杆菌（Achromobacter sp.）CCZU-WJ6的分离驯化
本发明所述无色杆菌（Achromobacter sp.）CCZU-WJ6的分离驯化过程如下：
1）样品，样品为自然界中腐烂的木头；
2）培养基
初筛培养基：碱性木质素培养基。碱性木质素培养基（g/L）：碱性木质素2，硫酸铵1.33，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1，磷酸氢二钠0.2，琼脂20，pH7.0。
复筛培养基：苯胺蓝固体培养基。苯胺蓝固体培养基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏5，氯化钠10，苯胺蓝0.08，pH7.0。
富集培养基：LB培养基。富集培养基（g/L）:蛋白胨10，酵母浸粉5，氯化钠10，pH7.0。
3）初筛、复筛及发酵培养操作
初筛：将5 g腐烂的木头放入100 mL富集培养基中，37℃，180 r/min富集培养72h，用无菌水进行梯度稀释，涂布于初筛固体培养基上，37℃培养48 h，挑取生长良好，不同形态不同颜色的菌落，进行划线分离并通过七次划线来进行纯化。
复筛：用灭过菌的接种环挑取初筛固体培养基中已经纯化过的菌落，接种于苯胺蓝和愈创木酚固体培养基上，37℃下培养24 h，观察培养基上是否发生颜色变化。
富集培养基：用灭过菌的接种环挑取复筛固体培养基中发生颜色变化的菌落于富集培养基中，37℃下180 r/min摇床振荡培养48 h，编号为 CCZU-WJ6。
对上述获得的菌株进行形态鉴定及分子鉴定，结果如下：
该无色杆菌(Achromobacter sp.)CCZU-WJ6 菌落特征:菌落单一、无色透明、圆形、较为湿润，轻微隆起。革兰氏染色显示为阴性，杆状，不产芽孢，并且该菌株能使苯胺蓝染色剂褪色。
实施例2：无色杆菌（Achromobacter sp.）CCZU-WJ6 湿菌体的制备
将活化培养基的各组分按照以下浓度配制：酵母浸出粉 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L，pH自然，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却，接入斜面种子（实施例1中制备得到的无色杆菌(Achromobacter sp.)CCZU-WJ6），在30℃，摇床转速250 r/min 的条件下培养1天，作为活化培养种子液。
将发酵培养基的各组分按照以下浓度配制：蔗糖 20 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0，121℃灭菌 20 分钟，灭菌后冷却，按接种量体积比10% 接种活化培养种子液，在温度30℃，摇床转速180 r/min的条件下培养1天后，得发酵培养液。将发酵培养液离心10min(8000 r/min)收集无色杆菌CCZU-WJ6湿菌体，用磷酸盐缓冲液（0.1M，pH 7.0）洗涤菌体两次，4℃保存待用，发酵液中湿菌体的量约为 5g/L。
实施例3：无色杆菌（Achromobacter sp.）CCZU-WJ6 湿菌体的制备
同实施例2，区别在于，将发酵培养基的各组分按照以下浓度配制: 酵母浸出粉5g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH自然。
实施例4：无色杆菌（Achromobacter sp.）CCZU-WJ6 湿菌体的制备
同实施例3，区别在于，将活化培养基的各组分按照以下浓度配制:酵母浸出粉100g/L，蛋白胨100 g/L，NaCl 100 g/L，pH自然。
本实施例2-4在培养基组分及其浓度配制不同，在实施例3的条件下，无色杆菌CCZU-WJ6更快进入对数期和稳定期，缩短了发酵培养的时间。
实施例5：不同菌体量浓度无色杆菌CCZU-WJ6 湿菌体在处理含木质素废水中的应用
本实施例中含木质素废水为强碱和高温处理后的秸秆处理液，可溶性固体含量中可溶性木质素含量高达95 %，葡萄糖1.8 %，木糖1.9%，木聚糖1.0%。
对待处理废水进行预处理，抽滤2~3次将废水中不溶性木质素除去，在废水中加入1~2 mol/L的NaOH调pH 至7.0。
无色杆菌(Achromobacter sp.)CCZU-WJ6按实施例3方法培养后，称取浓度分别为0.1 g/L、0.5 g/L和0.9 g/L的湿菌体加入到装有100 mL预处理后的废水的250 mL锥形瓶中，于30℃，180 r/min条件下摇床培养6天，取样测 COD，并计算化学需氧量COD去除率，结果如表1所示。
表1不同菌体浓度下废水降解前后 COD结果
菌体量/ g·L<sup>-1</sup> 化学需氧量 COD/g·L<sup>-1</sup> 化学需氧量COD去除率/%
0.1 43.64 25.45
0.5 34.19 41.60
0.9 36.37 37.87
注：废水处理前化学需氧量COD为58.54 g·L-1
从上表中可以看出，当菌体量为0.5 g/L时，COD去除率最高，废水中木质素去除效果最好。
实施例6 菌体量浓度为0.5g/L无色杆菌CCZU-WJ6 湿菌体在处理含木质素废水中的应用
本实施例中含木质素废水为强碱和高温处理后的秸秆处理液，可溶性固体含量中可溶性木质素含量高达95%，葡萄糖1.8%，木糖1.9%，木聚糖1.0%。
对待处理废水进行预处理，抽滤2~3次将废水中不溶性木质素除去，在废水中加入1~2 mol/L的NaOH调pH 至7.0。
无色杆菌CCZU-WJ6 按实施例3方法培养后，称取浓度为0.5 g/L的湿菌体加入到装有100 mL预处理后的废水的250 mL锥形瓶中，于30℃，180 r/min条件下摇床培养9 d，期间定时（0 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d和9 d）取样测COD值并计算COD降解率，结果如表2所示。
表2 接菌量为0.5g/L时不同时间菌体处理废水COD结果
处理时间 /d 0 3 4 5 6 7 8 9
化学需氧量 COD/g·L<sup>-1</sup> 58.54 46.58 37.83 36.48 34.61 37.18 45.26 45.84
化学需氧量 COD去除率 /% - 20.43 35.38 37.68 40.87 36.49 22.69 21.69
从上表中可以看出，处理6天后废水的化学需氧量COD的去除率高达40.87%，具有显著的废水处理能力。
实施例7
本实施例中含木质素废水为强碱和高温处理后的秸秆处理液，可溶性固体含量中可溶性木质素含量高达95%，葡萄糖1.8%，木糖1.9%，木聚糖1.0%。
对待处理废水进行预处理，抽滤2~3次将废水中不溶性木质素除去，在废水中加入1~2 mol/L的NaOH调pH 至7.0。
无色杆菌CCZU-WJ6按实施例3方法培养后，称取浓度为0.5 g/L的湿菌体加入到装有100 mL预处理后的废水的250 mL锥形瓶中，于30℃，180 r/min条件下摇床培养6天，取样进行全波段扫描，并测定OD280，计算木质素降解率，测定结果参见表3。
表3 培养时间6 d接菌量为0.5 g/L的菌体处理废水前后的OD280、木质素含量（通 过木质素标准曲线计算）及木质素降解率结果
OD<sub>280</sub> 木质素含量/ (mg/mL) 木质素降解率/%
废水处理前 0.494 46.39 -
废水处理后 0.334 31.5 32.1
接菌量为0.5g/L培养时间6 d时，菌处理废水后的全波段扫描图如图1所示。从图1和表3中可以看出，在一定培养时间和接菌量条件下，无色杆菌CCZU-WJ6能够有效降解废水中的可溶性木质素，木质素的降解率高达32.1%。
实施例7
一株降解木质素的无色杆菌（Achromobacter sp.）CCZU-WJ6，其保藏编号为CGMCCNo.19017。
上述降解木质素的无色杆菌在处理含木质素废水中的应用。具体应用步骤如下：
步骤一. 无色杆菌湿菌体的制备，将无色杆菌CCZU-WJ6活化培养和发酵培养后得到的发酵培养液，经离心得到无色杆菌CCZU-WJ6湿菌体，用pH 4的磷酸盐缓冲液洗涤菌体两次，4℃保存待用，活化培养过程如下：将活化培养基的各组分按照以下浓度配制:酵母浸出粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L，pH自然，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却，接入斜面种子无色杆菌CCZU-WJ6，在20℃，摇床转速100 r/min的条件下培养1天，作为活化培养种子液；发酵培养过程如下：将发酵培养基的各组分按照以下浓度配制:酵母浸出粉或蔗糖5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L，pH 5，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却，按接种量体积比3%接种活化培养种子液，在温度20℃，摇床转速100 r/min的条件下培养1天后，得到发酵培养液；
步骤二.对待处理废水进行预处理，抽滤2次将废水中不溶性木质素除去，在废水中加入1 mol/L的NaOH调pH 至7.0；
步骤三. 往预处理后废水中投加无色杆菌CCZU-WJ6湿菌体，在步骤二处理后的废水中加入步骤一制备的湿菌体，放入摇床有氧培养，温度20℃，摇床转速100 r/min条件下培养1 d，湿菌体加入量为0.1 g/L；
步骤四. 无色杆菌处理废水效果的测定，在步骤三中投加步骤一制备的湿菌体后，定时取样测定投加菌株前后废水中污染物的变化值，通过重铬酸钾法测定化学需氧量COD。
实施例8
一株降解木质素的无色杆菌（Achromobacter sp.）CCZU-WJ6，其保藏编号为CGMCCNo.19017。
上述降解木质素的无色杆菌在处理含木质素废水中的应用。具体应用步骤如下：
步骤一. 无色杆菌湿菌体的制备，将无色杆菌CCZU-WJ6活化培养和发酵培养后得到的发酵培养液，经离心得到无色杆菌CCZU-WJ6湿菌体，用pH 9的磷酸盐缓冲液洗涤菌体两次，4℃保存待用，活化培养过程如下：将活化培养基的各组分按照以下浓度配制:酵母浸出粉100 g/L、蛋白胨100 g/L、NaCl 100 g/L，pH自然，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却，接入斜面种子无色杆菌CCZU-WJ6，在40℃，摇床转速250 r/min的条件下培养3天，作为活化培养种子液；发酵培养过程如下：将发酵培养基的各组分按照以下浓度配制:酵母浸出粉或蔗糖100 g/L、蛋白胨100 g/L、NaCl 100 g/L，pH 9，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却，按接种量体积比10% 接种活化培养种子液，在温度40℃，摇床转速250 r/min的条件下培养3天后，得到发酵培养液；
步骤二.对待处理废水进行预处理，抽滤2~3次将废水中不溶性木质素除去，在废水中加入2 mol/L的NaOH调pH 至7.0；
步骤三. 往预处理后废水中投加无色杆菌CCZU-WJ6湿菌体，在步骤二处理后的废水中加入步骤一制备的湿菌体，放入摇床有氧培养，温度50℃，摇床转速250 r/min条件下培养9 d，湿菌体加入量为0.9 g/L；
步骤四. 无色杆菌处理废水效果的测定，在步骤三中投加步骤一制备的湿菌体后，定时取样测定投加菌株前后废水中污染物的变化值，通过重铬酸钾法测定化学需氧量COD。
另外，利用本发明所述菌株的培养条件和生物转化工艺，除了碱液处理秸秆后的废水，还可应用于其他含木质素废水的处理。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (6)

1.一株降解木质素的无色杆菌（Achromobacter sp.）CCZU-WJ6，其保藏编号为CGMCCNo.19017。
2.权利要求1所述的降解木质素的无色杆菌在处理含木质素废水中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体应用步骤如下：
步骤一. 无色杆菌湿菌体的制备，将无色杆菌CCZU-WJ6活化培养和发酵培养后得到的发酵培养液，经离心得到无色杆菌CCZU-WJ6湿菌体，用pH 4~9的磷酸盐缓冲液洗涤菌体两次，4℃保存待用；
步骤二.对待处理废水进行预处理，抽滤2~3次将废水中不溶性木质素除去，在废水中加入1~2 mol/L的NaOH调pH 至7.0；
步骤三. 往预处理后废水中投加无色杆菌CCZU-WJ6湿菌体，在步骤二处理后的废水中加入步骤一制备的湿菌体，放入摇床有氧培养，温度20~50℃，摇床转速100~250 r/min条件下培养1~9 d；
步骤四. 无色杆菌处理废水效果的测定，在步骤三中投加步骤一制备的湿菌体后，定时取样测定投加菌株前后废水中污染物的变化值，通过重铬酸钾法测定化学需氧量COD。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤一中活化培养过程如下：将活化培养基的各组分按照以下浓度配制:酵母浸出粉5~100 g/L、蛋白胨10~100 g/L、NaCl 10~100 g/L，pH自然，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却，接入斜面种子无色杆菌CCZU-WJ6，在20~40℃，摇床转速100~250 r/min的条件下培养1~3天，作为活化培养种子液。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤一中发酵培养过程如下：将发酵培养基的各组分按照以下浓度配制:酵母浸出粉或蔗糖5~100 g/L、蛋白胨10 ~100 g/L、NaCl 10~100 g/L，pH 5~9，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却，按接种量体积比3~10% 接种活化培养种子液，在温度20~40℃，摇床转速100~250 r/min的条件下培养1~3天后，得到发酵培养液。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤三中湿菌体加入量为0.1-0.9 g/L。
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