CN114250173B - 一种肇东假单胞菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种低温脱氮的肇东假单胞菌株(Pseudomonas zhaodongensis)及包含其的微生物菌剂，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.23567，该菌株能够在低至5℃的温度下保持优异的除总氮效果，在8℃条件下，总氮降解率达到96％以上，硝酸盐态氮的降解率能达到97％以上，亚硝酸盐态氮的降解率达到100％，氨氮降解率也能达到99％以上，且随着温度的升高降解效率逐步提高。

Description

一种肇东假单胞菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种肇东假单胞菌株及包含其的微生物菌剂，具体涉及一种能够在低至5℃的温度下仍然具有优异的降解水中含氮物质的肇东假单胞菌株及其应用，属于环境微生物技术领域。
背景技术
随着国家工业化的发展与人民生活水平的提高，用水量的日益提升与污染物的排放使得水资源污染问题变得越来越严重。由于水污染而产生的环境事件、公共安全事件甚至重大社会事件，严重影响人民的身体健康和社会的和谐稳定，直接威胁到人类的生存空间。
在污水处理过程中，污水中的有机物和氮、磷等营养物质可通过代谢作用被微生物降解和利用。在污水处理中起主要作用的是在常温下具有较高活性和降解能力的中温菌，最佳温度为25～35℃，但在冬季水温偏低，我国北方气温通常低于10℃，当水温下降到15-7℃时，系统降解效果会明显下降，利用传统的活性污泥法为主的工艺技术的处理效能大幅下降，出水水质达标保障率极低，通常的解决方法是降低污泥负荷，延长水力停留时间，这样会导致污水厂的占地面积增大，运转费用变高，所以筛选在低温下有高效降解总氮能力的菌株显得尤为重要。
自20世纪70年代中期以来，低温微生物菌剂已在世界范围内的污水处理中得到长足的发展和普遍的应用，并且取得了较好的处理效果，但是在研究和应用中尚存在以下不足之处：
1.大部分研究只停留在研究阶段，尚未形成成熟的产品；
2.且多数研究中菌种的接种量过大，实际应用中成本较高；
3.最低有效温度大多数为10℃以上，应用成本较高。
发明内容
本发明针对水净化领域中现有的低温微生物菌种和菌剂所存在的不足，提供一种能够在低至5℃的温度下具有优异的降解总氮的效果，并且随着温度升高降解效率逐步提高的肇东假单胞菌株、包含其的微生物菌剂、微生物菌剂的制备方法及应用。
本发明要求保护一种低温脱氮的肇东假单胞菌株Pseudomonas zhaodongensisDB-LT01，其16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.23567，保藏日期为2021年10月11日。
本发明还要求保护包含上述肇东假单胞菌株的微生物菌剂。
本发明技术方案的有益效果是：
(1)本发明筛选出来的肇东假单胞菌株耐低温，能够在低至5℃的温度下保持优异的除总氮效果，在8℃条件下，总氮降解率达到96％以上，硝酸盐态氮的降解率能达到97％以上，亚硝酸盐态氮的降解率达到100％，氨氮降解率也能达到99％以上，且随着温度的升高降解效率逐步提高，应用于污水处理中后，能够减少水体升温所需的费用；
(2)本发明的微生物菌剂活菌数高，添加量可低至50ppm，能够降低购买菌种或微生物菌剂所需的费用；
(3)本发明的微生物菌剂采用液体形式，成本比市面上的固体菌剂低10倍以上，不破坏原始环境、无二次污染、处理效果好、操作简便，菌剂应用领域广、普适性强。
上述包含肇东假单胞菌株的微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)一级种子培养：无菌条件下取肇东假单胞菌株接种于富集培养基中，于25-35℃、100-150rpm的条件下培养12-36h，得到一级种子培养液；
(2)二级种子培养：无菌条件下将一级种子培养液按照1-3vol％的接种量接种于富集培养基中，于25-35℃、100-150rpm的条件下培养12-36h，得到二级种子培养液；
(3)发酵：待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后，将步骤(2)所得的二级种子培养液按照0.1-0.5vol％的接种量接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃，通气比为1:(1-2)，150-300rpm的条件下发酵，待溶氧开始上升时停止发酵，得发酵液；
(4)制备微生物菌剂：将步骤(3)所得的发酵液稀释灌装，即得微生物菌剂。
进一步，所述富集培养基的组成如下：硝酸钾2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠200g/L，余量为水，且pH为6.5-8。
进一步，所述发酵培养基的组成如下：碳源15-30g/L，氮源5-15g/L，K+ 0.2-0.4g/L，Mg2+ 0.05-0.1g/L，Na+ 0.05-0.1g/L，Mn2+(1.5-3.5)*10-3g/L，Fe3+或Fe2+(1-2)*10-3g/L，余量为水，且pH为6.5-8。
优选的，所述发酵培养基的组成如下：碳源20-25g/L，氮源8-12g/L，K+ 0.2-0.4g/L，Mg2+ 0.05-0.08g/L，Na+ 0.05-0.08g/L，Mn2+(2.0-3.0)*10-3g/L，Fe3+或Fe2+(1-1.5)*10- 3g/L，余量为水，pH为6.5-7.5；
进一步，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、淀粉、醋酸钠或丁二酸钠中的一种或多种。
进一步，所述氮源选自酵母浸粉、蛋白胨、尿素、硫酸铵或硝酸钾中的一种或多种。
优选的，所述K+的来源为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸钾、氯化钾、硝酸钾中的一种或多种，所述Mg2+的来源为硫酸镁、硝酸镁、氯化镁中的一种或多种，所述Na+的来源为氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、碳酸钠、醋酸钠、琥珀酸钠中的一种或多种，所述Mn2+的来源为一水硫酸锰、硝酸锰、氯化锰中的一种或多种，所述Fe3+的来源为氯化铁、硝酸铁、硫酸铁中的一种或多种，所述Fe2+的来源为硫酸亚铁、氯化亚铁、硫酸亚铁中的一种或多种。
微生物菌剂的制备方法中所述的通气比是指每分钟内通入发酵罐的空气体积与发酵液总体积之比。
该制备方法的有益效果是：采用本发明的发酵工艺，发酵周期缩短至7h，发酵残留营养物质低，活菌数高达400亿cfu/ml，菌体活力强，在最佳pH＝9.0的条件下，冬季液体保存时限长达2个月不衰减。
本发明还要求保护使用肇东假单胞菌株Pseudomonas zhaodongensis DB-LT01或包含肇东假单胞菌株Pseudomonas zhaodongensis DB-LT01的微生物菌剂净化水体的方法，包括向水体中接种肇东假单胞菌株Pseudomonas zhaodongensis DB-LT01或向水体中施加包含肇东假单胞菌株Pseudomonas zhaodongensis DB-LT01的微生物菌剂的步骤，优选的，菌株或微生物菌剂的接种量为50ppm以上，净化水体过程的适用温度为5℃以上，优选5-30℃，更优选5-15℃，最优选8-15℃。
本发明还要求保护肇东假单胞菌株Pseudomonas zhaodongensis DB-LT01或包含肇东假单胞菌株Pseudomonas zhaodongensis DB-LT01的微生物菌剂在水净化领域的应用，优选的，肇东假单胞菌株或包含其的微生物菌剂用于降解水中的含氮物质，更优选的，所述含氮物质为含硝酸盐态氮、亚硝酸盐态氮和氨态氮的物质；所述应用的适用温度为5℃以上，优选5-30℃，更优选5-15℃，最优选8-15℃。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1.菌株筛选与性能检测
1.富集培养
采集某化工厂污水，吸取10mL污水转接至装有100mL富集培养基(硝酸钾2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠200g/L，调pH＝7.20)的250mL三角瓶中，8℃条件下静置培养7天，进行第一次富集。然后，再吸取10mL的一次富集液，加入到新鲜的富集培养基中，8℃条件下静置培养7天，进行第二次富集。按上述同样的富集方法再进行第三次富集。
2.初筛
采用梯度稀释法将第三次富集液稀释到10-6，分别吸取10-3、10-4、10-5、10-6稀释液各200μL至分离培养基(硝酸钾2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠200g/L，琼脂粉20g/L，调pH＝7.20)中，涂布均匀后倒置于30℃条件下培养约48h至长出单菌落。挑选形态相异的单菌落转接至试管斜面分离培养基上，30℃条件下培养约48h，然后转移至4℃冰箱中保藏备用。
按上述分离方法共得到4株，分别编号为：DB-LT00、DB-LT01、DB-LT02、DB-LT03。
3.复筛
无菌环境中，将初筛得到的4株菌分别挑取1环接种于盛有100mL富集培养基(硝酸钾2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠200g/L，调pH＝7.20)的250mL三角瓶中，30℃条件下静置培养48h，进行活化。
分别吸取5μL各活化液接种至100mL已灭菌的评价培养基(硝酸钾2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠200g/L，调pH＝7.20)的250mL三角瓶中，8℃条件下静置培养。用无菌水代替活化液作为空白，各实验组设置3个平行。定期检测培养基中的总氮含量，结果如表1所示。
总氮检测方法按照《HJ_636-2012_水质_总氮的测定_碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》执行。
表1 8℃条件下各菌株总氮降解能力
Figure BDA0003403700180000061
根据表1中的检测结果，初筛的4株菌中，因为反应温度只有8℃，各菌株未表现出明显的除总氮能力，120h时DB-LT01表现出较其他菌株更强的除总氮能力，总氮降解率达到45.6％，168h降解效率达到97.1％。
4.降解硝酸盐态氮能力的评价
无菌环境中，将菌株DB-LT01接种于盛有100mL富集培养基(硝酸钾2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠200g/L，调pH＝7.20)的250mL三角瓶中，30℃条件下静置培养48h，进行活化。
分别吸取5μL、10μL、20μL的活化液接种至盛有100mL已灭菌的评价培养基(硝酸钾2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠200g/L，调pH＝7.20)的250mL三角瓶中，8℃条件下静置培养。用无菌水代替活化液作为空白，各实验组设置3个平行。定期检测培养基中硝酸盐态氮的含量，结果如表2所示。
硝酸盐氮的检测方法按照《GB_T 7480-1987水质硝酸盐氮的测定酚二磺酸分光光度法》执行。
表2 8℃条件下菌株DB-LT01对硝酸盐态氮的降解能力
Figure BDA0003403700180000071
根据表2中的检测结果，菌株DB-LT01在8℃时具有优异的降解硝酸盐态氮的能力，添加量为50ppm时168h后硝酸盐态氮的降解效率达到97.1％。
5.降解氨态氮能力的评价
无菌环境中，将菌株DB-LT01接种于盛有100mL富集培养基(硝酸钾2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠200g/L，调pH＝7.20)的250mL三角瓶中，30℃条件下静置培养48h，进行活化。
分别吸取5μL、10μL、20μL的活化液接种至盛有100mL已灭菌的评价培养基(硫酸铵0.5g/L，琥珀酸钠5.62g/L，维氏盐50ml/L，调pH＝7.0)的250mL三角瓶中，8℃，120r/min条件下培养。用无菌水代替活化液作为空白，设置3个平行。定期检测培养基中的氨态氮含量。
氨氮检测方法按照《HJ 535-2009氨氮的测定-纳氏试剂分光光度法》执行。
表3 8℃条件下菌株DB-LT01对氨态氮的降解能力
Figure BDA0003403700180000072
根据表3中的检测结果，菌株DB-LT01具有降解氨态氮的能力，120h后接种量为50ppm以上时降解效率均能达到99％以上。
6.降解亚硝酸盐态氮的能力评价
无菌环境中，将菌株DB-LT01接种于盛有100mL富集培养基(硝酸钾2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠200g/L，调pH＝7.20)的250mL三角瓶中，30℃条件下静置培养48h，进行活化。
分别吸取5μL、10μL、20μL的活化液接种至盛有100mL已灭菌的评价培养基(葡萄糖5g/L，亚硝酸钠0.1g/L，氯化钠1g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.25g/L，调pH＝7.2)的250mL三角瓶中，8℃，120r/min条件下培养。用无菌水代替活化液作为空白，设置3个平行。定期检测培养基中亚硝酸盐态氮的含量，结果如表4所示。
亚硝酸盐态氮的检测方法按照《GB_T 7493-1987水质亚硝酸盐氮的测定分光光度法法》执行。
表4 8℃条件下菌株DB-LT01对亚硝酸盐态氮的降解能力
Figure BDA0003403700180000081
根据表4中的检测结果，菌株DB-LT01具有降解亚硝酸盐态氮的能力，50ppm添加量时120h后降解效率达到100％。
实施例2.菌株DB-LT01的检测鉴定
1、实验方法
1.1细菌基因组DNA的提取
用2ml离心管收集1.0×109(1ml菌液OD600为1-1.5)的细菌培养物，12,000×g离心30s，弃尽上清。用150μl已加入RNase A的Buffer S悬浮沉淀。
加入20μl溶菌酶贮存液，混合均匀，室温静置5min。
加入30μl 0.25mol/L EDTA(pH 8.0)，混合均匀，冰浴5min。
加入450μl Buffer G-A，旋涡振荡15s，65℃水浴10min。
加入400μl Buffer G-B和1ml Buffer DV(4℃预冷)，用力混合，12,000×g离心2min。
尽可能丢弃上相，保留相间沉淀和下相。加入1ml 4℃预冷Buffer DV，用力混合，12,000×g离心2min。
丢弃上相，将下相转移至滤器(滤器置于2ml离心管中)，12,000×g离心1min。
弃滤器，在滤液中加入400μl Buffer BV，混合均匀。
将制备管置于2ml离心管中，将步骤8中的混合液移入制备管中，12,000×g离心1min。
弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，加入500μl Buffer W1，12,000×g离心1min。
弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，加入700μl Buffer W2，12,000×g离心1min。
以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次。
弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，12,000×g离心1min。
将制备管置于另一洁净的1.5ml离心管中，在silica膜中央加100-200μl Eluent或去离子水，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。
2、细菌基因组PCR扩增
表5 PCR扩增引物设计
引物名称 序列
27F 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3
1492R 5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3
PCR扩增反应体系
在0.2ml离心管中加入以下成分：
表6 PCR扩增反应体系
试剂 体积
基因组DNA(20ng/μl) 1.0μl
10×Buffer(含2.5mmol/L Mg<sup>2+</sup>) 5.0μl
Taq聚合酶(5u/μl) 1.0μl
dNTP(10mM) 1.0μl
27F引物(10uM) 1.5μl
1492R引物(10uM) 1.5μl
ddH<sub>2</sub>O 39.0μl
总体积 50.0μl
轻弹混匀，瞬时离心收集管壁上的液滴至管底，在PCR扩增仪上进行PCR反应，反应参数如下：
表7 PCR扩增反应程序
预变性 变性 退火 延伸 终延伸 循环数
95℃，5min 95℃，30s 58℃，30s 72℃，1min30s 72℃，7min 35
反应完成后，取3μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，确认PCR扩增片段。
3、PCR产物的回收
PCR产物用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收，具体操作按试剂盒说明书进行，步骤如下：
(1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶放入干净的离心管中，称取重量。
(2)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热直至凝胶块完全熔化。
(3)加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀；当分离的DNA片段小于400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。
(4)将混合液转移到DNA制备管12,000×g离心1min，弃滤液。
(5)将制备管置回2ml离心管，加500μl Buffer W1，12,000×g离心30s，弃滤液。
(6)将制备管置回2ml离心管，加700μl Buffer W2，12,000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μl Buffer W2，12,000×g离心1min。
(7)将制备管置回2ml离心管中，12,000×g离心1min。
(8)将制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加25-30μl去离子水，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。
4、序列测定与分析
取各个菌种纯化后的PCR产物，使用测序仪ABI3730-XL进行DNA测序，肇东假单胞菌株Pseudomonas zhaodongensis DB-LT01的16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示。
5、序列分析
用NCBI Blast程序将拼接后的序列文件与NCBI 16S数据库中的数据进行比对，得到与待测物种序列相似性最大的物种信息，即为鉴定结果。
DB-LT01菌种斜面经过16S rNDA基因序列测序将测序得到的序列在NCBI
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)中比对，选择相似度最大的序列作为物种鉴定结果(详见表8中的分析比对结果)。
表8 样品NCBI比对结果
ID No. DNA identification results Identities
DB-LT01 Pseudomonas zhaodongensis 99％
实施例3:微生物菌剂的制备与储存
3.1微生物菌剂的制备：
(1)一级种子培养：无菌环境中挑取1环肇东假单胞菌株DB-LT01接入装有100mL富集培养基(硝酸钾2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠200g/L，调pH＝7.20)的250mL三角瓶中置于30℃、120rpm条件下培养24h，得到一级种子培养液；
(2)二级种子培养：无菌环境中，将一级种子培养液分别转接5mL至四个装有500ml富集培养基(硝酸钾2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠200g/L，调pH＝7.20)的1L三角瓶中，置于30℃、120rpm条件下培养24h，得到二级种子培养液；
(3)消毒灭菌：除了葡萄糖单独配料和消毒灭菌外，其他物料均在配料罐中配料，然后打入1t发酵罐，发酵培养基的组成为：每1L发酵培养基中包含葡萄糖21.68g、酵母浸粉10g、磷酸二氢钾0.67g、硫酸镁0.33g、氯化钠0.17g、一水硫酸锰0.0067g、七水硫酸亚铁0.0067g，定位600L，开始消毒灭菌。发酵罐实消条件：蒸汽直接进内层升温，110℃开始排汽，排汽时间：20分钟，排汽温度：115℃，发酵罐培养基实消条件：蒸汽直接进内层升温至118℃开始排汽，排汽时间30分钟，排汽温度121℃，消毒后体积约700L，然后冷却至30℃，等待接种；
(4)发酵：将二级种子培养液2000ml通过压差接种法接种至发酵罐的发酵培养基中，初始pH调节为7.0，控制温度为30℃，通气比控制为1:1.25(m3·min/m3)，罐压为0.05MPa，搅拌转速为200rpm，发酵过程中观察溶氧变化情况，溶氧从开始100％逐渐下降至0％，发酵周期约6-8h，溶氧开始回升，立即停止发酵，此时发酵处于对数期末期，活菌数高达400亿cfu/ml，菌体活力最强，发酵营养物质残余较少，存放活菌数衰减较少，发酵过程中活菌数随发酵时间的变化情况如表9所示。
表9 活菌数和发酵液COD随发酵时间的变化
Figure BDA0003403700180000131
3.2微生物菌剂的储存
采用对数期末期放罐发酵液进行灌装，低温储备。通过摸索不同温度5℃、10℃、15℃、20℃存放时限确定最佳存放温度为10℃，结果如表10所示，通过摸索不同pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0、pH9.5存放时限确定最佳存放pH为9.0，结果如表11所示。
表10 微生物菌剂在不同温度下存放的活菌数变化(单位亿cfu/ml)
Figure BDA0003403700180000132
Figure BDA0003403700180000141
表11 微生物菌剂在10℃不同pH条件下存放的活菌数变化(单位亿cfu/ml)
Figure BDA0003403700180000142
实施例4:异养硝化功能检测
将肇东假单胞菌株DB-LT01接入装有100mL富集培养基(硝酸钾2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠200g/L，调pH＝7.20)的250mL三角瓶中，30℃、150rpm条件下震荡培养24h，得到种子液，活性菌浓度为108～1010CFU/ml。
按5％(v/v)取种子液接种在异养硝化模拟废水中，异养硝化模拟废水由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及各自的浓度分别为NH4Cl 0.382g/L、乙酸钠2g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L、K2HPO4 0.2g/L、NaCl 0.12g/L、MnSO4·4H2O 0.01g/L、FeSO4 0.01g/L，pH 7.0～7.2，并设不接种菌种的阴性对照，接种菌种后于30℃、150rpm振荡好氧培养7d，得到待测菌液。
培养7天后，使用格里斯氏(Griess)试剂和二苯胺试剂检测培养液中是否出现亚硝酸盐氮，具体方法为：在培养液中滴加格里斯氏试剂A液(0.5g对氨基苯磺酸，150ml110％(v/v)稀醋酸)、格里斯氏试剂B液(0.1gα-萘胺、150ml 10％稀醋酸、20ml蒸馏水)后，溶液如变为粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色等表示亚硝酸盐的存在，说明发生异养硝化，为异养硝化阳性。如无红色出现，则可加入一、二滴二苯胺试剂(二苯胺0.5g溶于100ml浓硫酸中，用20ml蒸馏水稀释)，此时如呈蓝色反应，则表示培养液中存在硝酸盐，也说明发生异养硝化，为异养硝化阳性；如不呈蓝色反应，表示无形成的亚硝酸盐和硝酸盐，说明未发生异养硝化，为异养硝化阴性。根据标准HJ535-2009水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法测定氨氮浓度，计算单菌异养硝化的氨氮降解率，单菌异养硝化的氨氮降解率＝(不接菌阴性对照氨氮浓度-待测菌液氨氮浓度)/不接菌阴性对照氨氮浓度*100％，结果显示肇东假单胞菌株DB-LT01的异氧硝化的氨氮降解率为99％以上。
实施例5:青岛某园区污水中肇东假单胞菌株DB-LT01的降总氮能力评价1、菌种的活化
无菌环境中挑取1环肇东假单胞菌株DB-LT01接入装有100mL富集培养基(硝酸钾2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠200g/L，调pH＝7.20)的250mL三角瓶中，后置于30℃、120rpm条件下培养24h，得到活化菌液，稀释活性菌含量至50亿cfu/ml待用。
2、菌株DB-LT01降总氮能力评价实验
分别向装有100mL青岛某园区污水(总氮含量256mg/L)的250mL三角瓶中加入异养活化菌液5μl、10μl、100μl，各接种量分别置于5℃、8℃、15℃下静置培养，每隔24h检测培养基中的总氮含量。共设置3个平行实验组，和1个用无菌水替代活化菌液的空白对照组。具体实验安排如下：
(1)空白对照组1：不加活化菌液；
(2)实验组2：活化菌液添加量50ppm，5℃培养；
(3)实验组3：活化菌液添加量100ppm，5℃培养；
(4)实验组4：活化菌液添加量1000ppm，5℃培养；
(5)实验组5：活化菌液添加量50ppm，8℃培养；
(6)实验组6：活化菌液添加量100ppm，8℃培养；
(7)实验组7：活化菌液添加量1000ppm，8℃培养；
(8)实验组8：活化菌液添加量50ppm，15℃培养；
(9)实验组9：活化菌液添加量100ppm，15℃培养；
(10)实验组10：活化菌液添加量1000ppm，15℃培养。
3、实验结果
评价实验结果见下表。
表12 青岛某园区污水中菌株DB-LT01的降总氮能力评价结果
Figure BDA0003403700180000161
由表12可知，在测试温度为15℃、接种量为1000ppm时，菌株DB-LT01在168h时总氮降解率最高达到98.0％；从数据规律来看，温度越高降解速率越快，8℃明显优于5℃，接种量越大降解速率越快，8℃接种量为50ppm时168h的总氮降解率可达96.0％。同时也看到，该菌在更低温度5℃时仍有降解能力，接种量为50ppm时总氮降解率为52.7％，接种量为100ppm时总氮降解率为61.3％，接种量为1000ppm时总氮降解率为67.6％，但受温度影响效率降低明显。
实施例6.某发酵污水中菌株DB-LT01降总氮、氨氮和亚硝酸盐能力评价
1、肇东假单胞菌DB-LT01菌剂的制备
将肇东假单胞菌株DB-LT01进行1吨规模的二级液体有氧发酵，达到对数末期时停止发酵，此时活菌数562亿cfu/ml，稀释菌含量至50亿cfu/ml待用，降温至20℃以下保存。
2、酶制剂发酵污水基本情况
该酶制剂发酵企业位于山东省潍坊市，污水为植酸酶、酸性纤维素酶、木聚糖酶、中温淀粉酶、普鲁兰酶等发酵废液。污水处理站设计日处理能力为300m3/天，污水处理工艺为：原污水经过调节池、初沉池后进入IC塔，再经过2级AO后经过二沉池、混凝池进入终沉池，最后排放。
两级AO水力停留时间各约40h，其中A池约20h，O池约20h。原污水总氮浓度约1200mg/L，氨氮浓度约950mg/L，出水总氮浓度约为352mg/L，氨氮浓度约290mg/L，亚硝酸盐浓度约为50mg/L，要求出水总氮浓度为≤45mg/L，氨氮浓度约≤25mg/L。
3、应用对比实验
实验条件：从污水处理站二沉池取活性污泥20L，取一级AO的A池入口处污水30L，加入AO污水处理模拟实验装置，控制模拟器运行参数如下：
(1)环境温度：8℃；
(2)污泥龄20d；
(3)污泥回流比25％；
(4)混合液回流比100％；
(5)溶解氧，A池0.5mg/L；O池2.0mg/L。
实验设计：具体实验安排如下，每个实验组设置3个重复：
(1)空白对照组：不投加菌液；
(2)实验组1：按照50ppm，投加菌剂2.5g；
(3)实验组2：按照100ppm，仅投加菌剂5g；
(4)实验组3：按照1000ppm，仅投加菌剂50g。
为避免对O池造成较大干扰，选择在A池入口处投加菌液。
经两级AO处理96h后，取出水水样进行总氮和氨氮含量的测定。测定并记录原污水和出水总氮、氨氮含量。总氮检测方法按照《HJ_636-2012_水质_总氮的测定_碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》执行，氨氮含量的检测方法按《HJ 535-2009氨氮的测定-纳氏试剂分光光度法》执行。实验结果见表13、14。
表13 肇东假单胞菌株DB-LT01在发酵污水中降解总氮效果
原水总氮，mg/L 出水总氮，mg/L 总氮降解率，％
空白对照组 1200 368 69.3
实验组1 1215 15 98.8
实验组2 1235 16 98.7
实验组3 1223 9 99.3
从表13结果可知，和空白对照组对比，各实验组出水的总氮均有所降低，按照50ppm投加肇东假单胞菌剂，总氮96h降解率达到98.8％，出水总氮降至15mg/L，已完全达到了出水水质要求。
表14 肇东假单胞菌株DB-LT01在发酵污水中降解氨氮效果
原水氨氮，mg/L 出水氨氮，mg/L 氨氮降解率，％
空白对照组 950 290 69.5
实验组1 956 6 99.4
实验组2 948 5 99.5
实验组3 957 1 99.9
从表14结果可知，和空白对照组对比，各实验组出水的氨氮含量均有所降低，其中按照50ppm投加肇东假单胞菌株DB-LT01的实验组，氨氮96h降解率达到99.4％，出水氨氮降至6mg/L，已完全达到了出水水质要求。
表15 肇东假单胞菌株DB-LT01在发酵污水中降解亚硝酸盐氮效果
Figure BDA0003403700180000191
从表15结果可知，和空白对照组对比，各实验组出水的亚硝酸盐氮含量均有所降低，其中按照50ppm投加肇东假单胞菌株DB-LT01的实验组，亚硝酸盐氮96h降解率达到99.0％，出水亚硝酸盐氮降至0.5mg/L。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 青岛蔚蓝赛德生物科技有限公司
<120> 一种肇东假单胞菌株及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1177
<212> DNA
<213> Pseudomonas zhaodongensis DWZD
<400> 1
tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgtgaca ttctgattca 60
cgattactag cgattccgac ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc ggactacgat 120
cggttttatg ggattagctc cacctcgcgg cttggcaacc ctttgtaccg accattgtag 180
cacgtgtgta gcccaggccg taagggccat gatgacttga cgtcatcccc accttcctcc 240
ggtttgtcac cggcagtctc cttagagtgc ccaccttaac gtgctggtaa ctaaggacaa 300
gggttgcgct cgttacggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacagccat 360
gcagcacctg tgtcagagtt cccgaaggca ccaatccatc tctggaaagt tctctgcatg 420
tcaaggcctg gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt 480
gcgggccccc gtcaattcat ttgagtttta accttgcggc cgtactcccc aggcggtcga 540
cttaatgcgt tagctgcgcc actaagatct caaggatccc aacggctagt cgacatcgtt 600
tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc gcacctcagt 660
gtcagtatta gcccaggtgg tcgccttcgc cactggtgtt ccttcctata tctacgcatt 720
tcaccgctac acaggaaatt ccaccaccct ctgccatact ctagcttgcc agttttggat 780
gcagttccca ggttgagccc ggggctttca cattcaactt aacaaaccac ctacgcgcgc 840
tttacgccca gtaattccga ttaacgcttg cacccttcgt attaccgcgg ctgctggcac 900
gaagttagcc ggtgcttatt ctgtcggtaa cgtcaaaaca ctaacgtatt aggttaatgc 960
ccttcctccc aacttaaagt gctttacaat ccgaagacct tcttcacaca cgcggcatgg 1020
ctggatcagg ctttcgccca ttgtccaata ttccccactg ctgcctcccg taggagtctg 1080
gaccgtgtct cagttccagt gtgactgatc atcctctcag accagttacg gatcgtcgcc 1140
ttggtgagcc attacctcac caactagcta atccgac 1177

Claims (17)

1.一种肇东假单胞菌株(Pseudomonas zhaodongensis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.23567。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的肇东假单胞菌株。
3.权利要求2所述微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)一级种子培养：无菌条件下取肇东假单胞菌株接种于富集培养基中，于25-35℃、100-150rpm的条件下培养12-36h，得到一级种子培养液；
(2)二级种子培养：无菌条件下将一级种子培养液按照1-3vol%的接种量接种于富集培养基中，于25-35℃、100-150rpm的条件下培养12-36h，得到二级种子培养液；
(3)发酵：待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后，将步骤(2)所得的二级种子培养液按照0.1-0.5vol%的接种量接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃，通气比为1:(1-2)，150-300rpm的条件下发酵，待溶氧开始上升时停止发酵，得发酵液；
(4) 制备微生物菌剂：将步骤(3)所得的发酵液稀释灌装，即得微生物菌剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述富集培养基的组成如下：硝酸钾2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠200g/L，余量为水，且pH为6.5-8；
所述发酵培养基的组成如下：碳源15-30g/L，氮源5-15g/L，K+ 0.2-0.4g/L，Mg2+ 0.05-0.1g/L，Na+ 0.05-0.1g/L，Mn2+ 1.5×10-3-3.5×10-3g/L，Fe3+或Fe2+1×10-3-2×10-3 g/L，余量为水，且pH为6.5-8。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、淀粉、醋酸钠或丁二酸钠中的一种或多种；所述氮源选自酵母浸粉、蛋白胨、尿素、硫酸铵或硝酸钾中的一种或多种。
6.一种净化水体的方法，包括向水体中接种权利要求1所述的菌株或向水体中施加权利要求2所述的微生物菌剂的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述净化水体过程的适用温度为5℃以上。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述净化水体过程的适用温度为5-30℃。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述净化水体过程的适用温度为5-15℃。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述净化水体过程的适用温度为8-15℃。
11.权利要求1所述的肇东假单胞菌株或权利要求2所述的微生物菌剂在水净化领域的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，权利要求1所述的肇东假单胞菌株或权利要求2所述的微生物菌剂用于降解水中的含氮物质。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述含氮物质为含硝酸盐态氮、亚硝酸盐态氮和氨态氮的物质。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用的适用温度为5℃以上。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述应用的适用温度为5-30℃。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述应用的适用温度为 5-15℃。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述应用的适用温度为8-15℃。
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