CN105420167B - 一种蜡状芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种蜡状芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蜡状芽孢杆菌及其应用。本发明的蜡状芽孢杆菌已保藏于CGMCC，保藏编号为CGMCC No.7313，保藏日期为2013年3月15日。将本发明的蜡状芽孢杆菌配制成菌液后，通过浸种或灌根的方式可以促进黄花蒿的生长，提高黄花蒿中青蒿素的产量，效果较为显著。应用过程中的操作极为简便，可以实现规模化生产，并且无需高昂的前期投入，同时减少了化学肥料的使用。具有理想的应用及开发前景。

Description

一种蜡状芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物菌肥技术领域，涉及一种作为天然药用植物内生细菌的蜡状芽孢杆菌，及其在促进黄花蒿生长和/或提高黄花蒿中的青蒿素产量中的应用。
背景技术
青蒿为菊科植物黄花蒿（Artemisia annua L.）的干燥地上部分，是我国传统使用的一味中草药。从黄花蒿中提取的青蒿素（Artemisinin）是现今最好的抗疟药物，具有活性好、无明显毒副作用等特点，是我国唯一被世界卫生组织（WHO）认可的按照西药标准研究开发的中药。随着研究及应用的深入，青蒿素及其衍生物被广泛用于治疗多种疾病。由于市场需求量逐年增加，而青蒿素在黄花蒿中的含量较低（仅占干重的0.01%~1%），导致青蒿素的供应出现短缺。
目前，提高黄花蒿中青蒿素含量的方法主要集中于外加激素法，例如中国发明专利CN 101785406 B等。该类方法大多基于实验室组培苗，对生产条件要求较高，增加了生产成本。另外，向黄花蒿中转入青蒿素合成过程中的关键基因来提高青蒿素含量的方法也有报道，例如中国发明专利CN 101182544 B等。该类方法虽然增效显著，但由于基因工程目前尚处于尝试阶段，同时世界上许多国家对于转基因作物的监管和控制比较严格，导致转基因作物难以在实际中得到普遍应用。
随着绿色农业的兴起，人们越来越注重生态保护，生物菌肥也随之得到广泛重视。从植物体内分离出来的内生菌（endophyte），对植物本身并无危害。经大量研究发现，内生菌具有促进宿主植物生长、增强宿主植物抗逆性等作用。因此，将有益内生菌与药用植物共培养是生产高品质中药材的崭新途径，为中草药的高产高质高效栽培提供了广阔的空间。然而，国内外关于生物菌肥的研究主要集中于内生真菌（endophytic fungi），对于内生细菌（endophytic bacteria）的研究较少，特别是针对内生细菌促进黄花蒿生长和/或提高青蒿素产量方面的研究几乎为空白。
发明内容
针对上述情况，本发明从野生黄花蒿（采自南京紫金山地区）的根茎部分分离筛选出野生型菌株——蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）SZ1（下文简称SZ1菌）。SZ1菌已于2013年3月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No. 7313，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明的SZ1菌具有如下生物学特征：
菌落形态特征：SZ1菌在基础NA培养基（NB培养基添加1.5%琼脂）上生长良好，在NA平板培养基上为灰白色，不透明，表面较粗糙，类似毛玻璃或融蜡状，菌落较大；
菌体形态特征：菌体呈杆状，末端较方，成短或长链，大小为(1.0~1.2) × (3.0~5.0) μm；
生理生化特征：在0℃以下或40℃以上条件下不能生长，在5%和7%的NaCl溶液中能够生长，可以利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖、鼠李糖和甘露醇，不可以利用L-阿拉伯糖和肌醇，氧化酶和接触酶测定结果为阳性，能够利用柠檬酸盐，硝酸还原、淀粉水解、明胶液化和酯酶试验为阳性，脲酶试验为阴性。
经过序列测定，上述SZ1菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，与蜡状芽孢杆菌（B. cereus）、苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）、炭疽芽孢杆菌（B. anthracis）的相似度达99%。综合序列同源性分析、Blast比对、形态特征及生理生化特征等实验结果，鉴定上述SZ1菌为蜡状芽孢杆菌。
上述SZ1菌对黄花蒿的生长具有明显的促进作用，可以增加根长10%~30%，增加植株鲜重和干重7%~25%，同时可以提高黄花蒿中的青蒿素含量10%~20%，可以应用于促进黄花蒿的生长和/或提高黄花蒿中的青蒿素产量，对人畜无毒害作用，对环境无污染。
在实际应用过程中，可以将上述SZ1菌依下法配制成菌液后使用：取SZ1菌菌株置于NB培养基中，在25~30℃条件下，摇床振荡培养10~12小时，离心后去上清，加入无菌水将SZ1菌的浓度调节为107~109 cfu/mL，即得菌液，其中NB培养基的配方如下：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，蒸馏水1000 mL，pH=7.2~7.4。
上述菌液的具体应用方式包括浸种（即采用各种浓度的菌液浸泡种子，其中每克黄花蒿种子所需的菌液施用量为5~20毫升，浸泡时间为1~3小时）和灌根（即将各种溶液倾倒在植株根部，其中当黄花蒿幼苗的植株高度为5厘米时，在其根部附近一次性灌入菌液1~2毫升）。
与现有技术相比，采用上述技术方案的本发明具有如下优点：
本发明的内生细菌SZ1能够促进黄花蒿的生长，提高黄花蒿中青蒿素的产量，效果较为显著；应用过程中的操作极为简便，可以实现规模化生产，并且无需高昂的前期投入，同时减少了化学肥料的使用。具有理想的应用及开发前景。
附图说明
图1为蜡状芽孢杆菌SZ1的菌落形态图。
图2为蜡状芽孢杆菌SZ1的菌体形态图。
图3为基于16S rRNA基因序列构建的SZ1菌株的系统发育树。
图4为蜡状芽孢杆菌SZ1通过浸种方式促进黄花蒿生长的盆栽效果对比图，其中左侧两盆为处理组黄花蒿，右侧两盆为对照组黄花蒿。
图5为蜡状芽孢杆菌SZ1通过灌根方式促进黄花蒿生长的盆栽效果对比图，其中左侧两盆为处理组黄花蒿，右侧两盆为对照组黄花蒿。
具体实施方式
下面将结合附图和具体的实施例来进一步描述本发明。需要说明的是，本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器都为本领域所熟知，其他本领域熟知的一些试剂和仪器都可适用于本发明。
实施例一：蜡状芽孢杆菌SZ1的分离、纯化和鉴定。
1、内生细菌的分离与纯化：
将野生黄花蒿植株依次用自来水、无菌水冲洗干净后，晾干，选取合适的组织剪成5 mm × 5 mm的组织块，在75%乙醇中浸泡1 min，用无菌水冲洗3次后，在0.1%升汞溶液中浸泡5 min，取出后用无菌水冲洗5次。在无菌研钵内加入10 mL无菌水和少许灭菌石英砂，研磨成匀浆，静置30 min，取上层溶液并稀释10倍后，再吸取0.1 mL至准备好的NA平板上，涂抹均匀后，放入培养箱培养，48 h后记录观察，并根据菌落形态、颜色和大小不同挑取单菌落，获得黄花蒿内生细菌。以组织消毒后用无菌水冲洗的第5次冲洗液为对照，涂皿，3 d后如有菌落生成，证明表面消毒不彻底，弃去。若对照中无菌落，则研磨液中长出的菌落为内生菌，进行纯化培养，于4℃冰箱中保存，备用。
2、菌种鉴定：
2.1、菌种形态、生理、生化特征：
菌株培养特征观察：将SZ1菌株接种在NA平板培养基、NB液体培养基中，30℃下培养24 h，观察描述菌株的菌落形态特征。
革兰氏染色：用接种针挑取SZ1菌株菌落，涂布在干净玻片上的一滴无菌水中，风干固定后，用结晶紫混合液染1 min，水洗，再用碘液作用1 min，水洗，吸干。用95%乙醇脱色至洗脱液无色，用番红液复染2 min，水洗风干后观察。
生长温度：接种100 µL浓度为108 cfu/mL的SZ1菌株菌悬液至50 mL NB培养基中，分别置于4℃、8℃、12℃、20℃、30℃、37℃、41℃、45℃的摇床培养，150 r/mim，48 h后用紫外分光光度计测定600 nm处OD值。以不接菌的NB培养基为对照。
碳源利用试验：在基础培养基（(NH4)2SO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaH2PO4 0.5g，CaCl2·2H2O 0.1g，K2HPO4 0.5 g，蒸馏水1000 mL）中加入不同被测底物（葡萄糖、蔗糖、半乳糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、甘露醇、肌醇，浓度为0.8%，过滤灭菌）作为测试培养基，将菌悬液接种至其中，连续接3代，生长者为阳性。
耐盐试验：将SZ1菌株分别接种于含5%、7% NaCl的NB培养基中，30℃下培养3 d后，观察菌株在培养基中的生长状况。
柠檬酸盐利用试验：每支试管分装5 mL柠檬酸三钠培养基（NaCl 1 g，MgSO4·7H2O0.2 g，NH4H2PO4 0.5 g，柠檬酸钠2 g，蒸馏水1000 mL，0.04%酚红液20 mL，pH=7.0）。将SZ1菌株划线接种至斜面上，培养3 d后观察。若培养基由橙色变成桃红色则为阳性反应，无明显变化则为阴性反应。
氧化酶测定：在干净培养皿中放一张滤纸，滴上1%盐酸二甲基对苯撑二胺水溶液，挑取将培养18 h的菌苔涂布在湿润的滤纸上，10~60 s出现红色为阳性反应。以不涂布细菌的滤纸为对照。
接触酶测定：将培养24 h的SZ1菌株涂布在滴有3%过氧化氢的玻片上，如有气泡产生则为阳性，无气泡产生为阴性。
硝酸盐还原试验：将SZ1菌株接种于硝酸盐液体培养基（酵母膏3.0 g，蛋白胨5.0g，KNO3 1.0 g，蒸馏水1000 mL，pH=7.0~7.6）中，于30℃培养1 d、3 d、5 d后取出培养液各2mL，滴加格里斯氏试剂A液、B液各一滴，观察颜色变化。以不接菌的培养基为对照。若溶液变为粉红色，玫瑰红色，橙色，棕色等表示亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性。若无红色出现，则滴两滴二苯胺试剂，此时如呈蓝色反应，表示培养液中仍有硝酸盐，但无亚硝酸盐反应，表示无硝酸盐还原作用；如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都已被还原成其他物质，故仍按硝酸盐还原阳性处理。
淀粉水解反应：将SZ1菌株接种至淀粉培养基平板（NA培养基中加0.2%可溶性淀粉）上，置30℃下培养24 h形成明显菌落后，在平板上滴加碘液，若平板呈蓝黑色，菌落周围有不变色透明圈，表示淀粉水解阳性；仍是蓝黑色为阴性。
明胶液化试验：试管中分装5 mL含明胶的培养基（牛肉膏3.0 g，蛋白胨5 g，明胶100 g，蒸馏水1000 mL，pH=7.2~7.4），灭菌后穿刺接种SZ1菌株，置30℃下培养，观察细菌生长情况和明胶是否液化。以未接种培养基为对照。观察前将试管放入冷水中冷却至对照管凝固。如菌已生长，明胶表面无凹陷且为稳定的凝块，则为明胶水解阴性。如明胶凝块部分或全部在20℃以下变为可流动的液体，则为明胶水解阳性。如菌已生长，明胶未液化，但明胶表面菌苔下出现凹陷的小窝也是轻度水解，按阳性记录。
脲酶试验：每支无菌试管分装5 mL培养基（蛋白胨1 g，NaCl 1 g，葡萄糖1 g，KH2PO4 2 g，0.2%酚红水溶液6 mL，琼脂15 g，蒸馏水1000 mL，调pH至6.8~7.0灭菌后冷却至50-55℃，加入20%过滤灭菌的尿素溶液），摆成较大斜面。将SZ1菌接种至斜面上，30℃培养24 h后观察。如培养基呈桃红色则为阳性，培养基颜色不变为阴性。阴性结果要观察4 d。
脂酶（Tween 80）试验：将SZ1菌接划线种至平板培养基（蛋白胨10 g，NaCl 5 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 mL，pH=7.4，加Tween 80至终浓度为1%）上，30℃培养7 d，每天观察。如在细菌生长周围有模糊的晕圈，则为阳性，没有晕圈，则为阴性。
2.2、菌种的分子鉴定：
2.2.1、细菌基因组DNA的提取：
（1）将菌株接种至100 mL LB培养基中，过夜培养后，5000 r/min离心10 min，弃去上清液；
（2）加9.5 mL TE悬浮细菌，并加入0.5 mL 10% SDS，50 μL浓度为20 mg/ml的蛋白酶K，混匀，37℃保温1 h；
（3）加1.5 mL浓度为5 mol/L的NaCl，混匀；
（4）加1.5 mL CTAB/NaCl溶液（2% CTAB，1.4 mol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，pH=8.0），混匀，65℃保温20 min；
（5）用等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提，5000 r/min离心10 min，将上清液移至干净的离心管中；
（6）用等体积氯仿:异戊醇（24:1）抽提，取上清液，移至干净的离心管中；
（7）加一倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静置10 min，沉淀DNA；
（8）用玻璃棒捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，自然干燥后溶于1 mL TE中，-20℃保存，备用；
（9）取10 μL提取的DNA，加TE溶液稀释至2 mL，紫外分光光度计下检测OD260/OD280的比值，以测定DNA纯度。
2.2.2、16S rRNA基因的PCR扩增及序列分析：
以细菌的基因组DNA为模板，用细菌16S rDNA基因的通用引物进行PCR扩增，引物序列如下所述：27F：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，如SEQ ID NO:2所示；1525R：5’-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3’，如SEQ ID NO:3所示。反应体系：5 μL 10×buffer，3 µL MgCl2（25 mmol/L），1 µL dNTP（10 mmol/L），0.25 µL Taq DNA polymerase（5 U/µL），1 µL 27F，1 µL 1525R，2 µL模板，用无菌水补足至50 μL。扩增条件：95℃预变性10 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 40 s，共37个循环；72℃延伸7 min。取10 μL PCR产物，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。
对扩增得到的产物进行序列测定，NCBI Genebank Blast软件对序列比对分析，获取相近典型菌株的基因序列，采用CLUSTAL W工具将序列及其相似性序列进行遗传关系研究，并用邻接法构建系统发育树状图。
2.3、实验结果：
通过上述实验所得黄花蒿内生菌SZ1，其菌落形态特征：SZ1菌在基础NA培养基上生长良好，在NA平板培养基上为灰白色，不透明，表面较粗糙，类似毛玻璃或融蜡状，菌落较大（如图1所示）；
菌体形态特征：菌体呈杆状，末端较方，成短或长链，大小为(1.0~1.2) × (3.0~5.0) μm（如图2所示）；
生理生化特征（如表1所示）：在0℃以下或40℃以上条件下不能生长，在5%和7%的NaCl溶液中能够生长，可以利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖、鼠李糖和甘露醇，不可以利用L-阿拉伯糖和肌醇，氧化酶和接触酶测定结果为阳性，能够利用柠檬酸盐，硝酸还原、淀粉水解、明胶液化和酯酶试验为阳性，脲酶试验为阴性。
经过序列测定，上述SZ1菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，与蜡状芽孢杆菌（B. cereus）、苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）、炭疽芽孢杆菌（B. anthracis）的相似度达99%。综合序列同源性分析、Blast比对（如图3所示）、形态特征及生理生化特征等实验结果，鉴定上述SZ1菌为蜡状芽孢杆菌。
实施例二：蜡状芽孢杆菌SZ1促进黄花蒿生长及提高青蒿素产量的效果实验。
本实施例中的NA培养基的配方如下：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1000 mL，pH=7.2-7.4。
取保藏编号为CGMCC No. 7313的蜡状芽孢杆菌SZ1菌株置于NA培养基中，在28℃条件下，摇床振荡培养12 h，4000 rpm离心10 min，去上清，加入无菌水将SZ1菌的浓度调节为107 cfu/mL（OD600），得到菌液。
取黄花蒿种子（1 g），首先用70%酒精浸泡消毒5 min，然后用无菌水冲洗3次，最后浸泡在菌液（20mL）中1 h，完成浸种过程。在其余操作均相同的前提下，采用相同体积的无菌水来代替菌液，作为空白对照组来进行平行试验。将处理组和对照组的黄花蒿种子播种于花盆中，自然条件下培养，每天浇水1次。
90天后，处理组的黄花蒿生长状况（图4）及青蒿素含量明显优于对照组，平均根长增加25%，平均鲜重增加25%，干重增加21.6%，青蒿素含量增加20%。
实施例三：蜡状芽孢杆菌SZ1促进黄花蒿生长及提高青蒿素产量的效果实验。
本实施例中的NA培养基的配方与实施例二相同。
取保藏编号为CGMCC No. 7313的蜡状芽孢杆菌SZ1菌株置于NA培养基中，在28℃条件下，摇床振荡培养12 h，4000 rpm离心10 min，去上清，加入无菌水将SZ1菌的浓度调节为109 cfu/mL（OD600），得到菌液。
取黄花蒿种子（1 g），首先用70%酒精浸泡消毒5 min，然后用无菌水冲洗3次，最后浸泡在菌液（5 mL）中3 h，完成浸种过程。在其余操作均相同的前提下，采用相同体积的无菌水来代替菌液，作为空白对照组来进行平行试验。将处理组和对照组的黄花蒿种子播种于花盆中，自然条件下培养，每天浇水1次。
90天后，处理后的黄花蒿生长状况及青蒿素含量明显优于对照组，平均根长增加10%，平均鲜重增加10%，干重增加7%，青蒿素的含量增加10%。
实施例四：蜡状芽孢杆菌SZ1促进黄花蒿生长及提高青蒿素产量的效果实验。
本实施例中的NA培养基的配方与实施例二相同。
取保藏编号为CGMCC No. 7313的蜡状芽孢杆菌SZ1菌株置于NA培养基中，在28℃条件下，摇床振荡培养12 h，4000 rpm离心10 min，去上清，加入无菌水将SZ1菌的浓度调节为108 cfu/mL（OD600），得到菌液。
取黄花蒿种子播种于花盆中，自然条件下培养，每天浇水1次，当黄花蒿幼苗的植株高度为5 cm时，在其根附近灌入菌液1 mL，完成灌根过程。在其余操作均相同的前提下，采用相同体积的无菌水来代替菌液，作为空白对照组来进行平行试验。
自灌根后120天，处理组的黄花蒿生长状况（图5）及青蒿素含量明显优于对照组，平均根长增加20%，平均鲜重增加16.4%，干重增加13.7%，青蒿素含量增加15%。

Claims (7)

1.一种蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），其已保藏于CGMCC，保藏编号为CGMCC No.7313，保藏日期为2013年3月15日。
2.根据权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌，其特征在于：所述蜡状芽孢杆菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌在促进黄花蒿生长和/或提高黄花蒿中的青蒿素产量中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：将所述蜡状芽孢杆菌依下法配制成菌液后使用：取蜡状芽孢杆菌菌株置于NB培养基中，在25~30℃条件下，摇床振荡培养10~12小时，离心后去上清，加入无菌水将SZ1菌的浓度调节为107~109 cfu/mL，即得菌液，其中NB培养基的配方如下：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，蒸馏水1000 mL，pH=7.2~7.4。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述菌液的应用方式包括浸种和灌根。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：在所述浸种方式下，每克黄花蒿种子所需的菌液施用量为5~20毫升，浸泡时间为1~3小时。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：在所述灌根方式下，当黄花蒿幼苗的植株高度为5厘米时，在其根部附近一次性灌入菌液1~2毫升。
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