CN116622556B - 一种耐低温高碱性高效脱氮菌及其筛选方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种耐低温高碱性高效脱氮菌及其筛选方法、应用。该菌株名称为反应假单胞菌(Pseudomonas reactans)WL20‑3，保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏名称为WL20‑3，其保藏号为：CGMCCNO.25785，分类命名为Pseudomonas reactans，保藏日期为2022年9月23日，保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。该菌株具有多重耐受性，同时具有耐受低温、高碱性等多种环境胁迫的优点，能够适用于寒冷地区、碱性废水等多种环境胁迫下的生物脱氮。
Description
技术领域
本发明属于脱氮微生物技术领域，具体涉及一种耐低温高碱性高效脱氮菌及其筛选方法、应用。
背景技术
随着经济的快速发展，农业和制造业活动中产生的大量氮化合物不断被排放到地下水、湖泊和河流中，造成水体富营养化，增加了人类高铁血红蛋白血症、膀胱癌和肺癌的风险。因此，水体氮去除已成为全世界亟待解决的重要问题。相对于物理或化学法，生物法具有高效、低能耗、环境友好、无二次污染等优点，在脱氮方面得到了更广泛的应用。相比于其它脱氮工艺，异养硝化-好氧反硝化(HN-AD)具有较明显的优点：(1)HN-AD菌可实现碳氮同除；(2)HN-AD过程可在一个反应器中完成，节约占地面积和运行成本；(3)HN-AD菌生长快，处理效率高；(4)HN-AD菌具有更强的抗逆性。
尽管HN-AD脱氮的研究逐渐成熟，但由于实际应用中各种问题的干扰，许多污水处理厂仍难以满足日益严格的出水标准，其中主要包括低温和碱性废水处理等难题。在我国北方地区特别是东北地区的冬季，年平均气温约为5℃，部分地区水温甚至在0℃左右。为了提高低温条件下的生物脱氮效率，在工程应用中往往需要借助热力设备，极大的增加了经济成本。此外，HN-AD菌对pH条件十分敏感，最适宜的生长条件为中性或弱碱性，对于具有高碱度的化工、造纸、食品等工业废水，大多数HN-AD菌无法正常进行生长增殖，发挥脱氮功能。
近年来，国内外已经有一些耐低温性能或耐高碱性菌种的报道，其中耐低温菌株申请的国家发明专利有3项，即申请号为202011466402.2的发明专利公布了一种耐低温脱氮菌Pseudomonas sp.LT 6及其应用，该专利菌株在10℃条件下，对氨氮的脱除效率约为53.30％。申请号为201210152921.0的发明专利公布了一种耐低温假单胞菌及其应用，该专利提供了专利菌株在10℃条件下可以去除83.33％的硝态氮。申请号为202210601347.6的发明专利公布了一种耐低温复合脱氮菌及在污水处理中的应用，该专利涉及Rahnellaaquatilis WS33、Pseudomonas sp.DT04和Pseudomonas sp.DT06 3株菌组成的复合菌剂，在6℃低温条件下，接种复合菌4天后，氨氮去除率为35.9％，硝态氮去除率为47.2％，亚硝态氮去除率30.7％。耐高碱性菌株申请的国家发明专利共1项，即申请号为202210064085.4的发明专利公布了一株耐酸耐碱快速脱氮的好氧反硝化细菌及其应用，该专利涉及一株从养殖池塘的水样以及泥样筛选分离中分离得到的PseudomonasplecoglossicidaZY 3，该专利菌株能在pH值为5.5-10.5下，分别利用氨氮、硝态氮和亚硝态氮作为唯一无机氮源进行好氧硝化和反硝化脱氮，且各种氮的去除率均高于80％。
尽管已有能耐低温或耐高碱性脱氮专利菌株，但能同时耐受低温和高碱性的高效脱氮专利菌株却未见报道。综上所述，能在寒冷地区同时处理高碱含氮污水的多功能脱氮菌株，对于处理实际工业废水，具有更重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种耐低温耐碱多重胁迫高效脱氮菌株，该菌株具有多重耐受性，同时具有耐受低温、高碱性等多种环境胁迫的优点，能够适用于寒冷地区、碱性废水等多种环境胁迫下的生物脱氮。
本发明第二个目的是为了提供该耐低温高碱性脱氮菌的筛选方法。
本发明第三个目的是为了提供该耐低温高碱性脱氮菌的应用。
为实现上述目的，本发明是采用由以下技术措施构成的技术方案来实现的。
一种耐低温高碱性高效脱氮菌株，名称为反应假单胞菌(Pseudomonas reactans)WL20-3，保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏名称为WL20-3，其保藏号为：CGMCC NO.25785，分类命名为Pseudomonas reactans，保藏日期为2022年9月23日，保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
作为本发明的一种优选方案，所述反应假单胞菌(Pseudomonas reactans)WL20-3的生物学特征为：
(1)在营养琼脂培养基上30℃培养24小时后，形成表面光滑湿润、不透明、边缘完整隆起呈现圆形的白色菌落；
(2)能在(NH4)2SO4、NaNO3、NaNO2为唯一氮源的液体培养基上生长；
(3)反应假单胞菌(Pseudomonas reactans)WL20-3生长所需温度为4-40℃，最适宜生长温度为30℃；生长所需pH为7.0-11.0，最适pH为7.0-9.0；
(4)16S rRNA基因序列
对反应假单胞菌(Pseudomonas reactans)WL20-3的16S rRNA基因序列进行PCR扩增、测序以及BLAST比对，结果显示，反应假单胞菌(Pseudomonas reactans)WL20-3的16SrRNA基因序列与Pseudomonas reactans strain Ippbc Ab03相似性最高，具有高度相似性，其16S rRNA基因序列见SEQ ID NO.1。注意的是，先前关于反应假单胞菌(Pseudomonasreactans)包括Pseudomonas reactans strain Ippbc Ab03在内，均未曾报道过其具有脱氮功能，由此可确定该反应假单胞菌(Pseudomonas reactans)WL20-3属于Pseudomonasreactans种中的新型菌株。
本发明另一个方面是提供了该耐低温高碱性高效脱氮菌株的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：
a、菌株的富集与分离：取脱水污泥样品于细菌富集培养基中，制备菌悬液；吸取菌悬液移至细菌富集培养基中，振荡培养，为第一个富集培养周期，以此类推，进行多次富集培养；后稀释液涂布于同时硝化反硝化培养基平板上，待平板上长出单菌落，挑取不同单菌落；
b、菌株纯化：挑取步骤a单菌落并在LB培养基中纯化2～3次；
c、异养硝化菌株的初步筛选：将上述纯化菌株接入硝化培养基中，于4℃条件下进行硝化性能测试，采用氨氮分析测试盒进行显色分析，挑选在4℃条件下脱氮性能较好的菌株；
d、好氧反硝化菌株的初步筛选：将步骤c中挑选的菌株接入到反硝化培养基中，于4℃条件下进行反硝化性能测试，采用阴离子色谱对溶液中硝酸盐、亚硝酸盐进行分析，从中挑选出在4℃条件下脱氮性能较好的菌株，该菌株为耐低温异养硝化-好氧反硝化菌株；
e、低温高碱性脱氮菌株复筛：将经过步骤d筛选的菌株接种于pH11.0的硝化培养基和反硝化培养基中，于4℃条件下培养，最终筛选到耐低温高碱性异养硝化-好氧反硝化菌株。
作为本发明的一种优选方案，所述培养基按下述比例配制：
LB培养基(g/L)：5g/L酵母浸出粉，10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠；
细菌富集培养基：5g/L葡萄糖，1g/L硝酸钠，4g/L磷酸二氢钾，6g/L磷酸氢二钾，1g/L氯化钠，0.2g/L硫酸镁；
硝化反硝化培养基：0.078g/L硫酸氨，0.101g/L硝酸钠，0.082g/L亚硝酸钠2.81g/L六水琥珀酸钠，0.2g/L七水硫酸镁，1.50g/L磷酸二氢钾，10.09g/L十二水磷酸氢二钠，2mL微量元素溶液/L培养基；
硝化培养基：0.236g/L硫酸氨，2.81g/L六水琥珀酸钠，0.2g/L七水硫酸镁，1.5g/L磷酸二氢钾，10.09g/L十二水磷酸氢二钠，2mL微量元素溶液/L培养基；
反硝化培养基：0.303g/L硝酸钠，2.81g/L六水琥珀酸钠，0.2g/L七水硫酸镁，1.5g/L磷酸二氢钾，10.09g/L十二水磷酸氢二钠，2mL微量元素溶液/1L培养基；
微量元素溶液：5g/L乙二胺四乙酸二钠，3.92g/L七水硫酸锌，5.50g/L氯化钙，5.06g/L四水氯化锰，5.0g/L七水硫酸亚铁，1.10g/L四水钼酸氨，1.57g/L五水硫酸铜，1.61g/L六水氯化钴。使用前优选121℃湿热灭菌20min。
作为本发明的一种优选方案，步骤a中的富集培养周期为2d，富集次数为3次，培养的条件为：4℃、160rpm恒温摇床。
本发明的第三方面，提供了耐低温高碱性高效脱氮菌株的应用，上述耐低温高碱性高效脱氮菌株在脱氮中的应用。
作为本发明的一种优选方案，上述耐低温高碱性高效脱氮菌株在生活污水中的应用。
作为本发明的一种优选方案，取污水处理厂的进水，投加碳源调节C/N比为10，调节污水pH为11.0，然后将耐低温高碱性高效脱氮菌株按OD600＝0.3接入调配后的生活污水中，4℃、120rpm培养。
优选地，所述应用中，含氮水体中的氨氮、硝态氮、亚硝态氮的浓度在50mg/L以下。
优选地，所述应用中，含氮水体中的氨氮、硝态氮、亚硝态氮的降解过程温度在3～35℃。
优选地，所述应用中，含氮水体中的氨氮、硝态氮、亚硝态氮的降解过程pH在7.0～11.0。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明的反应假单胞菌(Pseudomonas reactans)WL20-3是首次报道的具有脱氮性能的假单胞菌物种，是一种新型的假单胞菌脱氮菌株。
2、本发明所述菌株WL20-3能够很好地适应低温条件，能够在极低温度4℃条件下高效去除水体中氨氮、硝态氮及亚硝态氮；能够耐受的低温条件显著低于目前已报道的专利菌株。可用于我国北方寒冷地区冬季的污水生物脱氮处理，强化低温条件下的快速脱氮。
3、本发明所述菌株WL20-3在7.0～11.0的宽pH范围下保持较高脱氮活性，具有处理盐碱地废水、在化工、石油和造纸等含氮工业废水的良好应用前景。
4、本发明所述菌株WL20-3同时具有耐受低温、高碱性双重胁迫的优点，能够在低温条件下同时进行高碱性废水进行脱氮的优点，该菌株在4℃、pH11.0条件下去除100％氨氮、100％硝态氮和97.76％亚硝态氮，具有更广阔的应用价值。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为菌株WL20-3系统发育树图；
图2为菌株WL20-3在4℃和pH11.0条件下对氨氮的去除效果对比图；
图3为菌株WL20-3在4℃和pH11.0条件下对硝态氮的去除效果对比图；
图4为菌株WL20-3在4℃和pH11.0条件下对亚硝态氮的去除效果对比图；
图5为菌株WL20-3在4℃和pH11.0条件下对混合氮的去除效果对比图；
图6为菌株WL20-3在生活污水处理中的脱氮效果对比图；
图7为菌株WL20-3的全基因组图谱。是采用二代+三代即Illumina Hiseq+PacBio的测序方式，每个样品同时提供不低于基因组100×的PacBio测序数据和100×Illumina测序数据，保证更完整更准确的组装，完成图可以避免小质粒(＜15kb)信息的丢失，保证获得包含质粒的完整基因组。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对发明权利要求的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。虽然相信本领域普通技术人员充分了解以下术语，但仍陈述以下定义以有助于说明本发明所公开的主题。
一种耐低温高碱性高效脱氮菌株，名称为反应假单胞菌(Pseudomonas reactans)WL20-3，保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏名称为WL20-3，其保藏号为：CGMCC NO.25785，分类命名为Pseudomonas reactans，保藏日期为2022年9月23日，保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
作为本发明的一种优选实施方式，所述反应假单胞菌(Pseudomonas reactans)WL20-3的生物学特征为：
(1)在营养琼脂培养基上30℃培养24小时后，形成表面光滑湿润、不透明、边缘完整隆起呈现圆形的白色菌落；
(2)能在(NH4)2SO4、NaNO3、NaNO2为唯一氮源的液体培养基上生长；
(3)反应假单胞菌(Pseudomonas reactans)WL20-3生长所需温度为4-40℃，最适宜生长温度为30℃；生长所需pH为7.0-11.0，最适pH为7.0-9.0；
(4)16S rRNA基因序列
对反应假单胞菌(Pseudomonas reactans)WL20-3的16S rRNA基因序列进行PCR扩增、测序以及BLAST比对，结果显示，反应假单胞菌(Pseudomonas reactans)WL20-3的16SrRNA基因序列与Pseudomonas reactans strain Ippbc Ab03相似性最高，具有高度相似性，其16S rRNA基因序列见SEQ ID NO.1。注意的是，先前关于反应假单胞菌(Pseudomonasreactans)包括Pseudomonas reactans strain Ippbc Ab03在内，均未曾报道过其具有脱氮功能，由此可确定该反应假单胞菌(Pseudomonas reactans)WL20-3属于Pseudomonasreactans种中的新型菌株。
本发明另一个方面是提供了该耐低温高碱性高效脱氮菌株的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：
a、菌株的富集与分离：取脱水污泥样品于细菌富集培养基中，制备菌悬液；吸取菌悬液移至细菌富集培养基中，振荡培养，为第一个富集培养周期，以此类推，进行多次富集培养；后稀释液涂布于同时硝化反硝化培养基平板上，待平板上长出单菌落，挑取不同单菌落；
b、菌株纯化：挑取步骤a单菌落并在LB培养基中纯化2～3次；
c、异养硝化菌株的初步筛选：将上述纯化菌株接入硝化培养基中，于4℃条件下进行硝化性能测试，采用氨氮分析测试盒进行显色分析，挑选在4℃条件下脱氮性能较好的菌株；
d、好氧反硝化菌株的初步筛选：将步骤c中挑选的菌株接入到反硝化培养基中，于4℃条件下进行反硝化性能测试，采用阴离子色谱对溶液中硝酸盐、亚硝酸盐进行分析，从中挑选出在4℃条件下脱氮性能较好的菌株，该菌株为耐低温异养硝化-好氧反硝化菌株；
e、低温高碱性脱氮菌株复筛：将经过步骤d筛选的菌株接种于pH11.0的硝化培养基和反硝化培养基中，于4℃条件下培养，最终筛选到耐低温高碱性异养硝化-好氧反硝化菌株。
作为本发明的一种优选实施方式，所述培养基按下述比例配制：
LB培养基(g/L)：5g/L酵母浸出粉，10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠；
细菌富集培养基：5g/L葡萄糖，1g/L硝酸钠，4g/L磷酸二氢钾，6g/L磷酸氢二钾，1g/L氯化钠，0.2g/L硫酸镁；
硝化反硝化培养基：0.078g/L硫酸氨，0.101g/L硝酸钠，0.082g/L亚硝酸钠2.81g/L六水琥珀酸钠，0.2g/L七水硫酸镁，1.50g/L磷酸二氢钾，10.09g/L十二水磷酸氢二钠，2mL微量元素溶液/L培养基；
硝化培养基：0.236g/L硫酸氨，2.81g/L六水琥珀酸钠，0.2g/L七水硫酸镁，1.5g/L磷酸二氢钾，10.09g/L十二水磷酸氢二钠，2mL微量元素溶液/L培养基；
反硝化培养基：0.303g/L硝酸钠，2.81g/L六水琥珀酸钠，0.2g/L七水硫酸镁，1.5g/L磷酸二氢钾，10.09g/L十二水磷酸氢二钠，2mL微量元素溶液/1L培养基；
微量元素溶液：5g/L乙二胺四乙酸二钠，3.92g/L七水硫酸锌，5.50g/L氯化钙，5.06g/L四水氯化锰，5.0g/L七水硫酸亚铁，1.10g/L四水钼酸氨，1.57g/L五水硫酸铜，1.61g/L六水氯化钴。使用前优选121℃湿热灭菌20min。
作为本发明的一种优选实施方式，步骤a中的富集培养周期为2d，富集次数为3次，培养的条件为：4℃、160rpm恒温摇床。
本发明的第三方面，提供了耐低温高碱性高效脱氮菌株的应用，上述耐低温高碱性高效脱氮菌株在脱氮中的应用。
作为本发明的一种优选实施方式，上述耐低温高碱性高效脱氮菌株在生活污水中的应用。
作为本发明的一种优选实施方式，取污水处理厂的进水，投加碳源调节C/N比为10，调节污水pH为11.0，然后将耐低温高碱性高效脱氮菌株按OD600＝0.3接入调配后的生活污水中，4℃、120rpm培养。
优选地，所述应用中，含氮水体中的氨氮、硝态氮、亚硝态氮的浓度在50mg/L以下。
优选地，所述应用中，含氮水体中的氨氮、硝态氮、亚硝态氮的降解过程温度在4～30℃。
优选地，所述应用中，含氮水体中的氨氮、硝态氮、亚硝态氮的降解过程pH在7.0～11.0。
以下将参考实施例对本申请进行进一步的详细解释。然而，本领域技术人员应理解，这些实施例仅为了说明的目的提供，而不是意图限制本申请。
实施例
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限定本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本申请不应解释为受限于所述的具体实施例。
实施例1
耐低温高碱性高效脱氮菌株的分离、筛选和鉴定：
采用富集培养法从四川某污水处理厂脱水污泥中分离得到，具体步骤如下。
(1)菌株的富集与分离：将50mL细菌富集培养基装入100mL锥形瓶中并灭菌，分别取2.0g脱水污泥于灭菌后的细菌富集培养基中，4℃、180rpm摇床培养3d。取5mL混合液转接至新鲜的富集培养基中培养3代，每代3d。取1mL富集培养3代后的菌液用无菌水进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀释，将稀释液涂布于同时硝化反硝化培养基平板上，于30℃培养箱中培养。待平板上长出单菌落，挑取不同单菌落。
(2)菌株纯化：挑取单菌落并在LB培养基中纯化2～3次。
(3)异养硝化菌株的初步筛选：用牙签挑取适量上述菌体于LB培养基中，4℃、160rpm摇床培养3d。8000×g，离心1min收集菌体，按照OD600＝0.3接种于硝化培养基中，4℃、120rpm培养48h，采用氨氮分析测试盒进行显色分析，挑选在4℃条件下脱氮性能较好的菌株。
(4)好氧反硝化菌株的初步筛选：将上述挑选的异养硝化菌株接种于LB培养基中，4℃、160rpm摇床培养3d。8000×g，离心1min收集菌体，按照OD600＝0.3接种于反硝化培养基中，4℃、120rpm培养72h，采用阴离子色谱对溶液中硝酸盐、亚硝酸盐进行分析。
(6)低温高碱性脱氮菌株筛选：挑取在4℃条件下具有较好脱氮性能的异养硝化-好氧反硝化菌株，接种至装有LB培养基的三角瓶中，30℃，160rpm培养16h，取适量菌液，8000×g，离心1min收集菌体，用无菌水洗涤2～3次，按照OD600＝0.3接种于100mL硝化培养基、反硝化培养基中，调节培养基pH值为11.0，于4℃、120rpm培养60h时，取菌液2mL，8000×g，离心1min取上清，0.22μm滤膜过滤，分别采用离子色谱仪测定NO2 -、NO3 -、NH4 +浓度，最终筛选到耐低温高碱性异养硝化-好氧发硝化菌株。
上述步骤中，
LB培养基(g/L)：5g/L酵母浸出粉，10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠；
细菌富集培养基：5g/L葡萄糖，1g/L硝酸钠，4g/L磷酸二氢钾，6g/L磷酸氢二钾，1g/L氯化钠，0.2g/L硫酸镁；
同时硝化反硝化培养基：0.078g/L硫酸氨，0.101g/L硝酸钠，0.082g/L亚硝酸钠2.81g/L六水琥珀酸钠，0.2g/L七水硫酸镁，1.50g/L磷酸二氢钾，10.09g/L十二水磷酸氢二钠，2mL微量元素溶液/L培养基；
硝化培养基：0.236g/L硫酸氨，2.81g/L六水琥珀酸钠，0.2g/L七水硫酸镁，1.5g/L磷酸二氢钾，10.09g/L十二水磷酸氢二钠，2mL微量元素溶液/L培养基；
反硝化培养基：0.303g/L硝酸钠，2.81g/L六水琥珀酸钠，0.2g/L七水硫酸镁，1.5g/L磷酸二氢钾，10.09g/L十二水磷酸氢二钠，2mL微量元素溶液/1L培养基；
微量元素溶液：5g/L乙二胺四乙酸二钠，3.92g/L七水硫酸锌，5.50g/L氯化钙，5.06g/L四水氯化锰，5.0g/L七水硫酸亚铁，1.10g/L四水钼酸氨，1.57g/L五水硫酸铜，1.61g/L六水氯化钴；采用121℃湿热灭菌20min。
(7)菌种鉴定：使用TSINGKE植物DNA提取试剂盒(通用型)取该菌株的基因组，使用通用引物27F/1492R(27F：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3’)扩增16S rRNA基因并测序，其序列见SEQ ID NO.1，在NCBI数据库中对该序列进行BLAST比对，并通过软件MEGA11绘制系统发育树。经鉴定，该菌株与Pseudomonas reactans strain Ippbc Ab03相似性最高，具有高度相似性，鉴定为反应假单胞菌，学名Pseudomonas reactans(图1)，该物种为首次报道具有的脱氮性能的假单胞菌，为一种新型的具有脱氮功能的假单胞菌物种。先前关于反应假单胞菌(Pseudomonasreactans)包括Pseudomonas reactans strain Ippbc Ab03在内，均未曾报道过其具有脱氮功能，由此可确定该反应假单胞菌(Pseudomonas reactans)WL20-3属于Pseudomonasreactans种中的新型菌株。
实施例2：
假单胞菌WL20-3在4℃和pH11.0条件下对氨氮的去除情况：
在氨氮初始浓度为50mg/L，温度为30℃、4℃，pH分别为7.0和11.0条件下，将菌株WL20-3按OD600为0.3接种于100mL硝化培养基中，120r/min振荡培养60h。如图2所示，无论是在4℃或pH11.0的低温或高碱性条件下，还是4℃、pH11.0多重胁迫条件下，菌株WL20-3均可以在36h内100％去除培养基中氨氮。该结果表明，菌株WL20-3对低温和高碱性条件均具有较强的耐受性，能够高效去除氨氮。
实施例3：
假单胞菌WL20-3在4℃和pH11.0条件下对硝态氮的去除情况：
本发明进一步探究了菌株WL20-3的反硝化性能，在4℃，pH11.0条件下，以50mg/L硝态氮为唯一氮源，按上述方法接种菌株WL20-3，培养48h后，细胞量从0.30增加至0.89(图3)。同时，硝态氮剩余浓度为0mg/L，硝态氮去除率高达100％。该结果表明，菌株WL20-3在低温、高碱性双胁迫条件下可以高效去除硝态氮。
实施例4：
假单胞菌WL20-3在4℃和pH11.0条件下对亚硝态氮的去除情况：
在4℃，pH 11.0条件下，以50mg/L亚硝态氮为唯一氮源，培养48h后，亚硝态氮剩余浓度为1.12mg/L，亚硝态氮去除率高达97.76％(图4)。该结果表明，菌株WL20-3在低温、高碱性双胁迫条件下可以高效利用亚硝态氮进行反硝化。
实施例5：
假单胞菌WL20-3在4℃和pH11.0条件下对混合氮的去除情况：
为了进一步探究菌株WL20-3对混合氮源的去除情况，分别以16.7mg/L氨氮、16.7mg/L硝态氮、16.7mg/L亚硝态氮为混合氮源，在4℃，pH 11.0条件下培养48h，结果如图5所示，在混合氮源条件下，菌株WL20-3对各氮源的利用速率依次为：氨氮>硝态氮>亚硝态氮。在混合氮源条件下，WL20-3依然能高效去除氨氮(100％)、硝态氮(100％)和亚硝态氮(96.97％)。该结果表明，菌株WL20-3在低温、高碱性双胁迫条件下可以高效利用混合氮源。
实施例6：
假单胞菌WL20-3在实际污水处理中的应用：
以实际生活污水为研究对象，研究菌株WL20-3在4℃、pH11.0条件下处理废水的可行性。如图6所示，在pH 7.4，4℃条件下，当实际污水中不添加或添加菌株WL20-3时，氨氮的去除量分别为11.5mg/L和22.3mg/L。当pH为7.4时，不添加菌株WL20-3也能对污水中的氨氮进行一定程度的去除，说明污水中的原生微生物也可以利用氨氮进行生理活动。然而，当pH调至11.0时，未添加和添加菌株WL20-3时氨氮去除率分别为3.27mg/L和21.5mg/L，说明原生微生物无法抵抗高碱度胁迫，导致氨氮去除量显著下降。以上结果表明，无论pH7.4还是pH11.0，菌株WL20-3在4℃条件下对氨氮均有较高的去除效果，优于原生微生物，具有良好的应用潜力。
综上所述，本发明从脱水污泥中通过富集培养、分离纯化获得一株耐低温高碱性高效脱氮菌株WL20-3，并首次报道了其在4℃、PH11.0双胁迫条件下的高效脱氮性能。菌株WL20-3在低温、高碱性等多种胁迫条件下的合成培养基中以及实际生活污水中均具有较高的脱氮性能，展示了较好的工业应用潜力。
附：WL20-3菌株序列(SEQ ID NO.1)
GCGTGCGGAGTCTACCATGCAGTCGAGCGGTAGAGAGAAGCTTGCTTCTCTTGAGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAAACTGACTGACTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAAGCCTTGAGCTTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCTAGAGATAGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTACCACGGGGATCAGTCG
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种耐低温高碱性高效脱氮菌株，其特征在于，名称为反应假单胞菌(Pseudomonasreactans)WL20-3，保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏名称为WL20-3，其保藏号为：CGMCC NO.25785。
2.根据权利要求1所述的一种耐低温高碱性高效脱氮菌株，其特征在于：所述菌株WL20-3能在(NH4)2SO4、NaNO3、NaNO2为唯一氮源的液体培养基上生长；且在营养琼脂培养基上培养时，形成表面光滑湿润、不透明、边缘完整隆起呈现圆形的白色菌落。
3.根据权利要求1所述的一种耐低温高碱性高效脱氮菌株，其特征在于，其16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
4.采用权利要求1所述耐低温高碱性高效脱氮菌株制备的菌剂。
5.权利要求1所述耐低温高碱性高效脱氮菌株在脱氮技术领域中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述耐低温高碱性高效脱氮菌株在温度为3～35℃的水体中的脱氮应用。
7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述耐低温高碱性高效脱氮菌株在pH值为7.0～11.0的水体中的脱氮应用。
8.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述耐低温高碱性高效脱氮菌株用于脱除水体中的氨氮、硝态氮、亚硝态氮其中任意一种或多种。
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