CN111607543B - 一株具有好氧反硝化功能的施氏假单胞菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于环境微生物及污水处理技术领域，具体涉及了一株具有好氧反硝化功能的菌株，可应用于皮革厂废水处理，所述的好氧反硝化菌株经鉴定为施氏假单胞菌，保藏号为：CGMCC No.20015。该菌株繁殖快、活性高、增殖底物广，在有氧环境中实现反硝化作用，使同步硝化反硝化发生几率大大增加，这一过程不仅解决了总氮污染问题，避免了二次污染，又可减少碳源使用，节约成本，减少反应损耗，提高整体脱氮效率，更能避免工程改造所需的高额基建费用，利用本申请所述菌株获得的好氧反硝化复合菌剂具有良好的应用前景。

Description

一株具有好氧反硝化功能的施氏假单胞菌及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物及污水处理技术领域，提供了一株具有好氧反硝化功能的施氏假单胞菌及其应用。

背景技术

目前，世界面临的突出环境问题是，总氮排放量远远超出受纳水体的环境容量，氮素污染已超过有机物污染成为影响地表水水环境质量的首要指标，严重影响河流和饮用水水源地的水环境质量，直接影响污染减排工作的绩效，水质持续改善面临巨大挑战。

污水厂作为我国城市水体的重要补给水源，深度控氮迫切需求，很多污水处理厂进水COD浓度过低，C/N比不足，加重污水厂运行负担，影响污水处理系统运行效能，为保证出水总氮达标，常规污水深度脱氮技术强烈依赖外部碳源投加，运行成本高，碳源“投不起”成为污水处理厂和工业园区污水处理系统总氮减排的“卡脖子”问题。

目前，主要通过物理、化学法和生物法去除废水中的氮，但物理化学法存在处理效果欠佳、二次污染、成本较高的问题，且只适用于去除废水中的氨氮，而生物法不仅可以去除氨氮、还可以去除有机氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮，除氮的同时还伴随着能够去除废水中的有机物，降低水中的COD。传统生物脱氮一般需要经过三个阶段才能完成脱氮过程：氨化、硝化和反硝化，传统的生物脱氮工艺主要包括A/O工艺、A2/O工艺、氧化沟工艺以及由其改进形成的新工艺。但是出水氨氮和总氮的标准越来越高，传统的生物脱氮工艺跟不上节奏，还存在一些比较大的需要解决的问题。

因此，从自然界筛选出更好的具有好氧反硝化功能的菌株来提高生物法处理氮元素的效率成为研究人员的重要任务之一。

发明内容

本发明针对上述技术存在的不足，提供一株具有好氧反硝化功能的菌株，可应用于皮革厂废水处理，所述的好氧反硝化菌株经鉴定为施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)，保藏号为：CGMCC No.20015。该菌株繁殖快、活性高、增殖底物广，在有氧环境中实现反硝化作用，使同步硝化反硝化发生几率大大增加，这一过程不仅解决了总氮污染问题，避免了二次污染，又可减少碳源使用，节约成本，减少反应损耗，提高整体脱氮效率，更能避免工程改造所需的高额基建费用，利用本申请所述菌株获得的好氧反硝化复合菌剂具有良好的应用前景。

本发明提供的具体技术方案是：

首先发明人通过筛选获得一株具有好氧反硝化功能的施氏假单胞菌，经试验发现该菌株可应用于皮革厂高指标废水的生物强化处理，该菌株形态特征如下，革兰氏阴性、无芽孢的短杆状。菌落淡黄色，边缘不规则，表面有褶皱、湿润、半透明，好氧。在废水的应用中能高效降解水体中的硝态氮，24h硝态氮含量可从476mg/L降至42.6mg/L，总氮去除率＞91％。

发明人对其进行了16SrDNA测序，其核苷酸序列如Seq ID No：1所示，该序列为该菌株的16SrDNA的全序列，所测得的16SrDNA序列进行BLAST比对，在分子水平上确定为施氏假单胞菌，命名为YJY20-03，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20015。

由于在自然环境中好氧反硝化菌不是优势菌种，可利用其好氧条件下能够在反硝化培养基中生长的特点进行富集培养和筛选分离。

其筛选过程如下：

(1)富集培养：在超净台中，移取10mL活性污泥样品加入已灭菌的100mL反硝化培养基中，在30-35℃，150-180r/min的恒温振荡器中连续培养，观察培养液的浑浊程度，取少量的培养液用二苯胺试剂和格里斯试剂定性检测，当培养液中无硝酸盐氮和亚硝酸盐氮时，取10mL富集1次的菌液加入已灭菌的100mL反硝化培养基中，提高培养基中硝态氮含量，依照上述方富集培养，共富集3次，得到的菌悬液用于分离纯化。

(2)分离纯化：通过稀释涂布平板法和平板划线法相结合进行菌种分离，完成富集培养后，在超净台中，用10倍梯度稀释法进行菌液稀释，然后取不同浓度的0.1mL菌液涂布于反硝化平板，单只放入30-35℃生化培养箱中培养。培养48h后，观察反硝化平板上的菌落情况，用灭菌的接种环挑取使反硝化平板变蓝的菌落，在反硝化培养基平板上划线纯化，划好将培养皿倒置放入30-35℃生化培养箱中培养，待长出菌落后，观察各菌落的形态特征。用灭菌的接种环挑取形态特征不同的单菌落，在反硝化平板上划线纯化，划好后放入30-35℃生化培养箱中倒置培养，如此重复，得到形态一致的纯菌落，将分离的纯菌落接种至斜面培养基上，在30-35℃生化培养箱中培养48h长出菌落以后，于4℃冰箱保存。

(3)复筛：将筛选出的好氧反硝化菌接种到已灭菌的100mL反硝化培养基中，在30-35℃，150-180r/min的恒温振荡器中活化12h，然后按照0.5％的接种量接种到已灭菌的反硝化液体培养基中，在相同条件下的恒温振荡器中连续培养72h，每24h取样，8000rpm离心5min，取上清液，测定培养前后培养液中总氮的含量。

将筛选到的菌株分别进行反硝化效果验证，取5-15μL冻存的施氏假单胞菌接种于含有100mL LB液体无菌培养基中，置于30-35℃，150-180rpm振荡培养至对数期；分别取种子液按照0.5％的比例接种到反硝化培养基中，测定反应前后培养液中总氮含量，培养液初始总氮含量为476mg/L，培养24h后，施氏假单胞菌的培养液剩余总氮含量为42.6mg/L。

发明人对上述筛选到的菌株进行了生物保藏，其保藏编号为CGMCC No.20015；

获得了上述具有好氧反硝化功能的施氏假单胞菌后，发明人进一步公开了其应用：可以将该具有好氧反硝化功能的施氏假单胞菌制成固体菌剂或液体菌剂单独接种到好氧池中，可以与活性污泥共同使用，也可以固定于各种填料上挂膜后投加到废水处理系统中。

其中，液体菌剂制备方法包括：

(1)菌种活化：取5-15μL冻存的施氏假单胞菌接种于含有100mL LB液体无菌培养基中，置于30-37℃，160-180rpm振荡培养至对数期；

(2)液体种子制备：将上述活化的菌种100mL转接到含有1000mL LB液体无菌培养基中，于30-37℃，160-180rpm振荡培养至对数期；

(3)种子罐发酵：将上述制备好的液体种子按照5％-10％v/v的接种量接种入装液量为60-70％的30L种子罐中扩大培养；

种子罐中培养基配方为：柠檬酸钠0.5-1.0％，硝酸钠0.2-0.5％，酵母粉0.2-0.5％，磷酸二氢钾0.01-0.03％，硫酸镁0.03-0.07％，硫酸亚铁0.001-0.002％，硫酸锰0.001-0.002％，水余量，pH 7.0-7.4；

无菌空气的通气比均为1:0.8-1.5，搅拌速度为160-220rpm，培养温度为30-35℃，发酵周期为18-24h；

(4)发酵罐发酵：将上述获得的种子液按5-10％v/v的接种量接入装液量为60-70％的2t发酵罐的培养基中培养，培养基及培养条件与种子罐发酵相同；

发酵结束后菌体数量达到2*10⁹-3.0*10¹⁰cfu/mL，将发酵完成后培养液出罐即得液体菌剂；

制备获得上述的液体菌剂后，在其基础上还可以获得固体菌剂，其制备方法如下：

(5)固体菌剂制备：发酵结束后，将上述发酵完成后的液体菌剂浓缩到原体积的三分之一，按照质量比添加4-10％的硅藻土与1.5-2.0％的麸皮吸附菌体，之后离心、干化处理获得固体菌剂；

所获得的菌剂含水率小于10％；经检测，其有效活菌数为1.5*10¹²-3.0*10¹²cfu/g；

上述具有好氧反硝化功能的施氏假单胞菌菌株的应用方法为：将培养所得施氏假单菌剂或其固体菌剂投入到预处理废水中。

更为具体的，上述施氏假单胞菌培养所得液体菌剂的有效活菌数为2*10⁹-3.0*10¹⁰cfu/mL，菌剂投加量为每立方废水加入0.1-5L液体菌剂；固体菌剂的有效活菌数为1.5*10¹²-3.0*10¹²cfu/g，菌剂投加量为每立方废水加入50-100g固体菌剂。

应用上述液体菌剂或固体菌剂进行好氧反硝化去除总氮时，调节废水溶氧为2-4mg/L，pH为7.0-8.0，温度控制在30-35℃。

更优选的，投加固体菌剂前可相应投加营养盐进行活化，可以辅助施氏假单胞菌菌更加快速生长繁殖，发挥作用；营养盐包括KH₂PO₄、K₂HPO₄、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂、FeCl₃，NaCl；

具体活化方法为：固体菌剂按用量接种于营养盐溶液中，其中固体菌剂按照每升营养盐溶液接种0.1-5g固体菌剂的接种量进行接种活化，活化条件为溶解氧2-4mg/L，pH7.0-7.5，温度28-37℃，曝气4-6h进行活化；

应用时固体菌剂以溶于营养盐溶液的形式进行应用，但是计算其用量时需要按照原始加入的固体菌剂质量进行换算；

活化过程中营养盐溶液组成如下：KH₂PO₄ 0.05-0.1g/L、K₂HPO₄ 0.1-0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1-0.5g/L、CaCl₂ 0.1-0.5g/L、FeCl₃ 0.001-0.01g/L，NaCl 10-15g/L

本发明的有益效果举例说明如下：

(1)好养反硝化菌剂可以在好氧池解决部分总氮(硝态氮)问题，减轻后期缺氧池总氮负担，同时在好氧池降解硝态氮可以促进硝化反应的进行，加强氨氮指标的降解；

(2)制革废水存在毒性强、氨氮高、碳氮比低等特点，采用传统硝化-反硝化工艺脱氮，需要外加大量的碳源和纯碱，且曝气量大、能耗高，造成污水处理成本高，本发明所提供的好养反硝化菌剂可在废水预处理工段(高COD、高总氮，其具体数值为COD3000-5000mg/L，总氮800-1000mg/L)投加应用，降解部分总氮指标的同时，可以消耗部分COD，减轻综合处理工段的负担；

(3)目前大部分城市污水处理厂处理工艺中不含有后置缺氧池，一旦好氧池出水总氮不达标(一般30-50mg/L)就很难处理，本发明所提供的好养反硝化菌剂的应用，可以和好的解决上述缺乏后置缺氧池的问题，保证出水总氮指标达标，从而避免工程改造所需的高额基建费用。

综上所述，本发明较现有技术极大的推进了好氧反硝化在污水脱氮中的应用，特别是在制革废水脱氮方面的工程化应用。

保藏信息，

保藏时间：2020年6月3日

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心

保藏编号：CGMCC No.20015

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

分类命名:施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)

附图说明

图1为本发明所述施氏假单胞菌在不同碳源下的反硝化效果示意图，

图2为本发明所述施氏假单胞菌在不同C/N下的反硝化效果示意图，

图3为本发明所述施氏假单胞菌在不同温度下的反硝化效果示意图，

图4为本发明所述施氏假单胞菌在不同pH下的反硝化效果示意图，

图5为本发明所述施氏假单胞菌在最佳反硝化条件下的反硝化效果示意图，

图6为皮革厂出水水质变化图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成，下述实施例中所采用的菌种均为保藏号CGMCC No.20015的菌种。

实施例1

一株新的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，其生物保藏编号为CGMCCNo.20015，其具体获得方法如下：

取某污水处理厂好氧池10mL活性污泥样品加入已灭菌的100mL反硝化培养基中(NO^3-含量400mg/L)，30℃，150r/min的恒温振荡器中连续培养，当培养液浑浊，经检测培养液中无硝酸盐氮和亚硝酸盐氮时，取10mL富集1次的菌液加入已灭菌的100mL反硝化培养基中，提高培养基中硝态氮含量至600mg/L，依照上述方富集培养，共富集3次，得到的菌悬液用于分离纯化。通过稀释涂布平板法和平板划线法相结合进行菌种分离，在超净台中，用10倍梯度稀释法进行菌液稀释，然后取不同浓度的0.1mL菌液涂布于反硝化平板，放入30℃生化培养箱中培养。培养48h后，用灭菌的接种环挑取使反硝化平板变蓝的菌落，在反硝化培养基平板上划线纯化，划好将培养皿倒置放入30℃生化培养箱中培养，待长出菌落后，继续纯化，直至得到形态一致的纯菌落，将分离的纯菌落接种至斜面培养基上，在30℃生化培养箱中培养48h长出菌落以后，于4℃冰箱保存；

经过富集、分离纯化得到的纯菌进行反硝化效果验证，将筛选到的好氧反硝化菌接种到已灭菌的100mL反硝化培养基中(NaNO₃ 2.42g/L(NO₃-N约400mg/L)，KH₂PO₄ 1.0g/L，FeSO₄ 0.5g/L，CaCl₂ 0.2g/L，MgSO₄ 1.0g/L，柠檬酸钠8.5g/L，pH 7.0，1％溴百里酚蓝指示剂1mL，121℃灭菌20min。)，在35℃，180r/min的恒温振荡器中活化12h，然后按照0.5％的接种量接种到已灭菌的反硝化液体培养基中，在相同条件下的恒温振荡器中连续培养72h，每24h取样，8000rpm离心5min，取上清液，测定培养前后培养液中总氮的含量，培养液初始总氮含量为476mg/L，培养24h后，总氮剩余42.6mg/L，总氮降解91.05％；

发明人对其进行了16SrDNA测序，其核苷酸序列如Seq ID No：1所示，该序列为该菌株的16SrDNA的全序列，所测得的16SrDNA序列进行BLAST比对，在分子水平上确定为施氏假单胞菌，并对该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心进行了生物保藏，保藏编号为CGMCC No.20015，经检测其为存活状态。

实施例2

实施例1保藏的好氧反硝化菌剂的反硝化性能的研究：

验证培养基为NaNO₃ 2.42g/L(NO₃-N约400mg/L)，KH₂PO₄ 1.0g/L，FeSO₄0.5g/L，CaCl₂ 0.2g/L，MgSO₄ 1.0g/L，柠檬酸钠8.5g/L，pH 7.0，1％溴百里酚蓝指示剂1mL，121℃灭菌20min。

不同碳源对好氧反硝化菌剂的反硝化影响：分别以乙酸钠、琥珀酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖、蔗糖、甲醇为唯一碳源，进行反硝化效果验证，32℃、170rpm培养24h，结果表明好氧反硝化菌剂以蔗糖、甲醇为碳源反硝化效果不好，总氮去除率仅为50％左右，且亚硝态氮生成量较多，柠檬酸钠为碳源时，总氮去除率在95％以上，且亚硝态氮生成量较低，仅为5％，说明在好氧情况下发生了反硝化，具体可参考附图1；

不同碳氮比对好氧反硝化菌剂的反硝化影响：以验证培养基NaNO₃ 2.42g/L(NO₃-N约400mg/L)，KH₂PO₄ 1.0g/L，FeSO₄ 0.5g/L，CaCl₂ 0.2g/L，MgSO₄ 1.0g/L，柠檬酸钠8.5g/L，pH 7.0为基础，通过调节柠檬酸钠和硝酸钠的含量，使C/N比为6、7、8、9、10、11，将培养好的好氧反硝化菌剂按照0.5％的接种量接种到上述培养基中，32℃、170rpm培养24h，取样，8000rpm离心5min，取上清液，测定培养前后培养液中总氮的含量，实验结果表明，随着C/N的增加，好氧反硝化菌剂的反硝化效果增强，当C/N大于9时，总氮的去除率可达到92％以上，亚硝态氮生成量逐渐减少，在COD充足的情况下，亚硝态氮继续被还原为一氧化二氮或一氧化氮或氮气，具体可参考附图2；

不同温度对好氧反硝化菌剂的反硝化影响：以验证培养基NaNO₃ 2.42g/L(NO₃-N约400mg/L)，KH₂PO₄ 1.0g/L，FeSO₄ 0.5g/L，CaCl₂ 0.2g/L，MgSO₄ 1.0g/L，柠檬酸钠8.5g/L，pH7.0为基础，将培养好的好氧反硝化菌剂按照0.5％的接种量接种到上述培养基中，分别于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、42℃、170rpm摇床上培养24h，取样，8000rpm离心5min，取上清液，测定培养前后培养液中总氮的含量，实验结果表明，随着温度的升高，好氧反硝化菌剂的反硝化效果增强，当温度升高至30-35℃时，好氧反硝化活性最强，总氮去除率达到94.6％，但温度在继续升高，好氧反硝化活性将受到影响，具体可参考附图3；

不同pH对好氧反硝化菌剂的反硝化影响：以验证培养基NaNO₃ 2.42g/L(NO₃-N约400mg/L)，KH₂PO₄ 1.0g/L，FeSO₄ 0.5g/L，CaCl₂ 0.2g/L，MgSO₄ 1.0g/L，柠檬酸钠8.5g/L为基础，用5％的NaOH分别将pH调至5、6、7、8、9。将培养好的好氧反硝化复合菌剂按照0.5％的接种量接种到上述培养基中，分别于32℃、170rpm摇床上培养24h，取样，8000rpm离心5min，取上清液，测定培养前后培养液中总氮的含量，实验结果表明，最适pH为7-8，好氧反硝化菌剂的反硝化效果最强，总氮去除率达到90％，当pH过高，好氧反硝化活性将受到影响，具体可参考附图4；

根据上述实验结果重新设计实验条件，即以柠檬酸钠为碳源，C/N比为9-11，pH调节7.0-8.0，温度控制30-35℃，进行反硝化效果验证，结果见图5，震荡处理24h后体系中总氮和COD去除率均在95％以上，且未检测到亚硝态氮，因此最终确定该菌株进行好氧反硝化时的最佳处理条件：调节废水溶氧为2-4mg/L，C/N控制在9-11，pH为7.0-8.0，温度控制在30-35℃。

实施例3

具有好氧反硝化功能的固体菌剂制备方法包括：

(1)菌种活化：取5-15μL冻存的施氏假单胞菌接种于含有100mL LB液体无菌培养基中，置于30-37℃，160-180rpm振荡培养至对数期；

(2)液体种子制备：将上述活化的菌种100mL转接到含有1000mL LB液体无菌培养基中，于30-37℃，160-180rpm振荡培养至对数期；

(3)种子罐发酵：将上述制备好的液体种子按照5％-10％v/v的接种量接种入装液量为60-70％的30L种子罐中扩大培养；

种子罐中培养基配方为：柠檬酸钠0.5-1.0％，硝酸钠0.2-0.5％，酵母粉0.2-0.5％，磷酸二氢钾0.01-0.03％，硫酸镁0.03-0.07％，硫酸亚铁0.001-0.002％，硫酸锰0.001-0.002％，水余量，pH 7.0-7.4；

无菌空气的通气比均为1:0.8-1.5，搅拌速度为160-220rpm，培养温度为30-35℃，发酵周期为18-24h；

(4)发酵罐发酵：将上述获得的种子液按5-10％v/v的接种量接入装液量为60-70％的2t发酵罐的培养基中培养，培养基及培养条件与种子罐发酵相同；

发酵结束后菌体数量达到2*10⁹-3.0*10¹⁰cfu/mL，将发酵完成后培养液出罐即得液体菌剂；

制备获得上述的液体菌剂后，在其基础上还可以获得固体菌剂，其制备方法如下：

(5)固体菌剂制备：发酵结束后，将上述发酵完成后的液体菌剂浓缩到原体积的三分之一，按照质量比添加4-10％的硅藻土与1.5-2.0％的麸皮吸附菌体，之后离心、干化处理获得固体菌剂；所获得的菌剂含水率小于10％；经检测，其有效活菌数为1.5*10¹²-3.0*10¹²cfu/g。

实施例4

山东滨州阳信一皮革有限公司生产的废水COD 2000-4000mg/L，氨氮550mg/L，有机氮220mg/L，总氮770mg/L，盐度15000-20000mg/L，属于皮革行业高浓度废水，处理难度极大。配套污水处理站设计处理量1500m3/d，出水水质均达不到排放标准。

本实施例中将实施例施式假单胞菌固体菌剂按照每立方废水加入80g固体菌剂的用量投加，固体菌剂的有效活菌数为2.0*10¹²cfu/g，

投加前首先将施式假单胞菌固体菌剂按照按照每升营养盐溶液接种0.1-5g固体菌剂的接种量进行接种活化，具体活化方法为：将称量好的固体菌剂按照上述比例首先接种于营养盐溶液中进行活化，活化条件为溶解氧2-4mg/L，pH7.5，温度30℃，曝气5h进行活化；活化过程中营养盐溶液组成如下：KH₂PO₄0.05-0.1g/L、K₂HPO₄ 0.1-0.5g/L、MgSO₄·7H₂O0.1-0.5g/L、CaCl₂ 0.1-0.5g/L、FeCl₃ 0.001-0.01g/L，NaCl 10-15g/L；

应用时固体菌剂以溶于营养盐溶液的形式进行应用，但是计算其用量时需要按照原始加入的固体菌剂质量进行换算；将活化好的菌剂加入到好氧池中，调节废水溶氧为2-4mg/L，pH为7.0-8.0，温度控制在30-35℃，结合“源头管控”、“优化预处理”等相关技术方案进行启动调试，系统预调试3d后进行体系进出水指标的跟踪检测，结果如图6所示，随着运行天数的增加，出水各指标稳步下降，运行约两周后体系出水的各指标均能达标排放且处理效果稳定，COD去除率由78.40％提高至89.62％，氨氮去除率由22.36％提高至92.46％，总氮去除率由31.17％提高至90.12％，运行费用相应降低了50％以上，实现了高盐高总氮皮革废水的高效处理。

序列表

<110> 黄河三角洲京博化工研究院有限公司

<120> 一株具有好氧反硝化功能的施氏假单胞菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1404

<212> DNA

<213> 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)

<400> 1

gtaccgtccc cccgaaggtt agactagcta cttctggagc aacccactcc catggtgtga 60

cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgtga cattctgatt cacgattact 120

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Claims (8)

1.一株具有好氧反硝化功能的菌株，其生物保藏编号为CGMCC No.20015，属于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，命名为YJY20-03。

2.权利要求1所述具有好氧反硝化功能的菌株在污水处理中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：将所述菌株制备为液体菌剂或固体菌剂，投加到污水处理系统中。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述液体菌剂的制备方法如下：

(1)菌种活化：取5-15μL冻存的施氏假单胞菌接种于含有100mL LB液体无菌培养基中，置于30-37℃，160-180rpm振荡培养至对数期；

(2)液体种子制备：将上述活化的菌种100mL转接到含有1000mL LB液体无菌培养基中，于30-37℃，160-180rpm振荡培养至对数期；

(3)种子罐发酵：将上述制备好的液体种子按照5％-10％v/v的接种量接种入装液量为60-70％的30L种子罐中扩大培养；

无菌空气的通气比均为1:0.8-1.5，搅拌速度为160-220rpm，培养温度为30-35℃，发酵周期为18-24h；

(4)发酵罐发酵：将上述获得的种子液按5-10％v/v的接种量接入装液量为60-70％的2t发酵罐的培养基中培养，培养基及培养条件与种子罐发酵相同；

发酵结束后菌体数量达到2×10⁹-3.0×10¹⁰cfu/mL，将发酵完成后培养液出罐即得液体菌剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述种子罐中培养基配方为：柠檬酸钠0.5-1.0％，硝酸钠0.2-0.5％，酵母粉0.2-0.5％，磷酸二氢钾0.01-0.03％，硫酸镁0.03-0.07％，硫酸亚铁0.001-0.002％，硫酸锰0.001-0.002％，水余量，pH 7.0-7.4。

6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述固体菌剂的制备方法如下：

制备获得液体菌剂后，将上述发酵完成后的液体菌剂浓缩到原体积的三分之一，按照质量比添加4-10％的硅藻土与1.5-2.0％的麸皮吸附菌体，之后离心、干化处理获得固体菌剂；所获得的菌剂含水率小于10％；经检测，其有效活菌数为1.5×10¹² -3.0×10¹² cfu/g。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述液体菌剂投加量为每立方废水加入0.1-5L液体菌剂；固体菌剂的投加量为每立方废水加入50-100g固体菌剂。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：应用液体菌剂或固体菌剂进行好氧反硝化去除总氮时，调节废水溶氧为2-4mg/L，pH为7.0-8.0，温度控制在30-35℃。

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