CN102061276A - 一种低温生物脱氮的假单胞菌菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够在低温条件下进行生物脱氮的假单胞菌菌株及其应用。本发明提供的假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株HA11已于2010年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.4169。在10-20℃下，将该菌株置于溶解氧为2-6mg/L的含氮废水中即可生物脱氮。该菌株对低温的耐受能力强，在低温条件下生长良好，并且同时具备异养硝化和好氧反硝化的能力。在低温、好氧条件下，该菌株能够进行同步硝化反硝化，高效、彻底地去除污水中的总氮，从而有效解决低温条件下生物脱氮难以进行的重大难题，具有良好的应用前景。

Description

一种低温生物脱氮的假单胞菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及生物脱氮领域，特别涉及一种用于低温生物脱氮的假单胞菌菌株及其应用。

背景技术

目前，我国水污染的状况十分严峻，其中由氮、磷污染引发的水体富营养化问题尤为突出。据环境部门的监测结果显示，我国七大水系中一半以上河段水质受到污染，全国1/3的水体不适于鱼类生存，1/4的水体不适于灌溉，90％的城市水域污染严重，50％的城镇水源不符合饮用水标准，40％的水源已不能饮用，主要污染物为氨氮、COD_Mn、BOD、挥发酚和石油类物质。因此严格控制污水达标排放、有效改善水环境现状已成为水资源保护的当务之急。

人类日常生活产生的生活污水排放量大，含有机物以及氮、磷等营养物质多，已经成为水体的重要污染源。《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002)中提出了严格的有机物、氮、磷等污染物的排放标准。

目前的城市污水处理厂大都采用运行稳定、成本低廉的生物处理工艺，其中具有脱氮除磷功能的A²O、倒置A²O、SBR等工艺及NICH深度处理工艺的应用日益广泛。通常情况下，这些工艺可以较有效地去除水中的有机物及氮、磷等营养元素，实现达标排放。

然而，在寒冷的冬季，水温严重下降，尤其在广大的北方地区，排水温度可以达到10℃甚至更低。低温严重抑制了生物处理系统中微生物的活性，从而使污染物去除速率明显降低，出水难以达标。其中，自养的硝化细菌受到低温的抑制作用更加显著，在低温条件下生长极其缓慢，硝化反应速率极为低下；而低温条件下水中溶解氧浓度的升高也对缺氧反硝化的进行造成了显著的不利影响。因此，在低温条件下进行生物脱氮已经成为城镇生活污水处理厂实现达标排放的一大难题。

为了应对寒冷天气条件下出现的上述问题，常常在工程上采用降低污泥负荷、增加污泥回流量、增加污水停留时间，以及对部分构筑物采取保温或升温等措施来保证出水水质。然而，这些措施不仅会增加工程投资和运行费用，而且很难保证污水处理效果，还常会引起污泥膨胀等问题。

不少研究指出，分离、筛选高活性的低温微生物用于冬季生活污水的处理，能够从根本上解决低温条件下污染物去除率低下的问题。研究者们已经尝试向生物处理池中投加自养硝化污泥来提高氨氮的去除效率，然而在低温、较高溶解氧条件下反硝化难以进行，从而导致硝化反应产生的硝氮、亚硝氮无法得到有效去除，出水总氮仍然难以达标。此外，由于自养硝化菌生长缓慢，难以在系统中持留，往往需要连续投加，增加了运行费用。

针对上述情况，本发明筛选出耐冷的异养硝化-好氧反硝化菌用于低温生活污水的处理。该菌能够在低温、好氧条件下高效地进行硝化和反硝化反应，实现同步硝化反硝化，高效、彻底地去除污水中的总氮。此外，该菌在低温条件下生长良好，可以在生物处理系统中长期持留，无须进行连续投加。该菌株的应用对于解决低温脱氮的难题具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于低温生物脱氮的假单胞菌菌株及其应用。

本发明提供的假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株HA11已与2010年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.4169。

菌株HA11是从活性污泥中分离、筛选得到的一株革兰氏阴性细菌。

形态特征：菌株HA11在15-20℃下，营养琼脂培养基上培养24-36h后，菌落表面光滑，无色素；通过革兰氏染色后在显微镜下呈阴性；菌体呈杆状，单个出现。

该菌株的16S rRNA基因序列特征：其16S rRNA具有如序列表中序列1所示的核苷酸序列，序列长度为1417bp。

根据其形态特征及其16S rRNA基因序列，鉴定该菌株为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。

该菌株HA11可在低温条件下脱氮，在实际应用中，可将菌株HA11置于含氮液体中，进行生物脱氮。

所述含氮液体的碳源为为醋酸钠或琥珀酸钠。

所述含氮液体的氮是氨氮、硝酸盐氮和/或亚硝酸盐氮。

所述含氮液体的溶解氧可为2-6mg/L。

所述含氮液体的温度10℃-20℃。

所述含氮液体的pH可为6-12。

本发明的又一目的在于提供一种用于低温生物脱氮的微生物菌剂，其活性成分为所述的菌株HA11。

本发明的假单胞菌及其应用与现有技术相比较有如下有益效果：

1.本发明的菌株HA11对低温的耐受能力强，能够在低温、好氧条件下分别以氨氮或硝酸盐氮为唯一氮源生长，并进行异养硝化-好氧反硝化作用，是首次报导的耐冷异养硝化-好氧反硝化菌。利用该菌株的这种特性，可以将其直接接种于低温含氮废水中，只需要通过好氧阶段即可实现总氮的快速、彻底去除。该菌株的应用可以解决低温条件下自养硝化细菌生长困难，硝化反应难以进行的问题；另外，不需设置缺氧反硝化段即可实现总氮的有效去除，简化了工艺流程，节省了基建和运行费用，具有巨大的经济效益和环境效益。

2.本发明的菌株HA11适用于多种含氮废水的脱氮处理，应用前景十分广阔，预期能够产生显著的社会效益。

3.本发明的菌株HA11在10℃下接种到初始氨氮浓度为80mg/L的废水中，可以利用醋酸钠为唯一碳源，氨氮为唯一氮源进行新陈代谢。经过24h，氨氮的去除率达到98.1％，而硝氮和亚硝氮的浓度低于3mg/L。废水中大部分的氨氮通过异养硝化-好氧反硝化作用直接转化为气体产物，从而实现了总氮的有效去除。

4.本发明的菌株HA11在10℃下接种到初始硝氮浓度近80mg/L的废水中，可以利用醋酸钠为唯一碳源，硝氮为唯一氮源进行新陈代谢。经过50h，硝氮的去除率达到69.7％，亚硝氮没有积累。

5.本发明的菌株HA11在低温条件下对氨氮的去除效果优于在中、高温条件下，非常适用于低温生物脱氮。

6.本发明的菌株HA11在接种量为6.7％-10％时，处理效率并不随接种量的降低而明显下降。

附图说明

图1为菌株HA11的显微镜照片；

图2为菌株HA11在10℃下对氨氮的降解曲线；

图3为菌株HA11在10℃下对硝氮的降解曲线；

图4为菌株HA11在不同温度下对氨氮的降解曲线；

图5为菌株HA11在不同接种量时对氨氮的降解曲线。

具体实施方式

结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例1.具有低温异养硝化-好氧反硝化性能的菌株HA11的筛选

具体步骤如下：

1)取10ml于低温条件下驯化成熟的污泥至装有90ml无菌水及灭菌玻璃珠的三角瓶中，摇床振荡2h，使污泥充分破碎；

2)采用倍比稀释法将破碎后的污泥稀释成10^-1、10^-2、…、10-⁶各个梯度的菌悬液，取稀释度为10^-4、10^-5、10^-6的菌悬液各0.1mL，均匀涂布于含BTB培养基(每L含醋酸钠：2.73g，NH₄Cl：0.306g，KNO₃：1.0g，KH₂PO₄：0.15g，MgSO₄·7H₂O：0.1g，FeSO₄·7H₂O：0.001g，L-天冬碱：1.0g，BTB(1％溶于酒精)：1ml，琼脂：16-18g，pH：7.0-7.3，121℃20min蒸汽灭菌)10ml的固体平板上；

3)将平板置于培养箱中15℃恒温培养直至单菌落的形成。选取适当梯度的平板进行观察，对各个菌落的形态特征进行详细比对以识别出各个不同的单菌落；

4)挑取单菌落反复进行BTB平板划线，直到确保平板上的单菌落形态一致，取单菌落接于BTB斜面上保藏；

5)通过BTB平板上菌的生长情况以及BTB平板显色反应的深浅对菌的低温生长性能以及好氧反硝化性能进行半定量的判别；

6)测定各个菌株在10℃时的脱氮性能；

7)考察各个菌株在10℃传代稳定性；

8)考察各个菌株对低温的耐受能力；

9)由此分离出一株对低温耐受能力强并且具有异养硝化-好氧反硝化能力的细菌，将其命名为假单胞菌菌株HA11，并与2010年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.4169。

实施例2.菌株在低温条件下的脱氮实验

一、以氨氮为氮源的生物脱氮实验

以醋酸钠为有机碳源，氨氮为氮源，实施例1中所述菌株HA11对氨氮的去除能力测定。具体实施步骤如下：

将菌株HA11接种于150ml的CMa培养基中(每升含醋酸钠：2.73g，NH₄Cl：0.306g，KH₂PO₄：0.15g，MgSO₄·7H₂O：0.1g，FeSO₄·7H₂O：0.001g，pH：7.0-7.3，121℃20min蒸汽灭菌)，于摇床10℃，160r/min进行预培养。待菌株生长至对数生长期后期时，取10ml的菌液接入新鲜的150ml CMa培养基中，10℃，160r/min进行振荡培养。每隔一段时间取反应液，测定菌体光密度(OD₆₀₀)之后，8000rpm离心10min，取上清液测定各种含氮化合物浓度。

结果如图2所示，菌株HA11在低温下生长良好，且对氨氮有较强的降解能力。整个降解过程中，菌株处于对数生长期，氨氮的浓度呈直线下降，经过24h，氨氮的去除率达到98.1％，氨氮降解速率达到3.06(mg N/L·h)。此外，在整个降解过程中，硝氮和亚硝氮的浓度一直维持在3mg/L以下，废水中大部分的氨氮通过异养硝化-好氧反硝化作用直接转化为气体产物。因此，该菌株在低温条件下仅经过好氧阶段就有效实现了氮素的彻底去除。

二、以硝酸盐氮为氮源的生物脱氮实验

以醋酸钠为有机碳源，硝氮为氮源，实施例1中所述菌株HA11对硝氮的去除能力测定。具体实施步骤如下：

将菌株HA11接种于150ml的CMn培养基中(每升含醋酸钠：2.73g，KNO₃：0.577g，KH₂PO₄：0.15g，MgSO₄·7H₂O：0.1g，FeSO₄·7H₂O：0.001g，pH：7.0-7.3，121℃20min蒸汽灭菌)，于摇床10℃，160r/min进行预培养。待菌株生长至对数生长期后期时，取10ml的菌液接入新鲜的150ml CMn培养基中，10℃，160r/min进行振荡培养。每隔一段时间取反应液，测定菌体光密度(OD₆₀₀)之后，8000rpm离心10min，取上清液测定各种含氮化合物浓度。

结果如图3所示，菌株HA11在低温、好氧条件下仍能够有效去除硝酸盐氮。菌株在生长初期对硝氮的去除并不显著，但是经过一段适应期之后，硝氮呈直线下降。经过50h，硝氮的去除率达到69.7％，并且亚硝氮没有积累。这充分说明该菌株在好氧条件下能够以硝氮和亚硝氮作为电子受体进行反硝化作用，具有较好的好氧反硝化性能。

实施例3.菌株在不同温度条件下的脱氮实验

以醋酸钠为有机碳源，氨氮为氮源，实施例1中所述菌株HA11在不同温度下对氨氮的去除能力测定。具体实施步骤如下：

将菌株HA11接种于150ml的CMa培养基中，于摇床10℃、20℃、30℃，160r/min进行预培养。待菌株生长至对数生长期后期时，取10ml的菌液接入新鲜的150ml CMa培养基中，分别与10℃、20℃、30℃，160r/min进行振荡培养。每隔一段时间取反应液，测定菌体光密度(OD₆₀₀)之后，8000rpm离心10min，取上清液测定各种含氮化合物浓度。

结果如图4所示，该菌株在10℃-30℃的温度范围内，均可以去除氨氮。然而，在低温条件下菌株对氨氮的去除效果优于在中、高温条件下。由此可见，该菌株更加适应低温环境，非常适用于低温生物脱氮。

实施例4.菌株在不同接种量时的脱氮实验

以醋酸钠为有机碳源，氨氮为氮源，实施例1中所述菌株HA11在不同的接种量下对氨氮的去除能力测定。具体实施步骤如下：

将菌株HA11接种于150ml的CMa培养基中，于摇床10℃，160r/min进行预培养。待菌株生长至对数生长期后期时，分别取5ml、10ml、15ml的菌液接入新鲜的150ml CMa培养基中，10℃，160r/min进行振荡培养。每隔一段时间取反应液，测定菌体光密度(OD₆₀₀)之后，8000rpm离心10min，取上清液测定各种含氮化合物浓度。

结果如图5所示，菌株HA11在接种量为6.7％-10％时，处理效率并不随接种量的降低而明显下降。然而，当接种量降低至3.3％时，脱氮效果受到了较大的影响，氨氮去除速率明显降低。因此，菌株HA11较为适宜的接种量约为6.7％。

Claims (6)

1.假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株HA11，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4169。

2.权利要求1所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株HA11在水溶液中进行低温脱氮的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的水溶液的溶解氧是2-6mg/L。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述低温为10-20℃。

5.根据权利要求2-4任一所述的应用，其特征在于：所述的水溶液中的氮是氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮中的一种或者几种。

6.一种用于低温脱氮的微生物菌剂，其活性成分为权利要求1所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株HA11。

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