CN109439575A - 一种假单胞菌株及其在降解水体硝酸盐中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种假单胞属菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018588。本发明所述的假单胞属菌株在较低温度、偏碱性环境条件下具有较高的反硝化能力，具有广阔的应用前景。

Description

一种假单胞菌株及其在降解水体硝酸盐中的应用
技术领域
本发明涉及环境保护领域，尤其是涉及一种假单胞菌株及其在降解水体硝酸盐中的应用。
背景技术
水体富营养化是指水体中氮(N)、磷(P)等营养元素含量过多而引起藻类及其他富有生物大量繁殖，消耗水体中的溶解氧，使得水体中的鱼类以及其他生物因缺氧而大量死亡，从而导致水生态系统物种分布失衡，藻类等单一物种疯长，无法形成一个自下而上完整平衡的生态群落，导致水体恶化。而近年来，水体富营养化问题日趋严重，被视为水体最严重的污染之一。
具有高度水溶性的硝酸盐是水体氮(N)污染的主要氮源，并且，硝酸盐作为一种毒性物质，其在水体中含量过高不仅会造成水体富营养化，而且在其转化为亚硝酸盐的过程中对人类健康造成严重影响，例如新生儿畸形、癌症等。世界卫生组织给出的饮用水安全标准为硝酸盐浓度≤10mg/L，但我国由于水体污染状况极为严重，水体中硝酸盐含量远远超过10mg/L。因此，降低水中硝酸盐含量近年来成为我国关注的热点问题。
目前，我国通常采用物理化学方法改善水体富营养化，但其成本高，不宜控制。与物理化学处理方法相比，生物修复具有更高的效率和更低的成本，且更加贴近和符合自然运转的规律与环保，例如，可以利用反硝化微生物将水体中的硝酸盐转化为无污染的氮气释放到空气中，从而降低水体中氮元素的含量，改善水体富营养化。利用硝酸盐还原菌的反硝化作用，改善水体，已成为研究的热点。
发明内容
基于此，本发明的一个目的在于，提供一种新的假单胞菌株，属于假单胞菌属。其能够利用污染水体中的硝酸盐进行代谢，从而降低水体中的氮含量，改善水体富营养化状况。
本发明采用的技术方案如下：
一种假单胞菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018588。
本发明所述假单胞菌株适宜生存的温度范围和pH范围较广，可用于处理多种水体的富营养化。并且其生长最适pH为弱碱性，在弱碱性水体中脱氮率接近百分百，而富营养化严重的水体由于藻类大量生长使水体pH升高呈弱碱性，故本发明菌株更适宜用于水体净化处理。
本发明还提供所述的假单胞菌株的培养方法，包括以下步骤：
S1接种：所述假单胞菌株以1.0×105～5.0×106个/ml接种浓度、0.5％～5％接种量接种于培养基中；
S2培养：将接种有所述假单胞菌株的培养基，于28℃，恒温培养12～48小时。
进一步地，所述培养基包括以下重量份的原料：NaNO3 0.31份、CH3COONa 2.56份、Na2HPO4 0.42份、KH2PO4 1.5份、MgSO4·7H2O 1份、FeSO4·7H2O 0.05份、无菌水1000份，所述MDM培养基的pH为7.2±0.1。
进一步地，步骤S1中的接种浓度为2.0×106个/ml。
进一步地，步骤S1中的菌液与培养基体积比接种量为2％。
进一步地，步骤S2中的培养时长为32小时。
进一步地，步骤S2中，于28℃培养时，以150～220rpm速度摇动。
本发明的另一个目的在于提供所述的假单胞菌株在净化水体硝酸盐中的应用。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1为本发明所述的假单胞菌培养48h后的菌落形态图；
图2为本发明所述的假单胞菌株16S rRNA序列的PCR扩增核酸电泳图；
图3为基于本发明所述的假单胞菌株与相似菌种的16SrRNA序列条形码构建的进化树；
图4为本发明所述的假单胞菌株与假单胞菌Pseudomonas sp.B-1-44(KT583373.1)的16SrRNA序列比对图；
图5为不同时长培养本发明所述的假单胞菌株的脱氮性能关系图；
图6为不同接种量培养本发明所述的假单胞菌株的脱氮性能关系图；
图7为不同温度培养本发明所述的假单胞菌株的脱氮性能关系图；
图8为不同pH培养本发明所述的假单胞菌株的脱氮性能关系图。
具体实施方式
本发明所述的假单胞菌株，命名为Pseudomonas sp MS1，于2018年9月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国湖北省武汉市武汉大学校内中国典型培养物保藏中心)，保藏编号为CCTCC NO:M2018588。
实施例一：分离纯化方法
本发明所述的假单胞菌株的分离纯化方法，步骤如下：
S1：称取10g的土壤样品，所述土壤样品来自广东省海陵岛红树林国家湿地公园；然后，于超净工作台中，向土壤样品中添加90ml无菌水，置于振荡器上振荡60min，使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液；待土壤分散后，吸取100ul土壤悬液到900ul无菌水中得到10倍稀释液，然后依次稀释10倍，得到102倍稀释液、103倍稀释液、104倍稀释液、105倍稀释液和106倍稀释液，整个过程在超净工作台中进行。
S2：取100ul的10倍稀释液、102倍稀释液、103倍稀释液、104倍稀释液、105倍稀释液和106倍稀释液分别涂布于2216E琼脂固体培养板上，然后将培养板置于培养箱28℃恒温培养2～3天，培养板上长出菌斑。
S3：培养结束后，根据菌落生长情况从适当稀释梯度平板一一挑取形状、颜色、大小等不同的单菌斑进行平板划线，分离出本发明所述的假单胞菌株。本发明所述的假单胞菌株在2216E琼脂固体培养板上的形态如附图1所示，菌落为白色圆形斑点，点样48h后，菌落表面为油面。
S4：从2216E挑取已纯化培养的菌株，接种于内含200ml 2216E液体培养基的500ml锥形瓶中，在28℃，180rpm恒温摇床培养条件下培养32h，制得种子液。
所述2216E琼脂固体培养基的配方按照以下重量份组成：蛋白胨5份、酵母浸粉1份、柠檬酸铁0.1份、氯化钠19.45份、氯化镁5.98份、硫酸钠3.24份、氯化钙1.8份、氯化钾0.55份、碳酸钠0.16份、溴化钾0.08份、氯化锶0.034份、硼酸0.022份、硅酸钠0.004份、氟化钠0.0024份、硝酸钠0.0016份、磷酸氢二钠0.008份、琼脂15份、无菌水1000份。配制方法为：称取和量取上述各组分后，将各组分搅拌溶解在无菌水中后分装至锥形瓶中，然后将锥形瓶用灭菌纸封口后，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，于超净台上倒入培养皿中，每个培养皿约倒入20ml培养基，冷却凝固后，将固体培养板于4℃保存。
所述2216E液体培养基的配方按照以下重量份组成：蛋白胨5份、酵母浸粉1份、柠檬酸铁0.1份、氯化钠19.45份、氯化镁5.98份、硫酸钠3.24份、氯化钙1.8份、氯化钾0.55份、碳酸钠0.16份、溴化钾0.08份、氯化锶0.034份、硼酸0.022份、硅酸钠0.004份、氟化钠0.0024份、硝酸钠0.0016份、磷酸氢二钠0.008份、无菌水1000份。称取和量取上述各组分后，将各组分搅拌溶解在无菌水中后分装至锥形瓶中，然后将锥形瓶用灭菌纸封口后，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，保存备用。
实施例二：培养方法
S1接种：将实施例一所得的种子液以2×106个/ml接种浓度、2％菌液与培养基体积比接种量接种于内含300ml MDM液体培养基的1000ml锥形瓶中；
S2培养：将接种有所述假单胞菌株的培养基，于28℃，180rpm恒温摇床条件下培养32h，制得本发明所述的假单胞菌菌液。
由于本发明所述的假单胞菌株在自身的生长过程中，会分泌出能够利用硝酸盐的酶类，如硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶和氧化亚氮还原酶等。从而使其能够利用MDM培养基中的硝酸盐，降低MDM培养基中硝酸盐的含量，继而降低MDM培养基中氮元素的含量。同样，将其投放培养在水体中，也能够降低水体中硝酸盐和氮元素的含量，降低水体富营养化的可能性，改善水体理化性质和生态环境。
所述MDM液体培养基的配方按照以下重量份组成：NaNO3 0.31份、CH3COONa 2.56份、Na2HPO4 0.42份、KH2PO4 1.5份、MgSO4·7H2O 1份、FeSO4·7H2O 0.05份、无菌水1000份，pH为7.2±0.1。配制方法为：称取和量取上述各组分后，将各组分搅拌溶解在无菌水中后调整pH到7.2±0.1，然后分装至锥形瓶中，将锥形瓶用灭菌纸封口后，分装至锥形瓶，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，保存备用。
实施例三：PCR扩增16S rRNA序列并测序
S1：取基因组DNA
采用Omega Bacterial DNA Kit(D3350-01)试剂盒提取基因组DNA。首先，取实施例一中所述的种子液2ml于无菌的2ml离心管中，12000rpm离心2min，弃上清保留沉淀；然后，向沉淀中加入100ul 1×TE Buffer，涡旋混匀，加入10ul溶菌酶混匀，37℃温浴10min；加入100ul BTL Buffer和20ul蛋白酶K，混匀，55℃温浴1h，中间振荡混匀三次；加入5ulRNaseA酶，混匀，室温静置5min后，10000rpm离心2min，取200ul上清液转移至新的无菌的1.5ml离心管中；加入200ul BTL Buffer，混匀，置于65℃温浴10min；加入200ul无水乙醇，涡旋混匀，将样品全部转移至吸附柱中，10000rpm离心2min，弃上清和吸附柱，将吸附柱放入新的收集管中；向吸附柱中加入500ul HBC Buffer，10000rpm离心2min，弃上清；向吸附柱上加入700ul DNA Wash Buffer，10000rpm离心2min，弃上清，重复两次；将空的吸附柱重新放入收集管中，10000rpm离心2min；向吸附柱中加入用30ul～50ul Elution Buffer(已于65℃预热)溶解DNA沉淀，即得到基因组DNA，-20℃保存备用。
S2：PCR扩增16SrRNA序列
以步骤S1所得基因组DNA为模板，Eubac27F和Eubac1492R为引物进行PCR扩增，PCR反应体系(50μl)如下：
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃复性30s、72℃延伸1min，变性、复性和延伸的过程反复循环30次；72℃再延伸10min，4℃保存PCR扩增产物。
所述上游引物Eubac27F的序列为：agagtttgat cctggctcag
所述下游引物Eubac1492R的序列为：ggttaccttg ttacgactt
S3：PCR产物进行核酸电泳
取5ul步骤S2所得的PCR产物点样后于120V电压下进行核酸电泳25min。电泳结果如附图2所示，以本发明所述的假单胞菌株的基因组DNA为模板扩增出的16SrRNA片段条带单一且亮度高，且16SrRNA序列长度约为1500bp。
S4：16SrRNA序列进行测序
步骤S2所得的PCR产物经纯化回收后，取30ul纯化产物送广州擎科生物技术有限公司进行序列双向测通测定，测序结果显示本发明所述横梗霉菌菌株的16SrRNA序列长度为1441bp，具体序列如下所示：
实施例四：构建系统进化树
将实施例三所得的本发明所述假单胞菌株的16SrRNA序列输入NCBI中，进行BLAST比对，并基于条形码16SrRNA区段序列构建NJ系统进化树。如附图3所示，根据系统进化树本发明所得的菌株，与假单胞菌株的16SrRNA条形码数据库中大部分序列高度相似但不存在完全重合，也没有唯一邻近的物种序列。因此可知，本发明所得的菌株在分类上属于假单胞菌属Pseudomonas sp.，且为一个新种。
实施例五：近源物种比对
将实施例三所得的本发明所述假单胞菌株的16SrRNA序列输入NCBI中，与假单胞菌Pseudomonas sp.B-1-44的16SrRNA序列进行比对，比对结果如附图4所示，本发明所述假单胞菌株的16SrRNA序列与Pseudomonas sp.B-1-44的16SrRNA序列同源性很高达到99％，但并不完全相同，两者之间存在7个碱基的差异。进一步看出，本发明所得的菌株在分类上属于假单胞菌属Pseudomonas sp.，且为假单胞菌属的一个新的菌种，暂时命名为Pseudomonas sp.MS1。
实施例六：测定反硝化能力的方法
S1接种：将实施例一所得的种子液以106个/ml接种浓度、2％菌液与培养基体积比接种量接种于内含300ml MDM液体培养基(培养前的培养基)的1000ml锥形瓶中；
S2培养：将接种有所述假单胞菌株的培养基，于28℃，180rpm恒温摇床条件下培养48h，制得本发明所述的假单胞菌菌液；
S3离心：培养结束后，12000rpm离心2min去除菌体沉淀，留取上清液(即培养后的培养基)，测定上清液中的总氮(TN)含量；
S4计算反硝化能力：接种前MDM培养基的初始氮含量减去步骤S3所得的上清液的氮含量后，除以菌体数量，得到每个假单胞菌的降低培养基(水体)氮含量的能力，即反硝化能力，即脱氮能力。
式中：c[NO3 --N]初--初始的硝态氮浓度(mg/L)；
c[NO3 --N]末--反应后硝态氮浓度(mg/L)；
c[NO2 --N]末--反应后亚硝态氮浓度(mg/L)。
由于本发明所述的假单胞菌株是在其生长培养过程中，利用培养基中的硝酸盐。因此，在培养结束后，离心除去菌体沉淀，留取培养基上清液并测定上清液中的氮含量，与培养基中的初始氮含量比较，即可计算所述假单胞菌的降低水体氮含量的能力，即反硝化能力。
其中，步骤S1中，所述MDM液体培养基的配方和配制方式见实施例二；步骤S3中，所述氮含量的测定采用碱性过硫酸钾消解分光光度计法，具体步骤如下：
1)取10ml待测上清液样品置于比色管中，向比色管中加入5mL碱性过硫酸钾溶液，混匀；
2)将步骤1)的比色管置于高压蒸汽灭菌锅中101KPa、121℃保持30min；
3)取出比色管冷却至室温，加1mL盐酸溶液(1+9)，混匀；
4)移取3ml溶液至比色皿中，用无氮化合物的纯水作为参比溶液，通过紫外分光光度计测定220nm和275nm波长处的吸光度(OD220和OD275)；
5)对照硝酸钾标准曲线计算出总氮(TN)含量。
其中，氢氧化钠溶液(20g/L)的配制：称取2.0g氢氧化钠(NaOH)，溶于无氮化合物的纯水中，稀释定容至100mL；
碱性过硫酸钠溶液的配制：称取40g过硫酸钠(K2S2O8)，再称取15g氢氧化钠溶于无氮化合物的纯水中，并稀释定容至1000mL，溶液储存于聚乙烯瓶中备用；
盐酸溶液(1+9)的配制：量取100mL盐酸，再量取900mL纯水，混匀备用；
硫酸溶液(1+35)的配制：量取350mL纯水，然后再量取10mL浓硫酸并缓慢加入纯水中，混匀备用；
硝酸钾标准溶液(100mg/L)的配制：先将硝酸钾置于110℃烘箱中烘干2h，与干燥箱中冷却后，称取0.7218g溶于纯水中，最后用纯水定容至1000mL，4℃保存备用；
硝酸钾标准使用液(10mg/L)的配制：用硝酸钾标准溶液(100mg/L)稀释10倍获得。
实施例七：筛选反硝化能力最加的假单胞菌株培养条件
(1)筛选最优培养时长
S1：取实施例一所得的菌株种子液以2.0×106个/ml接种浓度，以2％菌液与培养基体积比接种量接种于内含300ml MDM液体培养基的1000ml锥形瓶中，在28℃，180rpm摇床条件下恒温振荡培养，分别于4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h吸取20ml菌液，置于4℃冰箱保存；
S2：从4℃冰箱中取出各时间段的菌液，12000rpm离心2min获得上清液，采用碱性过硫酸钾消解分光光度计法测定总氮(TN)含量；采用紫外分光光度法测定硝态氮(NO3 --N)含量。
其中，碱性过硫酸钾消解分光光度计法测定总氮(TN)含量的过程与实施例六相同，而紫外分光光度法测定硝态氮(NO3 --N)含量具体步骤如下：
1)取50mL上清液于比色管中，加入1mL盐酸溶液(1+11)酸化，混匀；
2)移取3ml溶液至比色皿中，以无氮化合物的纯水作为参比，通过紫外分光光度计测定其220nm和275nm波长处的吸光度(OD220和OD275)，即可测定不同样品硝态氮的吸光度值；
3)对照硝酸盐标准曲线计算出相对性的硝酸盐浓度。
其中，盐酸溶液(1+11)的配制：量取100mL盐酸，再量取1100mL纯水，混匀备用；而硝酸盐浓度计算公式为：
硝酸盐浓度(mg/L)＝m/V×1000
式中：m：根据吸光度值从标准曲线上计算出的硝酸盐含量(mg)；
V：上清液体积(mL)。
检测结果如附图5所示，本发明所述的假单胞菌株具有脱氮能力即反硝化能力，且其反硝化能力与菌株密度相关。具体地，培养4～32h时，随着本发明假单胞菌株生长，脱氮率逐渐上升；培养32h以后，菌密度达到最大，而脱氮率却有所下降；而当培养32h时，本发明所述的假单胞菌株的总氮及硝态氮脱氮率最高，总氮脱氮率达到37.121％，硝态氮脱氮率达到40.432％。故培养时间32h为是本发明所述的假单胞菌株具有最佳反硝化能力的培养时间。
(2)筛选最优接种量
S1：取实施例一所得的菌株种子液以2.0×106个/ml接种浓度，分别以0.5％、1％、2％、3％、4％、5％菌液与培养基体积比接种量接种于内含300ml MDM液体培养基的1000ml锥形瓶中，在28℃，180rpm摇床条件下恒温振荡培养32h后，吸取20ml菌液，12000rpm离心2min获得上清液；
S2：采用碱性过硫酸钾消解分光光度计法测定总氮(TN)含量；采用紫外分光光度法测定硝态氮(NO3 --N)含量。
检测结果如附图6所示，当接种量为1％时，本发明所述的假单胞菌株脱氮性能即反硝化能力最好，总氮脱氮率为42.915％，硝态氮脱氮率达到45.010％；当接种量大于1％时，其脱氮效果下降；当接种量为0.5％时，脱氮率最低；故菌液与培养基体积比接种量为1％是本发明所述的假单胞菌株具有最佳反硝化能力的接种量。
(3)筛选最优培养温度
S1：取实施例一所得的菌株种子液以2.0×106个/ml接种浓度，以1％菌液与培养基体积比接种量接种于内含300ml MDM液体培养基的1000ml锥形瓶中，分别在18℃、23℃、28℃、33℃、38℃，180rpm摇床条件下恒温振荡培养32h后，吸取20ml菌液，12000rpm离心2min获得粗酶液；
S2：采用碱性过硫酸钾消解分光光度计法测定总氮(TN)含量；采用紫外分光光度法测定硝态氮(NO3 --N)含量。
检测结果如附图7所示，当培养温度为18℃时，总氮及硝态氮的脱氮率均最高，分别达到56.828％和60.732％，反硝化能力最强；当培养温度高于或低于18℃时，脱氮率均下降。故18℃本发明所述的假单胞菌株具有最佳反硝化能力的培养温度。且本发明的所述的假单胞菌株在13～38℃温度范围内均能够生存且具有较好的脱氮能力，因此，其可用于改善多种温度的水体的富营养化现象。
(4)筛选最优pH
S1：取实施例一所得的菌株种子液以2.0×106个/ml接种浓度，以1％菌液与培养基体积比接种量接种于内含300ml不同pH的MDM液体培养基的1000ml锥形瓶中，培养基pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，在18℃、180rpm摇床条件下恒温振荡培养32h后，吸取20ml菌液，12000rpm离心2min获得上清液；
S2：采用碱性过硫酸钾消解分光光度计法测定总氮(TN)含量；采用紫外分光光度法测定硝态氮(NO3 --N)含量。
检测结果如附图8所示，当培养基pH为8.0时，本发明所述假单胞菌株的反硝化能力最好，总氮及硝态氮脱氮率分别达到96.375％和98.381％，总氮及硝态氮脱氮率几乎达到百分百；当pH低于或高于8.0时，脱氮率均有所下降。故培养基pH为8.0是本发明所述假单胞菌株具有反硝化能力的pH，且与培养基优化之前相比，本发明菌株的总氮及硝态氮的脱氮率均大幅度提升，总氮及硝态氮脱氮率几乎达到百分百。且本发明的所述的假单胞菌株在pH5～10范围内均能够生存且具有较好的脱氮能力，因此，其可用于改善多种pH的水体的富营养化现象。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序 列 表
<110> 华南农业大学
<120> 一种假单胞菌株及其在降解水体硝酸盐中的应用
<160> 13
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1441
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 本发明所述的假单胞菌株的16SrRNA序列
<400> 1
gggcgggggc aggctaccat gcaagtcgag cggtagagag aagcttgctt ctcttgagag 60
cggcggacgg gtgagtaatg cctaggaatc tgcctagtgg tgggggataa cgttcggaaa 120
cggacgctaa taccgcatac gtcctacggg agaaagcggg ggaccttcgg gcctcgcgcc 180
attagatgag cctaggtcgg attagctagt tggtgaggta atggctcacc aaggctacga 240
tccgtaactg gtctgagagg atgatcagtc acactggaac tgagacacgg tccagactcc 300
tacgggaggc agcagtgggg aatattggac aatgggcgaa agcctgatcc agccatgccg 360
cgtgtgtgaa gaaggtcttc ggattgtaaa gcactttaag ttgggaggaa gggtagtaac 420
ttaatacgtt gctactttga cgttaccgac agaataagca ccggctaact tcgtgccagc 480
agccgcggta atacgaaggg tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgcgcgt 540
aggtggttca gtaagttgga agtgaaatcc ccgggctcaa cctgggaact gctttcaaaa 600
ctgctgagct agagtacggt agagggtagt ggaatttcct gtgtagcggt gaaatgcgta 660
gatataggaa ggaacaccag tggcgaaggc gactacctgg actgatactg acactgaggt 720
gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatgt 780
caactagccg ttgggagtct tgaactctta gtggcgcagc taacgcatta agttgaccgc 840
ctggggagta cggccgcaag gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg 900
tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt acctggcctt gacatgctga 960
gaactttcta gagatagatt ggtgccttcg ggaactcaga cacaggtgct gcatggctgt 1020
cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgtaa cgagcgcaac ccttgtcctt 1080
agttaccagc acgtaatggt gggaactcta aggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag 1140
gtggggatga cgtcaagtca tcatggccct tacggccagg gctacacacg tgctacaatg 1200
gtcggtacaa agggttgcca agccgcgagg tggagctaat cccataaaac cgatcgtagt 1260
ccggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagtcggaat cgctagtaat cgtgaatcag 1320
aatgtcacgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtg 1380
ggttgcacca gaagtagcta gtctaacctt cgggaggacg gtacccacgg tgatcaacgc 1440
c 1441
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游引物Eubac27F
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物Eubac1492R
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (8)

1.一种假单胞菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018588。
2.如权利要求1所述的假单胞菌株的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1接种：所述假单胞菌株以1.0×105～5.0×106个/ml接种浓度、0.5％～5％接种量接种于培养基中；
S2培养：将接种有所述假单胞菌株的培养基，于28℃，恒温培养12～48小时。
3.如权利要求2所述的假单胞菌株的培养方法，其特征在于：所述培养基包括以下重量份的原料：NaNO3 0.31份、CH3COONa 2.56份、Na2HPO4 0.42份、KH2PO4 1.5份、MgSO4·7H2O 1份、FeSO4·7H2O 0.05份、无菌水1000份，所述MDM培养基的pH为7.2±0.1。
4.如权利要求2所述的假单胞菌株的培养方法，其特征在于：步骤S1中的接种浓度为2.0×106个/ml。
5.如权利要求2所述的假单胞菌株的培养方法，其特征在于：步骤S1中的菌液与培养基体积比接种量为2％。
6.如权利要求2所述的假单胞菌株的培养方法，其特征在于：步骤S2中的培养时长为32小时。
7.如权利要求2所述的假单胞菌株的培养方法，其特征在于：步骤S2中，于28℃培养时，以150～220rpm速度摇动。
8.权利要求1所述的假单胞菌株在降解水体硝酸盐中的应用。
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