CN113830902A

CN113830902A - 脱氮副球菌在去除高盐废水中硝态氮中的应用

Info

Publication number: CN113830902A
Application number: CN202111112003.0A
Authority: CN
Inventors: 袁绍辉; 张兆斌; 孙惠春; 孙志刚; 毛赛亚
Original assignee: Qingdao Shangde Biotechnology Co ltd
Current assignee: Qingdao Shangde Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-09-23
Filing date: 2021-09-23
Publication date: 2021-12-24

Abstract

本发明提供了脱氮副球菌在去除高盐废水中硝态氮中的应用。所述脱氮副球菌为保藏编号为CGMCC No.20363的脱氮副球菌GBW‑HB1904，其具有耐高盐性，可以在25‰～45‰的盐浓度下正常生长。利用该菌制得的脱氮副球菌GBW‑HB1904发酵液，能够单独使用，或者与载体复合成微生物菌剂使用，对高盐废水中硝态氮的去除率高于95%，能够有效改善高盐度水体中硝态氮的生物处理效果，同时还可进一步提升污水处理设施在高盐极端环境条件下的脱氮效率及运行稳定性，具有广阔的应用前景和价值。

Description

脱氮副球菌在去除高盐废水中硝态氮中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及脱氮副球菌在去除高盐废水中硝态氮中的应用。

背景技术

高盐废水一般是指总含盐质量分数至少在1%的废水，其主要来源于化工厂、食品加工厂、垃圾渗滤液以及石油和天然气的采集加工等领域。这种废水水质中通常含有多种生物抑制物质，主要包含盐、重金属、油及放射性物质等。随着工业的发展，高盐废水的产生途径也在广泛增加，其排放水量也在逐年提升。因此，去除高盐污水中的有机污染物对环境造成的影响至关重要。当通过生物法进行处理时，高浓度的盐类物质对微生物具有较高的抑制作用，一般的微生物很难承受，会失活而无法发挥有效的作用。若采用物化法处理这些高盐废水，不仅投资大，运行费用高，而且难以达到预期的净化效果。故采用生物法对此类废水进行处理，目前仍是国内外研究的重点。

因此，有针对性的筛选和寻找耐盐微生物和嗜盐微生物，会在高含盐废水处理中发挥积极作用，并且对耐盐菌或嗜盐菌的有效利用也是提升与改善生化法处理高盐废水的最佳方法。

发明内容

本发明为了克服现有技术中的不足和缺陷，提供了脱氮副球菌在去除高盐废水中硝态氮中的应用，所述脱氮副球菌GBW-HB1904具有耐高盐特性，能够高效去除高盐废水中的硝态氮。

为实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：

本发明提供了脱氮副球菌（Paracoccus denitrificans）在去除高盐废水中硝态氮中的应用。

进一步的，所述脱氮副球菌为保藏编号为CGMCC No.20363的脱氮副球菌GBW-HB1904。

进一步的，所述脱氮副球菌的具体应用步骤为：

（1）将脱氮副球菌GBW-HB1904经培养发酵制得脱氮副球菌GBW-HB1904发酵液；

（2）将发酵液高速离心，收集沉淀，并利用体积为沉淀物重量30~50倍的无菌水重悬，再将重悬液以1%~5%的体积比加入高盐废水中，处理60~84 h。

进一步的，所述高盐废水中硝态氮的浓度为0 mg/L~400 mg/L。

优选的，所述高盐废水中硝态氮的浓度为50 mg/L~250 mg/L。

进一步的，所述脱氮副球菌的具体应用步骤为：

（2）将发酵液以高盐废水处理生化系统中缺氧池污水处理量的0.1‰~0.5‰的用量，直接加入至处理生化系统中处理高盐废水60~84 h。

优选的，所述处理高盐废水的时间为72h。

进一步的，所述高盐水体的盐度为10‰～45‰。

进一步的，所述脱氮副球菌GBW-HB1904能够去除高盐废水中95%以上的硝态氮。

进一步的，所述脱氮副球菌GBW-HB1904具有耐高盐性。

进一步的，所述脱氮副球菌GBW-HB1904的生长盐度范围为25～45‰。

进一步的，所述脱氮副球菌GBW-HB1904的生长温度为15～40℃，最适的生长温度为28-32℃。

进一步的，所述脱氮副球菌GBW-HB1904的生长pH值为6～9，最适生长pH值为7.0-8.0。

进一步的，所述脱氮副球菌GBW-HB1904为兼性厌氧菌，其生长溶解氧浓度为0.2～4mg/L。

进一步的，所述脱氮副球菌GBW-HB1904培养5h后进入对数生长期，18-20 h时进入对数生长末期，菌数达到1×10¹⁰ CFU/mL。

进一步的，所述脱氮副球菌GBW-HB1904的适宜生长的培养基配方包括：葡萄糖50g/L、玉米浆干粉10g/L、NaCl 5g/L、NaNO₃ 2g/L、KH₂PO₄ 0.2g/L、FeSO₄·7H₂O 0.05g/L、Na₂HPO₄ 5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L。

进一步的，所述脱氮副球菌GBW-HB1904发酵液的具体制备步骤为：将脱氮副球菌GBW-HB1904接种至改良NB培养基中，pH 7.0~7.5，温度为30℃，恒温培养20~24 h后，按15%的体积比接种至发酵培养基中，在罐压0.1MPa，温度30℃，溶氧≥30%，搅拌速度180rpm的条件下，发酵时间20～24h，即得到脱氮副球菌GBW-HB1904发酵液。

进一步的，所述脱氮副球菌GBW-HB1904发酵液的菌含量不低于1.0×10¹⁰CFU/mL。

进一步的，所述脱氮副球菌GBW-HB1904发酵液能够单独使用，或者与载体复合成微生物菌剂使用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：

本发明的脱氮副球菌GBW-HB1904分离自高盐水体环境，具有耐高盐性，在25‰～45‰的盐度范围内均能生长良好。脱氮副球菌GBW-HB1904在体外培养繁殖快，在18-20h就能达到对数末期；其在高盐环境中，具有快速去除高盐废水中硝态氮的能力，且降解率能够达到95%以上，因此具有很好的硝态氮去除能力，适合单独或与其他载体复合，制备成微生物菌剂用于开发去除高盐度废水中硝态氮的产品。脱氮副球菌GBW-HB1904在去除硝态氮时，使用方法简单，能够有效解决高盐度污水处理系统生化性差，总氮去除效率低等问题，同时还可进一步提升和改善污水处理设施在高盐极端环境条件下的脱氮效率及运行稳定性，具有广阔的应用前景和价值。

附图说明

图1为所述脱氮副球菌GBW-HB1904在改良NB固体培养基平板上的菌落形态特征。

图2为所述脱氮副球菌GBW-HB1904的生长曲线。

图3为所述脱氮副球菌GBW-HB1904对高盐腌制废水中硝态氮降解率的影响。

具体实施方式

结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。

下述实施例中所需培养基的配方如下：

1、高盐度硝态氮降解菌富集筛选液体培养基：葡萄糖10g，NaNO₃2g，Na₂CO₃1.5 g，K₂HPO₄1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，FeSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 40g，pH 7.0~8.0，蒸馏水1L。

2、高盐度硝态氮降解菌分离纯化固体培养基：葡萄糖10g，NaNO₃2g，Na₂CO₃1.5 g，K₂HPO₄1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，FeSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 40g，琼脂粉15g，pH 7.0～8.0，蒸馏水1L。

3、改良营养肉汤（NB）培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，NaNO₃2g/L、FeSO₄·7H₂O 0.05g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1 g/L、水1L、pH 7.0～7.5。

4、改良营养肉汤（NB）固体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，NaNO₃ 2g/L、FeSO₄·7H₂O 0.05g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1 g/L、琼脂粉15g、水1L、pH 7.0～7.5。

5、发酵培养基：葡萄糖50g/L、玉米浆干粉10g/L、NaCl 5g/L、NaNO₃ 2g/L、KH₂PO₄0.2g/L、FeSO₄·7H₂O 0.05g/L、Na₂HPO₄ 5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、余量为水，液体培养基的pH为7.0～7.5。

以上培养基在使用前，均需在121℃下灭菌20min，然后室温保存。

实施例1：脱氮副球菌GBW-HB1904的筛选、分离与鉴定

1、脱氮副球菌GBW-HB1904的筛选与纯化

取垃圾渗滤液与食品厂腌制食品废水各5g，加入100mL的PBS缓冲溶液中，振荡30min，使样品充分混匀，1000 rpm离心2min，收集样品上清液，备用。取5mL上述样品上清液，分别加入到装有100mL高盐度硝态氮降解菌富集筛选液体培养基的锥形瓶中，30℃，160rpm恒温摇床培养2d，富集3次。取培养的菌悬液梯度稀释后取100μL涂布于高盐度硝态氮降解菌富集筛选固体培养基上，置于30℃培养箱培养。在48h之后，挑取不同形态单菌落在改良营养肉汤（NB）固体培养基上划线培养，重复分离纯化3次，最后得到单菌落，将该单菌落命名为GBW-HB1904。

如图1所示，所述菌株GBW-HB1904在改良营养肉汤（NB）固体培养基平板上的菌落为圆形，乳白色，直径1-2μm，表面光滑湿润有光泽，中间略凸起，不透明，边缘整齐，无晕环。

2、脱氮副球菌GBW-HB1904的鉴定

以所述的菌株GBW-HB1904的DNA为模板，使用16S rRNA通用引物进行扩增，扩增片段进行序列测定，将得到的菌株GBW-HB1904的16S rDNA测序结果与GenBank中的序列进行比对分析，结果显示，菌株GBW-HB1904与Paracoccus denitrificans的同源性最高，因此确定该菌株GBW-HB1904为脱氮副球菌。

将筛选到的菌株GBW-HB1904进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年07月15日；脱氮副球菌Paracoccus denitrificans的保藏编号为：CGMCC No.20363。

实施例2：脱氮副球菌GBW-HB1904的生长测定及生理生化特征

1、脱氮副球菌GBW-HB1904的生长测定

将斜面培养的脱氮副球菌GBW-HB1904接种至改良NB培养基中，在pH 7.0~7.5，28~32℃下恒温摇床培养26 h，制得GBW-HB1904菌液，其中每1.0 h取样一次，在OD600 nm下测定吸光值，绘制生长曲线图。如图2所示，实验结果表明，GBW-HB1904在培养的前5h为生长迟缓期，随后进入对数生长期，待培养至18~20 h时进入对数生长末期，菌数达到1.0×10¹⁰CFU/mL，20~24h为生长稳定期，接着进入衰亡期，从而完成整个生长周期。

2、脱氮副球菌GBW-HB1904的生理生化特征

将制得的GBW-HB1904菌液在NB培养基中进一步培养后，根据《伯杰细菌鉴定手册》的菌株生理生化检测方法对脱氮副球菌GBW-HB1904进行检测。

结果如表1所示，脱氮副球菌GBW-HB1904在15～40℃温度范围都能正常生长，最适生长温度为28～32℃；在pH值6～9的范围内均能生长，最适生长pH值为7.0～8.0；在溶氧含量0.2～4mg/L范围内都能正常生长，最适生长溶解氧浓度在1～3mg/L，因此，脱氮副球菌GBW-HB1904属于兼性厌氧菌；并且该菌能够产生尿素酶、β-葡萄糖苷酶和甘油，同时还能够降解动力-硝酸盐和西蒙式枸橼酸盐及分解半固体琼脂。另外，脱氮副球菌GBW-HB1904适宜生长的培养基配方如下：葡萄糖50g/L、玉米浆干粉10g/L、NaCl 5g/L、NaNO₃ 2g/L、KH₂PO₄0.2g/L、FeSO₄·7H₂O 0.05g/L、Na₂HPO₄ 5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、余量为水，液体培养基的pH为7.0～7.5。

表1 脱氮副球菌GBW-HB1904的生理生化特征

粘液酸	-	粘液酸质控	-
				水杨苷	-	七叶苷	-
VP实验	-	动力-硝酸盐	+
				西蒙式柠檬酸盐	-	西蒙式枸橼酸盐	+
鸟氨酸脱羧酶	-	赖氨酸脱羧酶	-
				尿素酶	+	ONPG	-
β-葡萄糖苷酶	+	酚红	-
				3%过氧化氢酶	-	吲哚产生	-
甘油	+	半固体琼脂	+

注：<+>表示阳性，<->表示阴性。

实施例3：脱氮副球菌GBW-HB1904的盐度耐受试验

为了检验脱氮副球菌GBW-HB1904在高盐度条件下的存活性能，对其在不同盐度条件下的生长情况进行分析检测。调整氯化钠在NB培养基中的用量配制成不同盐浓度的培养基，然后将斜面培养的脱氮副球菌GBW-HB1904接种至不同盐浓度的NB培养基中，在pH为7.0~7.5，温度为30℃的恒温摇床中培养20h，得到脱氮副球菌GBW-HB1904培养液，检测该脱氮副球菌在不同盐浓度培养基中的生长状况。结果如表2所示，GBW-HB1904具有广盐性，在25‰～45‰盐度范围内均能生长良好。

表2 脱氮副球菌GBW-HB1904在不同盐浓度中的生长情况

实施例4：高盐条件下的总氮（硝态氮）去除率测试

采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法（GB-11894-89）检测水体总氮浓度。模拟高盐度（盐度4%、温度30℃、pH 7.5、溶解氧≤0.5mg/L）条件下，脱氮副球菌GBW-HB1904发酵液对含有不同初始浓度的硝态氮水体的72h脱氮应用处理实验，并计算硝态氮去除率，每个浓度梯度设3个重复实验。

将斜面培养的脱氮副球菌GBW-HB1904接种至改良NB培养基中，在pH 7.0~7.5，温度为30℃的恒温摇床中培养20h，得到脱氮副球菌GBW-HB1904种子液；将脱氮副球菌GBW-HB1904的种子液按15%的体积比接种至发酵培养基中，调整罐压为0.1MPa，温度30℃，溶氧≥30%，搅拌速度为180rpm，发酵22h，得到脱氮副球菌GBW-HB1904发酵液。取120mL发酵液离心，随后加入30mL无菌水将沉淀的菌体重悬混匀，然后各取2mL菌悬液分别加入到体系均为200 mL的5个不同初始硝态氮浓度（50mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L）的测试液中，进行72h的硝态氮去除率试验。

结果如表3所示，经过72h的脱氮应用处理后，脱氮副球菌GBW-HB1904在高盐度条件下对多种不同初始浓度的硝态氮都具备很好的去除效果，且去除率均在95%以上，表明该菌株在高盐度条件下具有快速降解高盐废水中硝态氮的功能，在对高盐度废水中硝态氮的去除方面具备重大应用价值与意义。

表3 脱氮副球菌GBW-HB1904的72h硝态氮去除率测试结果

实施例5：脱氮副球菌GBW-HB1904对高盐腌制废水中硝态氮去除率的评价

采集济宁市某高盐腌制产品生产厂废水处理生化系统缺氧池中的废水水样，将废水等量分装在8个1L的玻璃三角瓶中，每个三角瓶分装0.8L的高盐废水，共分为6组，每组2个平行，其中空白（CK）组为不加脱氮副球菌GBW-HB1904发酵液的空白对照组，其他试验条件与试验组均相同，试验组分为T1、T2、T3、T4与T5组，对应每组的发酵液的添加量分别为缺氧池污水处理量的0.1‰、0.2‰、0.3‰、0.4‰和0.5‰。试验开始前对各组样品中硝态氮的初始浓度进行留样检测，控制各组pH值在7.0~8.0之间，且各组均在室温状态下静止培养处理，每间隔8h对各组样品中pH值与硝态氮浓度进行跟踪检测，并分析水样中硝态氮的降解率，整个试验周期为72h。

试验结果如图3所示，各试验组较空白对照组均能显著提高水样中硝态氮的降解速率，且最终降解率均在95%以上。另外，不同添加发酵液量的试验组之间，TI与T2组在前期的启动效率略低于其他三个组，且其他三组之间对比无明显差异。尽管在启动前期脱氮副球菌GBW-HB1904发酵液添加量为0.1‰与0.2‰的组效率稍慢于其他三个组，但整体各试验组在提升硝态氮最终降解率方面没有显著差异，表明在较低添加量条件下，脱氮副球菌GBW-HB1904发酵液也具备高效去除高盐腌制产品生产废水中硝态氮的能力。

本发明所述的脱氮副球菌GBW-HB1904在实际应用中使用方法简单，且具备广耐盐性，可以将其制成菌含量不少于1.0×10¹⁰CFU/mL的发酵液后，按照生化处理系统中缺氧池污水处理量的0.1‰-0.5‰的用量，直接从生化系统缺池进水口添加至污水系统中即可，该菌及其发酵液可以显著提升与改善多种高盐废水中硝态氮的去除效率，故其市场前景广阔，具备产业化价值。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims

1.脱氮副球菌（Paracoccus denitrificans）在去除高盐废水中硝态氮中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脱氮副球菌为保藏编号为CGMCCNo.20363的脱氮副球菌GBW-HB1904。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述脱氮副球菌的具体应用步骤为：

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述高盐废水中硝态氮的浓度为0 mg/L~400 mg/L。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述脱氮副球菌的具体应用步骤为：

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述高盐水体的盐度为10‰～45‰。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述脱氮副球菌GBW-HB1904能够去除高盐废水中95%以上的硝态氮。

8.根据权利要求3或者权利要求5所述的应用，其特征在于，所述脱氮副球菌GBW-HB1904发酵液的具体制备步骤为：将脱氮副球菌GBW-HB1904接种至改良NB培养基中，pH7.0~7.5，温度为30℃，恒温培养20~24 h后，按15%的体积比接种至发酵培养基中，在罐压0.1MPa，温度230℃，溶氧≥30%，搅拌速度180rpm的条件下，发酵时间20～24h，即得到脱氮副球菌GBW-HB1904发酵液。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述脱氮副球菌GBW-HB1904发酵液的菌含量不低于1.0×10¹⁰CFU/mL。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述脱氮副球菌GBW-HB1904发酵液能够单独使用，或者与载体复合成微生物菌剂使用。