CN114292789A - 一种具有反硝化和除磷功能的副球菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有反硝化和除磷功能的副球菌菌株(Paracoccus sp.)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.19475，本发明筛选出来的副球菌菌株兼具厌氧反硝化和好氧反硝化的效果，在好氧的条件下也能高效的去除水体中的总氮，同时能够降低废水中的总磷含量，在菌液接种量为0.2vol％的条件下，初始磷含量为13.4mg/L时，72h的总磷去除率可以达到63.4％。

Description

一种具有反硝化和除磷功能的副球菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种副球菌菌株及包含其的微生物菌剂，具体涉及一种能够降解水中含氮物质和总磷的副球菌菌株及其应用，属于环境微生物技术领域。

背景技术

随着国家工业化的发展与人民生活水平的提高，用水量的日益提升与污染物的排放使得水资源污染问题变得越来越严重。由于水污染而产生的环境事件、公共安全事件甚至重大社会事件，严重影响人民的身体健康和社会的和谐稳定，直接威胁到人类的生存空间。

城市污水处理厂的尾水和养殖污水，都含有不同种类的氮磷等营养元素，并且含量都较高。水体底泥中赋存着大量不同形态的磷，且赋存形态随着水环境等理化特性的变化而改变。同时，底泥中磷的释放是造成水体富营养化的原因之一。由于环境理化性质差异、水体体量差异以及化学除磷法成本较高，而利用功能微生物去除无机磷的方法又具有安全、经济、方便和无二次污染的优点，所以后者逐渐成为养殖污水和生活废水处理的主要方式。

生物脱氮技术是目前应用广泛且经济效益较高的脱氮方法，传统的生物脱氮由好氧自养硝化作用和厌氧异养反硝化作用共同完成，而近些年来异养硝化和好氧反硝化的发现打破了传统的生物脱氮理论，与传统生物脱氮相比，不仅可以使硝化和反硝化在同一反应器中完成，加快反应过程，减小反应器容积，缩短水力停留时间，降低运行成本，提高系统抗冲击能力，处理高浓度的含氮废水，还可以在反硝化过程中同步除磷。因而逐渐成为目前生物脱氮研究的热点。

通过分离高效的反硝化脱氮除磷菌，深入研究该菌的生长特性、脱氮特性及其在污水脱氮除磷中的应用，对提高污水的脱氮除磷处理效率和经济性有着重要的理论价值和实际意义，但目前筛选出来的现有菌种中，鲜少有能够同时具有好氧反硝化和除磷作用的，实际应用中对该类菌种的需求亟待解决。

发明内容

本发明针对水净化领域中缺少能够同时进行好氧反硝化和除磷作用菌种的现状，提供一种能够在高效反硝化降解硝酸盐和总氮的同时降低废水中总磷含量的副球菌、微生物菌剂及其应用。

本发明要求保护一种具有反硝化和除磷功能的副球菌(Paracoccus sp.)菌株DB133C，其16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示，tauY DNA序列如SEQ ID No:2所示，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.19475，保藏日期为2020年3月16日。

本发明还要求保护包含上述副球菌菌株的微生物菌剂。

本发明技术方案的有益效果是：

(1)本发明筛选出来的副球菌菌株兼具厌氧反硝化和好氧反硝化的效果，在好氧的条件下也能高效的去除水体中的总氮，30℃接种量为1000ppm条件下24h硝酸盐的降解率几乎达到100％，30℃接种量为100ppm条件下72h硝酸盐的降解率达到97.8％，且经过实验证实，无论是在静置缺氧的状态下还是震荡好氧的状态下，在硝酸盐浓度高达14wt％的条件下，经72h均能稳定存活且具有降解效果；

(2)本发明筛选出来的副球菌菌株同时能够降低废水中的总磷含量，在菌液接种量为0.2vol％的条件下，初始磷含量为13.4mg/L时，72h的总磷去除率可以达到63.4％；实验前2日，日去除率可达到23～25％左右；磷降解效果远优于现有的副球菌菌株。

本发明还要求保护包含上述副球菌菌株DB133C的微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)一级种子培养：无菌条件下取副球菌菌株接种于富集培养基中，于25-35℃、100-150rpm的条件下培养12-36h，得到一级种子培养液；

(2)二级种子培养：无菌条件下将一级种子培养液按照1-3vol％的接种量接种于富集培养基中，于25-35℃、100-150rpm的条件下培养12-36h，得到二级种子培养液；

(3)发酵：待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后，将步骤(2)所得的二级种子培养液按照1-5vol％的接种量接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃，通气比为(1-2):1、150-300rpm的条件下发酵，待溶氧开始上升时停止发酵，得发酵液；

(4)制备微生物菌剂：将步骤(3)所得的发酵液稀释灌装，即得微生物菌剂。

进一步，所述富集培养基的组成如下：硝酸钾0.2-2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠20g/L，余量为水，且pH为6.5-8；

所述发酵培养基的组成如下：碳源30-40g/L，氮源5-15g/L，PO₄ ^3-0.1-0.3g/L，K⁺0.05-0.3g/L，Mg²⁺0.01-0.03g/L，Fe²⁺(5-15)*10^-3g/L，Mn²⁺(1-3)*10^-3g/L，余量为水，且pH为6.5-8。

进一步，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、淀粉、醋酸钠或丁二酸钠中的一种或多种。

进一步，所述氮源选自酵母浸粉、蛋白胨、尿素、硫酸铵或硝酸钾中的一种或多种。

优选的，所述K⁺的来源为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸钾、氯化钾、硝酸钾中的一种或多种，所述Mg²⁺的来源为硫酸镁、硝酸镁、氯化镁中的一种或多种，所述Na⁺的来源为氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、碳酸钠、醋酸钠、琥珀酸钠中的一种或多种，所述Fe²⁺的来源为硫酸亚铁、氯化亚铁、硫酸亚铁铵中的一种或多种。

微生物菌剂的制备方法中所述的通气比是指每分钟内通入发酵罐的空气体积与发酵液总体积之比。

本发明还要求保护使用副球菌菌株DB133C或包含副球菌菌株DB133C的微生物菌剂净化水体的方法，包括向水体中接种副球菌菌株DB133C或向包含副球菌菌株DB133C的微生物菌剂的步骤，优选的，副球菌菌株或微生物菌剂的接种量为10ppm以上，更优选接种量为50-1000ppm，最优选接种量为100-1000ppm。

本发明还要求保护副球菌菌株DB133C或包含副球菌菌株DB133C的微生物菌剂在水净化领域的应用，优选的，副球菌菌株DB133C或包含副球菌菌株DB133C的微生物菌剂用于降解水中的含氮物质或总磷，更优选的，所述含氮物质为含硝酸盐态氮和亚硝酸盐态氮的物质。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1.菌株的分离与筛选

1.富集

采集山东省潍坊市高密市某生物工厂污水处理站缺氧段的泥水混合物，按10vol％的接种量接种至富集培养基(硝酸钾2.0g，磷酸氢二钾0.5g，七水合硫酸镁0.2g，酒石酸钾钠20.0g，水1000mL，pH＝7.2±0.1)中富集，30℃恒温培养箱静置培养120h，得到一级富集液；将一级富集液按10vol％接种量接种至新鲜的富集培养基中，30℃恒温培养箱静置培养120h，得到二级富集液；将二级富集液按10vol％接种量接种至新鲜的富集培养基中，30℃恒温培养箱静置培养120h，得到三级富集液，每级均有三个平行。

2.性能初检

对富集液中的无机氮进行定性显色反应检测。

硝酸盐态氮的定性检测：将二级富集液与三级富集液各吸取200μL至白瓷板凹孔内，设置阳性对照为1g/L硝酸钾溶液，阴性对照为去离子水，分别加入0.1mol/L盐酸100μL，0.8wt％氨基磺酸溶液200μL，静置5min后，加入二苯胺-硫酸试剂2滴，如果溶液在白瓷板凹孔中有蓝色沉淀生成，则证明富集液中含有硝酸盐，如无反应则不含硝酸盐，反应呈阴性。

亚硝酸盐态氮的定性检测：将二级富集液与三级富集液各吸取200μL至2.0mL离心管中，设置阳性对照为1mg/L亚硝酸钠溶液，阴性对照为去离子水，加入Griess试剂Ⅰ、Ⅱ各一滴，盖上离心管盖，溶液呈红色则富集液中含有亚硝酸盐，如无反应则不含亚硝酸盐，反应呈阴性。

3.分离

从二级和三级富集液中试分离目的菌株，使用梯度稀释法将二级富集液梯度稀释至10^-8后，将10^-6、10^-7、10^-8稀释液分别吸取200μL涂布于固体营养琼脂培养基(蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，琼脂粉20g，水1000mL，pH自然)上，30℃恒温培养箱中倒置培养1-2天。待长出单菌落后，挑取菌落密度适中的平板，在明亮光线下观察菌落形态、颜色、大小、表面等，挑取不同特点的菌落经平板划线法纯化出单菌落后，挑取单菌落对其进行4℃试管斜面保藏。按上述方法分离三级富集液。

采用上述方法，共分离获得9株菌，分别命名为DB131A、DB131B、DB132A、DB132B、DB132C、DB133A、DB133B、DB133C和DB134A。

表1. 120h富集液中硝酸盐及亚硝酸盐定性检测结果

4.筛选：总氮降解效果评价实验

4.1活化

将分离得到的9株菌株使用无菌接种环挑取一环接种于液体营养肉汤培养基(蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，水1000mL，pH自然)中，30℃、220rpm摇床培养24h进行活化。

4.2效果评价

吸取100μL活化好的菌液接种至100mL评价培养基(硝酸钾2.0g，磷酸氢二钾0.5g，七水合硫酸镁0.2g，酒石酸钾钠20.0g，水1000mL，pH＝7.2±0.1)中，30℃恒温培养箱静置培养，定期检测培养基中硝酸盐态氮、亚硝酸盐态氮和总氮含量。硝酸盐态氮、亚硝酸盐态氮和总氮的检测方法分别按照《HJ/T 346水质硝酸盐氮的测定紫外分光光度法》、《GB/T7493水质亚硝酸盐氮的测定分光光度法》、《HJ 636水质总氮的测定碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》执行，对照组为空白的评价培养基。

表2.各菌株接种评价培养基后硝酸盐氮和总氮的检测结果

根据表2中24h的检测结果，分离得到的9株菌中，DB133C具有高效的硝酸盐氮降解能力和总氮降解能力，硝酸盐氮降解率在12h和24h分别达65.10％和99.99％，总氮降解率在12h和24h分别达到50.85％和96.34％，且在此过程中不存在亚硝酸盐的积累，该菌对硝酸盐氮和总氮都具有较高的降解效率，DB133A菌株对硝酸盐氮的降解效率在24h达到了70％，但该菌株在作用过程中会产生亚硝酸盐的积累，且对总氮的降解效率较低。

实施例2.菌株DB133C的鉴定

将菌株DB133C送中国科学院微生物研究所进行菌种鉴定，根据菌株的细胞形态、生理生化特征、16SrRNA基因序列、tauY基因序列等，参考《伯杰氏系统细菌学手册》及相关研究论文，鉴定DB133C为副球菌属。菌株16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示，tauY DNA序列如SEQ ID No:2所示，菌株的细胞形态和理化实验结果如表3所示。

表3.DB133C细胞形态和理化实验结果

实施例3.副球菌菌株DB133C的好氧反硝化能力评价实验

3.1菌液的制备

将副球菌菌株DB133C进行活化，使用无菌接种环挑取一环试管斜面上的菌苔接种于100mL液体营养肉汤培养基(蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，水1000mL，pH自然)中，30℃、220rpm摇床培养24h，获得活化好的菌液，活化菌液可接入评价培养基中。

3.2好氧反硝化能力效果评价实验

将活化好的菌液按不同接种量接种至100mL反硝化评价培养基(KNO₃2.0g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，酒石酸钾钠20.0g，自来水1000mL，pH＝7.2±0.1)中，接种后置于30℃、220rpm摇床好氧培养，每24小时检测培养基中总氮含量，总氮的检测方法按《HJ 636水质总氮的测定碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》执行，结果如表4所示。

具体实验安排如下：

空白对照组1：不加活化菌液；

实验组2：活化菌液添加量10ppm；

实验组3：活化菌液添加量50ppm；

实验组4：活化菌液添加量100ppm；

实验组5：活化菌液添加量1000ppm。

上述1-5组，设1个空白对照组，每组各设3个平行实验组，一并置于30℃、220rpm恒温震荡培养器中培养，副球菌DB133C在好氧条件下对培养基中总氮的降解能力详见表4。

表4副球菌菌株DB133C的反硝化能力评价结果

根据表4中的72h检测结果，菌株DB133C具有高效的好氧反硝化能力，在实验组5中，总氮降解率在24h和48h分别达到80.88％和98.97％，在接种量最低的实验组2中，该菌72h对总氮也具有69.7％的降解效率，接种量100ppm时，总氮降解率在48h和72h分别达到80.6％和97.8％。

实施例4.副球菌菌株DB133C对高浓度硝酸盐态氮的耐受效果评价实验4.1.菌液的制备

将副球菌菌株DB133C进行活化，使用无菌接种环挑取试管斜面上的菌苔接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，水1000mL，pH自然)中，30℃、220rpm摇床活化培养24h，活化好的菌液可接入评价培养基中。

4.2高浓度硝酸盐态氮培养基的制备

在原有反硝化评价培养基(KNO₃ 2.0g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，酒石酸钾钠20.0g，自来水1000mL，pH＝7.2)的基础上增加硝酸钾浓度，设置14wt％、10wt％、6wt％3个不同的硝酸钾浓度梯度，培养基中氮含量从1700mg/L至3300mg/L不等。

4.3高浓度硝酸盐态氮耐受效果评价实验

向装有100mL不同浓度梯度评价培养基的三角瓶中加入活化菌液，置于特定条件下培养，72h后检测培养基中总氮含量，总氮的检测方法按《HJ636水质总氮的测定碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》执行。

具体实验安排如下：

空白对照组1：不加活化菌液；

实验组2：活化菌液添加量0.2vol％；

实验组3：活化菌液添加量0.5vol％；

实验组4：活化菌液添加量1vol％；

上述1-4组，每组实验分别包括14wt％、10wt％、6wt％3种不同浓度的硝酸钾，一并置于30℃、220rpm(溶氧约为6mg/L)好氧下培养。

空白对照组5：不加活化菌液；

实验组6：活化菌液添加量0.2vol％；

实验组7：活化菌液添加量0.5vol％；

实验组8：活化菌液添加量1vol％；

上述5-8组，每组实验分别包括14wt％、10wt％、6wt％3种不同浓度的硝酸钾，一并置于30℃、静置缺氧条件下培养。

副球菌菌株DB133C对不同浓度硝酸盐中总氮降解能力详见表5和表6。

表5.好氧条件下菌株DB133C对不同浓度硝酸盐72h降解后的总氮含量

表6.缺氧条件下菌株DB133C对不同浓度硝酸盐72h降解后的总氮含量

从表5、6中的结果可知，无论是在静置缺氧的状态下还是在震荡好氧的状态下，于硝酸盐浓度高至14wt％的评价培养基中接种0.2vol％、0.5vol％和1vol％的副球菌DB133C经过72h后都具备活性，证明该菌株能够适应较高浓度的硝酸盐态氮，并具有降解效果。

随着接种量大小和硝酸盐浓度的不同，降解效率也有所区别，降解效果与接种量呈正相关性，而与硝酸盐浓度呈负相关性，即随着副球菌菌株DB133C的接种量增大，其去除总氮的起效时间越早，去除效率也越高，在接种量相同的情况下，初始硝酸盐的浓度越高，降解效果越差。

另外，在其他条件相同的情况下，厌氧环境下该菌株反硝化的能力更强，这与反硝化作用机制、电子受体选择优先权等理论也基本符合。

实施例5.副球菌DB133C在模拟废水中对总磷的去除效果

5.1菌液的制备

将副球菌DB133C进行活化，使用无菌接种环挑取试管斜面上的菌苔接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，水1000mL，pH自然)中，30℃、200rpm条件下摇床活化培养24h，活化好的菌液可按0.2vol％接种量接入灭菌的模拟废水培养基中。

5.2模拟废水培养基配制

模拟养殖废水培养基配方：葡萄糖0.51g，醋酸钠0.34g，氯化铵0.2g，蛋白胨0.1g，酵母粉0.01g，氯化钠0.05g，磷酸氢二钾0.075g，氯化钙0.025g，蒸馏水1000mL，pH自然，115℃灭菌30min。

5.3检测总磷含量

将模拟废水置于30℃、200rpm的摇床中培养120h，定时取样，静置后取上清液检测其中的总磷含量，总磷的检测方法按照《GB11893-89水质总磷的测定钼酸铵分光光度法》执行，计算菌株对总磷的去除效率，结果如表7所示。

表7.副球菌DB133C对总磷的去除情况

时间	总磷含量(mg/L)	除磷量(mg/L)	去除率
				0h	13.4	-	-
24h	10.3	3.1	23.1％
				48h	6.9	3.4	48.5％
72h	4.9	2.0	63.4％
				96h	4.7	0.2	64.9％
120h	4.6	0.1	65.7％

从表7中的结果可以看出，副球菌DB133C对模拟废水中的总磷具有不错的去除效果，初始磷含量13.4mg/L，在72h总磷去除率可以达到63.4％；实验前2日，日去除率可达到23％～25％左右；实验持续至5d，总磷去除率达到65.7％。

实施例6.含副球菌DB133C的微生物菌剂的制备方法

包含副球菌菌株DB133C的微生物菌剂可采用如下方法制备：

(1)一级种子培养：无菌条件下取一环副球菌菌株接种于富集培养基中，富集培养基的组成如下：硝酸钾2g，磷酸氢二钾0.5，七水合硫酸镁0.2g，酒石酸钾钠20g，水1000ml，pH自然；于25-35℃、100-150rpm的条件下培养24h，得到一级种子培养液；

(2)二级种子培养：无菌条件下将一级种子培养液按照1-3vol％的接种量接种于富集培养基中，于25-35℃、100-150rpm的条件下培养24h，得到二级种子培养液；

(3)发酵：后配制30L发酵培养基，发酵培养基的组成如下：酒石酸钾钠35.7g，酵母浸粉6.8g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.1g，七水合硫酸亚铁0.04g，一水合硫酸锰0.007g，水1000mL，pH＝7.2，在50L小试罐中依次进行空消、实消，待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后，将步骤(2)所得的二级种子培养液按照1-5vol％的接种量接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃，通气比为(1-2):1、150-300rpm的条件下发酵，待溶氧开始上升时停止发酵，放料得发酵液；

(4)制备微生物菌剂：将步骤(3)所得的发酵液稀释至所需活菌数，即得微生物菌剂，该微生物菌剂与活化菌液在应用中具有相同的功能和效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 青岛蔚蓝赛德生物科技有限公司

<120> 一种具有反硝化和除磷功能的副球菌及其应用

<130> 2

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1311

<212> DNA

<213> 副球菌 (Paracoccus sp.)

<400> 1

tagcggcgga cgggtgagta acgcgtggga acgtaccctt tgctgcggaa tagccccggg 60

aaactgggag taataccgca tgagccctac gggggaaaga tttatcggca aaggatcggc 120

ccgcgttgga ttaggtagtt ggtggggtaa tggcccacca agccgacgat ccatagctgg 180

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ggtctacccg acggccgtgc gctaaccagc aatgggggca gcggaccacg g 1311

<210> 2

<211> 723

<212> DNA

<213> 副球菌(Paracoccus sp.)

<400> 2

tggatgccga cgtggtggtg atcggctcgg gctataccgg cctttcctgc gccatccacc 60

tggccaagat gcacggcatc aaggccacgg tgctggaggc gaacggcgtg gcctatggct 120

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atgtcgacag cccggtgcag ggctgggact gccgaaatgg cctgcatcac ctgcgcaccc 600

cgggcggcac ggtgcgggcg aaacgggtgg cggtggcgac ggcggcctat gcgccgcgcg 660

gcctgcaccc gcggctccgg gaccggctga tgccgatcat gtcgaacagc atcgtcaccc 720

gcg 723

Claims (10)

1.一种具有反硝化和除磷功能的副球菌菌株(Paracoccus sp.)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.19475。

2.根据权利要求1所述的副球菌菌株，其特征在于，所述副球菌菌株的16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示，tauY DNA序列如SEQ ID No:2所示。

3.一种微生物菌剂，其特征在于，包含权利要求1或2所述的副球菌菌株。

4.一种权利要求3所述微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)一级种子培养：无菌条件下取副球菌菌株接种于富集培养基中，于25-35℃、100-150rpm的条件下培养12-36h，得到一级种子培养液；

(2)二级种子培养：无菌条件下将一级种子培养液按照1-3vol％的接种量接种于富集培养基中，于25-35℃、100-150rpm的条件下培养12-36h，得到二级种子培养液；

(3)发酵：待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后，将步骤(2)所得的二级种子培养液按照1-5vol％的接种量接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃，通气比为(1-2):1、150-300rpm的条件下发酵，待溶氧开始上升时停止发酵，得发酵液；

(4)制备微生物菌剂：将步骤(3)所得的发酵液稀释灌装，即得微生物菌剂。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述富集培养基的组成如下：硝酸钾0.2-2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠20g/L，余量为水，且pH为6.5-8；

所述发酵培养基的组成如下：碳源30-40g/L，氮源5-15g/L，PO₄ ^3-0.1-0.3g/L，K⁺0.05-0.3g/L，Mg²⁺0.01-0.03g/L，Fe²⁺(5-15)*10^-3g/L，Mn²⁺(1-3)*10^-3g/L，余量为水，且pH为6.5-8。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、淀粉、醋酸钠或丁二酸钠中的一种或多种；

所述氮源选自酵母浸粉、蛋白胨、尿素、硫酸铵或硝酸钾中的一种或多种。

7.一种净化水体的方法，包括向水体中接种权利要求1或2所述的副球菌菌株或权利要求3所述的微生物菌剂的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述副球菌菌株或微生物菌剂的接种量为10ppm以上，优选的，50-1000ppm，更优选的，100-1000ppm。

9.权利要求1所述的副球菌菌株或权利要求2所述的微生物菌剂在水净化领域的应用，优选的，所述副球菌菌株或微生物菌剂用于降解水中的含氮物质或总磷。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述含氮物质为含硝酸盐态氮和亚硝酸盐态氮的物质。