CN118146994A - 一株善变副球菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株善变副球菌及其应用，尤其涉及一株具有好氧反硝化功能的善变副球菌及其在污水处理方面的应用，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.29722，保藏日期为：2024年1月22日，本发明的善变副球菌菌株具有好氧条件下进行反硝化的效果。在温度为30℃，初始总氮浓度为400mg/L的条件下，24h的总氮去除率为91％，24h的硝氮去除率为96％。
Description
技术领域
本发明涉及一株善变副球菌及其应用，尤其涉及一株具有好氧反硝化功能的善变副球菌及其在污水处理方面的应用，属于环境微生物技术领域。
背景技术
如何实现含氮废水的高效处理逐渐成为当前的研究热点。
生物脱氮以其高效、经济、环境友好等优势被视为最具发展前景的污水脱氮技术，是处理含氮污水的重要环节。传统的生物脱氮工艺中硝化与反硝化反应是在时间与空间上分开的两个阶段，因此在效率和经济方面存在一定的缺陷。
好氧反硝化打破了传统反硝化的概念，可在硝化池中与硝化菌配合实现同步的异养硝化-好氧反硝化，好氧反硝化菌可以将异养硝化的产物作为好氧反硝化的反应物，从而实现在同一空间进行硝化和反硝化两个过程，从而提高脱氮效率，降低脱氮成本，为生物脱氮提供新的研究方向和途径。
发明内容
本发明针对现有的生物脱氮技术中难以实现同步异养硝化-好氧反硝化的问题，提供一种能在高溶氧硝化池中与硝化菌配合实现同步异养硝化-好氧反硝化的善变副球菌菌株，从而解决高溶氧废水中脱氮处理难的问题。
一株善变副球菌(Paracoccus versutus)YB-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.29722，保藏日期为：2024年1月22日，其16S rDNA序列如SEQ IDNo:1所示，在没有特别说明的情况下，本发明中所述的善变副球菌均是指善变副球菌YB-1菌株。
该菌株自工业污水中筛选分离获得，菌落圆形，白色，不透明，表面光滑湿润，边缘规则，直径约1-2mm。
本发明提供的善变副球菌的有益效果是：
1)本发明的善变副球菌菌株具有好氧条件下进行反硝化的效果。在温度为30℃，初始总氮浓度为400mg/L的条件下，24h的总氮去除率为91％，24h的硝氮去除率为96％；
2)本发明的微生物菌剂活菌数高，能够降低购买菌种或微生物菌剂所需的费用，不破坏原始环境、无二次污染、处理效果好、使用方法简便、好氧脱氮等。
本发明还要求保护包含上述善变副球菌的微生物菌剂。
本发明的善变副球菌的发酵方法包括如下步骤：
(1)一级种子培养：无菌条件下，将善变副球菌接种于富集培养基中，置于25-35℃、100-150rpm条件下活化16-24小时，获得一级种子培养液；
(2)二级种子培养：无菌条件下，将步骤(1)所得的一级种子培养液按照1-3vol％的比例接种于富集培养基中，置于25-35℃、100-150rpm条件下活化16-24小时，获得二级种子培养液；
(3)发酵：待发酵培养基灭菌完毕后，将步骤(2)所得的二级种子培养液按照1-5vol％的比例接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃，通气比为(1-2):1、150-300rpm的条件下发酵，待溶解氧开始上升时停止发酵，得善变副球菌的发酵液。
进一步，所述富集培养基的组成为：酵母粉3-8g/L，蛋白胨5-15g/L，氯化钠5-15g/L，溶剂为水，且pH＝6.5-8。
优选的，所述富集培养基的组成为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，且pH＝6.5-8。
进一步，所述发酵培养基的组成为：碳源10-25g/L，氮源3-5g/L，Mg2+(1-3)×10- 2g/L，PO4 3-0.1-0.3g/L，Fe2+(0.5-2)×10-2g/L，Mn2+(1-3)×10-3g/L，溶剂为水，且pH＝6.5-8。
进一步，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、淀粉、乙酸钠或酒石酸钾钠中的一种或多种。
进一步，所述氮源选自酵母浸粉、蛋白胨、尿素、硫酸铵或硝酸钾中的一种或多种。
优选的，所述Mg2+的来源为硫酸镁、硝酸镁、氯化镁中的一种或多种，所述PO4 3-的来源为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种或多种，所述Mn2+的来源为氯化锰、硫酸锰、硝酸锰中的一种或多种，所述Fe2+的来源为硫酸亚铁、氯化亚铁、硫酸亚铁铵中的一种或多种。
微生物菌剂的制备方法中所述的通气比是指每分钟内通入发酵罐的空气体积与发酵液总体积之比。
该制备方法的有益效果是：采用本发明的发酵工艺，发酵周期缩短至18h，发酵残留营养物质低，活菌数高达260亿cfu/mL，菌体活力强。
本发明还要求保护使用上述善变副球菌的活化液和包含上述善变副球菌的微生物菌剂净化水体的方法，包括向水体中施加善变副球菌的活化液或包含善变副球菌的微生物菌剂的步骤。
优选的，善变副球菌的活化液和包含善变副球菌的微生物菌剂的添加量为10mg/L以上，更优选接种量为50-1000mg/L，最优选接种量为100-1000mg/L。
优选的，净化水体过程中控制温度为20-35℃，优选25-35℃，最优选32℃。
本发明还要求保护上述的善变副球菌和微生物菌剂在污水处理领域的应用，优选的，所述善变副球菌和微生物菌剂用于好氧条件下实现生物脱氮。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：菌株的筛选、分离与鉴定
1、富集
采集内蒙古、山东潍坊某工厂的污水，按10vol％的接种量接种至筛选培养基(丁二酸钠13g，七水合硫酸镁0.1g，十二水合磷酸氢二钠7.9g，磷酸二氢钾1.5g，硝酸钾3g，水1000mL，pH＝7.0±0.1)中富集，30℃恒温震荡培养箱中培养48h，得到一级富集筛选液；将一级富集筛选液按10vol％接种量接种至新鲜的筛选培养基中，30℃恒温震荡培养箱中培养48h，得到二级富集筛选液；将二级富集筛选液按10vol％接种量接种至新鲜的筛选培养基中，30℃恒温震荡培养箱中培养48h，得到三级富集筛选液，每级均有三个平行。
2、初筛
采用梯度稀释法将三级富集筛选液稀释到10-6，分别吸取10-3、10-4、10-5和10-6稀释液各200μL至分离培养基(丁二酸钠13g，七水合硫酸镁0.1g，十二水合磷酸氢二钠7.9g，磷酸二氢钾1.5g，硝酸钾3g，琼脂20g，水1000mL，pH＝7.0±0.1)所配制的琼脂平板培养皿中，涂布均匀后倒置于30℃条件下培养约48h至长出单菌落。挑选形态相异的单菌落转接至试管斜面分离培养基上，30℃条件下培养约48h，然后转移至4℃冰箱中保藏备用。
按上述分离方法共得到5株菌，分别编号为：YB-1、TW-1、MDS-1、XWH-1、QZW-1。
3、复筛
无菌环境中，将初筛得到的5株菌分别挑取1环接种于盛有100mL LB培养基(酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，调pH＝7.20)的250mL三角瓶中，30℃条件下静置培养48h进行活化，得活化液。
分别吸取5μL各活化液接种至含有100mL已灭菌的评价培养基(丁二酸钠13g，七水合硫酸镁0.1g，十二水合磷酸氢二钠7.9g，磷酸二氢钾1.5g，硝酸钾3g，水1000mL，pH＝7.0±0.2)的250mL三角瓶中，控制评价培养基中硝酸钾为唯一的氮源，于30℃、170r/min的条件下培养。用无菌水代替活化液作为空白，各实验组设置3个平行。定期检测培养基中的总氮含量。
总氮检测方法按照《HJ 636-2012水质总氮的测定碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》执行。结果如下：
表1.各菌株接种评价培养基后总氮检测结果
由表1中的数据可知，该5株菌种中YB-1、TW-1菌株对水中的总氮具有明显的去除能力，实验结果表明，YB-1菌株在48h内可以将总氮去除68.58％，TW-1菌株在48h内可以将总氮去除68.70％。
实施例2：
分子生物学鉴定
提取菌株YB-1的基因组DNA，并以此为模板扩增16S rDNA。
引物：16S rDNA-F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，
16S rDNA-R:5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。
后提取PCR产物，使用测序仪ABI3730-XL进行DNA测序。用NCBI Blast程序将拼接后的序列文件与NCBI 16S数据库中的数据进行比对，得到与待测物种序列相似性最大的物种信息，发现其下属于副球菌属，鉴定为善变副球菌(Paracoccus versutus)，将其命名为善变副球菌YB-1。
实施例3：善变副球菌的好氧反硝化实验
1、菌种的活化
无菌环境中挑取1环善变副球菌YB-1接入装有100mL的LB培养基(酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，调pH＝7.20)的250mL三角瓶中，后置于30℃、170rpm条件下培养24h，得到活化菌液，稀释活菌含量至50亿cfu/mL待用。
2、配制评价培养基进行好氧反硝化效果评价
评价培养基：丁二酸钠13g，七水合硫酸镁0.1g，十二水合磷酸氢二钠7.9g，磷酸二氢钾1.5g，硝酸钾3g，水1000mL，pH＝7.0±0.1。
无菌环境中，分别向装有100mL评价培养基的250mL顶空瓶中加入活化菌液100μl，置于30℃、170r/min条件下培养，每隔8h检测培养基中的总氮、硝酸盐氮含量，共设置1个用无菌水替代活化菌液的空白对照组。
总氮检测方法按照《HJ 636-2012水质总氮的测定碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》执行。
硝酸盐氮检测方法按照《061HJ 346-2007水质硝酸盐氮的测定紫外法》执行。
实验数据如下：
表2.菌株YB-1在评价培养基中的评价检测结果
由表2中的数据可知，评价培养基初始总氮在400mg/L左右，善变副球菌YB-1在24h的总氮去除率为91％，硝酸盐氮的24h去除率为96％。
实施例4：善变副球菌在高浓度总氮下的耐受实验
1、菌种的活化
无菌环境中挑取1环善变副球菌YB-1接入装有100mL的LB培养基(酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，调pH＝7.20)的250mL三角瓶中，后置于30℃、170r/min条件下培养24h，得到活化菌液，稀释活菌含量至50亿cfu/mL待用。
2、配置高浓度总氮评价培养基进行好氧反硝化效果评价
评价培养基：丁二酸钠13g，七水合硫酸镁0.1g，十二水合磷酸氢二钠7.9g，磷酸二氢钾1.5g，硝酸钾6g，水1000mL，pH＝7.0±0.1。
无菌环境中，分别向装有100mL评价培养基的250mL顶空瓶中加入活化菌液100μl，后置于30℃、170r/min条件下培养，每隔8h检测培养基中的总氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的含量，共设置1个用无菌水替代活化菌液的空白对照组。
总氮检测方法按照《HJ 636-2012水质总氮的测定碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》执行。
硝酸盐氮检测方法按照《061HJ 346-2007水质硝酸盐氮的测定紫外法》执行。
亚硝酸盐氮检测方法按照《GB 7493-1987水质亚硝酸盐氮的测定分光光度法》执行。
实验数据如下：
表3.菌株YB-1在高浓度总氮评价培养基中的评价检测结果
根据表3可知，善变副球菌YB-1在总氮含量约为800mg/L时，善变副球菌YB-1在实验过程中的16h及24h均检测到了亚硝酸盐氮的积累，证明其正在进行好氧反硝化过程中，硝酸盐氮的24h去除率为100％，总氮的24h去除率为53.54％。
实施例5：善变副球菌YB-1的耐盐性实验
1、菌种的活化
无菌环境中挑取1环善变副球菌YB-1接入装有100mL的LB培养基(酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，调pH＝7.20)的250mL三角瓶中，后置于30℃、120rpm条件下培养24h，得到活化菌液，稀释活菌含量至50亿cfu/mL待用。
2、菌株YB-1在不同盐度培养基中的生长情况
以去除氯化钠的LB培养基(酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，调pH＝7.20)为基础，在培养基中添加所需设定浓度的氯化钠。
实验分别设定的氯化钠浓度为：1％、2％、3％、4％、5％，序号分别为实验组A、实验组B、实验组C、实验组D、实验组E，向各个培养基中接入活化菌液100μl。
实验组A-E分别于30℃、170r/min条件下培养24h，使用纯净水稀释4倍测量其OD600吸光值A，结果如表4所示。
表4.菌株YB-1在不同盐度培养基中的生长情况
由表4可知，实验组A-D的OD600吸光值基本呈现“S”型的生长曲线，表明盐度在1-4％时对菌体的生长没有太大影响。实验组E的OD600吸光值在48h后依旧处于0.066，表示菌株在5％盐度的培养基中生长情况已经有明显的抑制，因此菌株YB-1的最高盐度耐受度在4％。
实施例6、善变副球菌在实际废水中的评价实验
1、菌种的活化
无菌环境中挑取1环善变副球菌YB-1接入装有100mL的LB培养基(酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，调pH＝7.20)的250mL三角瓶中，后置于30℃、170r/min条件下培养24h，得到活化菌液，稀释活性菌含量至50亿cfu/mL待用。
2、菌株YB-1在实际废水中的评价实验
实验污水取自山东淄博某工厂好氧池的污水。
分别向装有100mL山东淄博某工厂好氧池污水的250mL三角瓶中加入活化菌液100μl，置于30℃、170r/min条件下培养，每24h加入120μl甲醇作为生物活性碳源，每隔24h检测废水中的氨氮、总氮含量。
总氮检测方法按照《HJ 636-2012水质总氮的测定碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》执行。
氨氮检测方法按照《HJ 535-2009氨氮的测定-纳氏试剂分光光度法》执行。
表5.菌株YB-1在实际废水中的评价实验
由表5可知，在实际废水实验中，菌株YB-1的实验组在接种量为1000ppm时，实验4d后氨氮去除率为96％，总氮去除率为83％，因此菌株YB-1在实际含氮废水中的降解效果显著。
实施例7、微生物菌剂的制备
微生物菌剂的制备方法如下：
(1)一级种子培养：无菌环境中，挑取1环善变副球菌菌株YB-1接入装有100mL的LB培养基(酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，调pH＝7.20)的250mL三角瓶中，后置于30℃、170r/min条件下培养24h，得到一级种子培养液；
(2)二级种子培养：无菌环境中，将一级种子培养液分别转接5mL至四个装有500mL的LB培养基(酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，调pH＝7.20)的1000mL三角瓶中，后将其置于30℃、170r/min条件下培养24h，得到二级种子培养液；
(3)消毒灭菌：培养基物料均在配料罐中配料，然后打入50L发酵罐，发酵培养基的组成为：葡萄糖0.714％，乙酸钠0.7143％，酵母粉0.3571％，硫酸铵0.0714％，磷酸氢二钾0.0286％，硫酸镁0.01％，硫酸锰0.0007％，硫酸亚铁0.0036％，硫酸锌0.00007％，消泡剂0.03％，调pH＝7.20，配制定位30L，开始消毒灭菌。发酵罐实消条件：蒸汽直接进内层升温，110℃开始排汽，排汽时间：20分钟，排汽温度：115℃，发酵罐培养基实消条件：蒸汽直接进内层升温至118℃开始排汽，排汽时间30分钟，排汽温度121℃，消毒后体积约33L，然后冷却至30℃，等待接种；
(4)发酵：待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后，将步骤(2)所得的二级种子培养液按照1-5vol％的接种量接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃，通气比为(1-2):1、150-300rpm的条件下发酵，待溶氧开始上升时停止发酵，放料得发酵液；
(5)制备微生物菌剂：将步骤(4)所得的发酵液稀释至所需活菌数，即得微生物菌剂，该微生物菌剂与活化菌液在应用中具有相同的功能和效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一株善变副球菌(Paracoccus versutus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.29722。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，有效成分包含权利要求1所述的善变副球菌。
3.权利要求1所述善变副球菌的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)一级种子培养：无菌条件下，将善变副球菌接种于富集培养基中，置于25-35℃、100-150rpm条件下活化16-24小时，获得一级种子培养液；
(2)二级种子培养：无菌条件下，将步骤(1)所得的一级种子培养液按照1-3vol％的比例接种于富集培养基中，置于25-35℃、100-150rpm条件下活化16-24小时，获得二级种子培养液；
(3)发酵：待发酵培养基灭菌完毕后，将步骤(2)所得的二级种子培养液按照1-5vol％的比例接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃，通气比为(1-2):1、150-300rpm的条件下发酵，待溶解氧开始上升时停止发酵，得善变副球菌的发酵液。
4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，所述富集培养基的组成为：酵母粉3-8g/L，蛋白胨5-15g/L，氯化钠5-15g/L，溶剂为水，且pH＝6.5-8。
5.根据权利要求3或4所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：碳源10-25g/L，氮源3-5g/L，Mg2+(1-3)×10-2g/L，PO4 3-0.1-0.3g/L，Fe2+(0.5-2)×10-2g/L，Mn2+(1-3)×10-3g/L，溶剂为水，且pH＝6.5-8。
6.根据权利要求5所述的发酵方法，其特征在于，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、淀粉、乙酸钠或酒石酸钾钠中的一种或多种；
所述氮源选自酵母浸粉、蛋白胨、尿素、硫酸铵或硝酸钾中的一种或多种。
7.一种净化水体的方法，其特征在于，包括向水体中施加善变副球菌的活化液或权利要求2所述微生物菌剂的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述善变副球菌的活化液和微生物菌剂的添加量为10mg/L以上，更优选50-1000mg/L，最优选100-1000mg/L。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述净化水体过程中控制温度为20-35℃，优选25-35℃，最优选32℃。
10.权利要求1所述的善变副球菌和权利要求2所述的微生物菌剂在污水处理领域的应用，优选的，所述善变副球菌和微生物菌剂用于好氧条件下实现生物脱氮。
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| CN118146994A true CN118146994A (zh) | 2024-06-07 |
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