CN113817653B - 一株荧光假单胞菌BsEB-1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株荧光假单胞菌（Pseudomonas Fluorescens）BsEB‑1，其是一株分离自白芨的内生菌，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.23364；本发明中的荧光假单胞菌菌株BsEB‑1为革兰氏阴性菌，对氨苄青霉素与阿莫西林耐药，不具有固氮能力，但具有溶磷作用和产吲哚乙酸的能力，能促进白芨组培苗及其根系生长，并能提高白芨组培苗的移栽成活率；对中国传统药材白芨的高效生产具有重要意义，具有明显的社会效益和经济效益。

Description

一株荧光假单胞菌BsEB-1及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株白芨内生荧光假单胞菌（ Pseudomonas  Fluorescens）BsEB-1及其在提高白芨组培苗的移栽成活率以及促进白芨生长中的应用。

背景技术

大量研究发现内生细菌可促进植物对矿质营养的吸收和利用，在抑制植物病原菌，刺激植物生长方面起着重要作用。内生细菌利用植物内生圈作为一个独特的保护生态位，不受影响根际和附生细菌的波动环境条件的干扰，对寄主植物的有益作用通常大于许多根际细菌。目前已在植物中鉴定出多种内生细菌菌株，假单胞菌属( Pseudomonas)是其中常见的一类，该属细菌营养需求相对简单，属内的多个种可以利用植物根分泌的养分迅速在植物根部定殖，产生活性物质或改善矿质营养或分泌抗生素等化合物抑制病原微生物直接或间接促进植物生长，对植物病害也具有较好的防治效果，是一种重要的有益微生物资源，是微生物肥料和生防制剂生产中最常见也是最重要的菌种之一。虽然假单胞菌是一种常见的内生植物根际促生细菌，但是它们也具有丰富的遗传多样性，与植物和环境有协同效应，环境条件对假单胞菌的发育和遗传分化有重要影响，因此不同植物和环境中假单胞菌的种类和功能也有较大差异。

白芨（ Bletillastriata）是我国的传统中药材之一，常以其干燥块茎入药，有收敛止血、清热利湿、消肿生肌等功效，也常用于药物的载体材料、成膜材料等的原料用药，因此白芨具有较高的药用价值和商用价值。随着人们对白芨认识的不断加深，用途不断扩大，导致野生资源量急剧减少，药材供需矛盾日益加剧。白芨种子发育不完全且极其细小，很难播种出苗，生产上大都以块茎进行繁殖，繁殖系数较低。因此白芨很大程度上依赖于组织培养繁殖和人工种植。白及人工种植时和三七一样也会产生连作障碍，研究发现根际微生物及根内共生微生物的动态变化是其重要诱因。因此通过对白芨内生细菌的研究可能对白芨的人工种植具有重要的促进作用。

发明内容

针对白芨繁殖和人工种植技术中存在的不足，本发明提供了一株荧光假单胞菌（ Pseudomonas Fluorescens）BsEB-1，其于2021年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 23364，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明另一目的是提供上述荧光假单胞菌（ Pseudomonas Fluorescens）BsEB-1的新用途，即将荧光假单胞菌（ Pseudomonas Fluorescens）BsEB-1应用在提高白芨组培苗的移栽成活率以及促进白芨生长中，解决白芨繁殖和人工种植困难的问题。

为了实现以上目的，本发明采取以下技术措施：

1、从云南弥勒白芨种植基地采集新鲜白芨，将白芨根系洗涤消毒后，切割并装入无菌水中振荡，溶液按10倍稀释法稀释后，涂布于LB培养基上，紫外灯下观察，挑取具有绿色荧光的单菌落，经2～3 次划线纯化后得到纯菌种；该菌种16s RNA鉴定为荧光假单胞菌，全基因组测序后进行基因注释，在假单胞菌处被注释到的基因达到了4941个，属于荧光假单胞菌的基因156个，远远高于假单胞菌属的其它菌，这也证明了该菌株属于假单胞菌科的假单胞菌属的荧光假单胞菌，并命名为BsEB-1；

2、采用标准KB纸片扩散法对分离菌株进行常用抗生素药物的敏感性检测，通过测量抑菌圈直径，比较菌株对不同抗生素的敏感性，发现该菌株对氨苄青霉素与阿莫西林耐药，对壮观霉素、利福平、潮霉素、头孢霉素、红霉素、卡那霉素具有不同程度的敏感性；

3、对该菌株的固氮活性、溶磷作用及产吲哚乙酸（IAA）能力进行了检测，发现该菌株不具有固氮活性，具有溶磷活性和产IAA能力；

4、以红色荧光蛋白为报告基因构建原核表达载体，并转入荧光假单胞菌中获得工程菌，能稳定表达红色荧光蛋白，荧光假单胞菌BsEB-1在转入红色荧光蛋白为报告基因后能稳定表达红色荧光蛋白，且能在激光共聚焦显微镜下清晰地观察到，荧光强度大，背景小，便于研究该菌与白芨及其它植物的相互作用；

5、将荧光假单胞菌BsEB-1与白芨幼苗共培养后，通过激光共聚焦显微镜观察发现该菌在白芨幼根的成熟区定殖，并通过与组培苗共培养和盆栽试验对其影响白芨生长的作用进行验证。

本发明荧光假单胞菌BsEB-1具有促进白芨组培苗生长及根系发育的作用，并能提高白芨组培苗移栽成活率，对中国传统药材白芨的高效生产具有重要意义，具有明显的社会效益和经济效益。

附图说明

图1是荧光假单胞菌BsEB-1的革兰氏染色结果图；

图2是荧光假单胞菌BsEB-1的16s RNA的PCR扩增电泳图；

图3是荧光假单胞菌BsEB-1的系统进化树分析图；

图4是荧光假单胞菌BsEB-1全基因组测序后的NR数据库物种注释统计图；

图5是荧光假单胞菌BsEB-1的抗生素药敏活性结果图；

图6是荧光假单胞菌BsEB-1固氮活性检测结果示意图；

图7是荧光假单胞菌BsEB-1溶磷作用结果图；

图8是钼锑抗法检测可溶性磷时磷酸二氢钾的标准曲线图；

图9是紫外分光光度法检测IAA的标准曲线图；

图10是红色荧光蛋白原核表达载体构建过程的菌落PCR检测图；

图11是红色荧光蛋白原核表达载体构建过程的双酶切检测图；

图12是转入红色荧光蛋白原核表达载体后菌株的荧光显微镜观察图；

图13是激光共聚焦显微镜观察荧光假单胞菌BsEB-1在白芨根系中的定殖情况图，其中明场是透射扫描图像，荧光场是激光共聚焦扫描的荧光通道图像，混合场是指荧光场和明场重叠的图像；

图14激光共聚焦显微镜观察白芨根系的情况图，其中明场是透射扫描图像，荧光场是激光共聚焦扫描的荧光通道图像，混合是指荧光场和明场重叠的图像；

图15是生根培养基中白芨组培苗与荧光假单胞菌BsEB-1共培养时根系的生长情况图，其中左图为无菌培养，右图为共培养；

图16是不同处理白芨组培苗移栽10天后的成活情况图，其中左图为无菌培养，右图为共培养；

图17是不同处理白芨组培苗移栽30天后的成活情况图，其中左图为无菌培养，右图为共培养。

具体实施方式

下面通过实施例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容；实施例中方法如无特殊说明，按常规操作进行，如无特殊说明使用试剂均为常规试剂或按常规方法配制的试剂，如无特殊说明方法中百分数均为质量体积百分数。

实施例1：白芨内生荧光假单胞菌的分离鉴定

从云南弥勒采集新鲜白芨根10g，先用酒精消毒1min，无菌水洗涤3次，再用10％的次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水洗涤3次；然后将根系切割放入盛有90mL无菌水的三角瓶中，振荡约20min；取其溶液1mL逐级稀释至10^-7倍，分别取浓度10^-4、10^-5、10^-6、10^-7的稀释液均匀地涂于LB固体培养基上，每个浓度梯度重复3皿，在28℃恒温下培养1~2天；紫外灯下观察，挑取具有绿色荧光的单菌落，经2～3次划线纯化后得到纯菌种；革兰氏染色结果呈阴性，菌体呈短杆状、两端钝圆、无芽孢，结果见图1。

将纯化后的菌接种到LB液体培养基中培养24h后，4℃、4000rpm离心5min，去掉上清液，加入无菌水，使用灭菌枪头将沉淀充分吹打混匀，重复3次；在载玻片中央缓慢的滴加约50μL菌液并铺展开，在酒精灯上方多次灼烧，每次1-2s，高度以接触手背不烫为准，等待菌液干燥；用染料草酸铵结晶紫染1-2min，水洗；用碘液冲去残水，覆盖1-2min，水洗；将残余水分用吸水纸吸走，倾斜玻片，白色的背景之下，滴加95%乙醇至流出乙醇无紫色，并水洗；滴加番红染色处理2-3min，水洗；待玻片干燥后，用光学显微镜观察，菌体呈短杆状、两端钝圆、无芽孢，染色结果为红色（见图1），证明其为革兰氏阴性杆状菌。

采用16S通用引物进行菌液PCR 扩增鉴定细菌，通用引物序列为：27F：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’；1429R：5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3’；PCR反应采用20μL体系：上下游引物各1μL、无菌水8μL、10μL2×Taq Mastermix。PCR 扩增条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s，5 退火55℃时间30s，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min，获得16SRNA 基因片段，扩增结果见图2，琼脂糖电泳胶回收产物送擎科生物有限公司测序，序列如序列表1所示，将测序结果在NCBI上进行比对，荧光假单胞菌BsEB-1的系统进化树分析图见图3，确认本实施例中分离的菌株为荧光假单胞菌( P.Fluorescens)，命名为BsEB-1；

对该菌种进行全基因组测序，BsEB-1菌株的全基因组总长度为6101651bp，预测到编码基因5539个，所有编码基因总长度5427618bp，编码区总长度占全基因组的比例为88.95%，该菌在假单胞菌处被注释到的基因达到了4941个，其中属于荧光假单胞菌属的基因占主要数量，达156个（结果见图4），这也证明了该菌株属于假单胞菌科假单胞菌属的荧光假单胞菌。

实施例2：荧光假单胞菌BsEB-1的抗生素药敏活性检测

采用标准KB纸片扩散法对分离菌株进行常用抗生素药物的敏感性检测。

选用质地均匀的滤纸，用打孔机打成直径相同的圆片，灭菌后烘干，浸泡于待测抗生素中，抗生素浓度为50μg/mL。以涂布法接种BsEB-1菌株于LB平板上，贴上干燥后的药敏纸片，以无抗生素的圆形纸片为对照，28℃培养48h后观察抑菌圈大小，判断BsEB-1菌株对药物的敏感性，结果如图5所示。含有卡那霉素（Km）的滤纸片抑菌圈最大，其次为红霉素(Ery)、头孢霉素(Cef)、潮霉素(Hyg)、利福平(Rif)和壮观霉素(Spe)，对氨苄青霉素(Amp)和阿莫西林(Amx)不敏感，说明其对氨苄西林与阿莫西林耐药。

实施例3：白芨荧光假单胞菌BsEB-1的促生活性检测

1、固氮活性检测：将BsEB-1菌液4℃、5000rpm离心4min，去上清液；菌体加入无菌水40mL洗涤，吹打混匀，重复3次；洗涤后再用水悬浮，吸取菌液20μL，加到阿须贝无氮固体培养基上；用玻璃涂布棒把菌液涂布均匀，28℃恒温培养箱中培养2-7d后进行观察，同时以本实验室分离鉴定的固氮阳性菌株假苍白杆菌（28℃培养）和无固氮活性的大肠杆菌DH5α（37℃）对照菌株，结果见图6。阳性菌株能正常生长，BsEB-1不能生长，大肠杆菌也不能生长，说明BsEB-1无固氮活性。

2、溶磷活性检测：将BsEB-1菌液在4℃、5000rpm下离心4min，去上清液，菌体加入无菌水洗涤3次；洗涤后再用水悬浮，吸取菌液20μL，加到NBRIP固体溶磷培养基上；用玻璃涂布棒把菌液涂布均匀，28℃培养2-7d后进行观察，结果见图7。

采用钼锑抗法检测菌液中的可溶性磷。以磷酸二氢钾为可溶性磷标准品制作标准曲线，加入钼锑抗混合显色剂5mL，加蒸馏水定容至50mL，静置30min，测量OD₆₆₀处的吸光度值，得到标准曲线y=178.83x+40.297，见图8。取20μL无菌水悬浮的菌液加到40mL NBRIP液体溶磷培养基中，28℃、160rpm恒温培养4d后，菌液以8000rpm离心10min；取1mL上清液于50mL容量瓶中；以未加菌的NBRIP液体溶磷培养基按上述处理后作为空白对照，加入钼锑抗混合显色剂5mL，加蒸馏水定容至50mL，静置30min，测量OD₆₆₀处的吸光度值，带入标准曲线进行计算，得到菌液中所含的可溶性磷元素含量为345.02mg/L；

3、产IAA能力检测

（1）IAA标准曲线的制作

配置IAA标准溶液，各取浓度为25、50、75、100、125、150、175mg/L的IAA溶液4mL，加入4mL S2比色液（S2比色液是将氯化铁4.5g溶于300mL蒸馏水，加入587.4mL浓硫酸，冷却定容至1L制得），混匀后静置30min，测定OD₅₃₀值，制作标准曲线，IAA标准曲线见图9；

（2）将BsEB-1菌液在4℃、5000rpm下离心4min，去上清液，菌体用无菌水洗涤3次后再用无菌水悬浮。吸取1mL菌液，接种至King’sB培养基中，28℃、160rpm下培养4d后进行定量测定；

（3）IAA 含量的测量

将步骤（2）中培养4d的菌液和空白培养基对照组以10000rpm 离心10min，取培养基上清液4mL，加入4mL S2比色液，静置30min，测定OD₅₃₀值，将测量值代入步骤（1）标准曲线中计算，最终得到IAA的量为6.90mg/L。

实施例4：白芨荧光假单胞菌BsEB-1的改造

采用带有卡那基因抗性的多宿主表达载体pBBR1MCS-2，根据其多克隆位点以及红色荧光蛋白mRFP1 基因序列，使用Prime5设计带酶切位点的PCR引物，引物序列为：mRFP1-FctcgagATGGCCTCCTCCGAGGACGT；mRFP1-R gaattcTTAGGCGCCGGTGGAGTGGC，以本实验室保存的含红色荧光蛋白基因的菌种为模板，PCR扩增得到mRFP1基因；然后通过TA克隆将mRFP1基因连接到pMD18T 载体上，转化DH 5α得到单菌落，再进行PCR检测和测序验证；提取pMD18T-mRFP1质粒与多宿主表达载体pBBR1MCS-2，分别使用 XhoⅠ和 EcoRⅠ进行双酶切连接后转化DH5α，进行单菌落筛选，PCR 检测（图10）和双酶切验证（图11），获得的片段大小为750bp左右。

制备BsEB-1感受态细胞，然后将BsEB-1感受态细胞与pBBR1MCS-2-mRFP1质粒混合，使用热激法将质粒转入BsEB-1细胞中，加入LB液体培养基复苏3h后涂至含有卡那霉素的LB平板上，28℃培养约40h，挑取抗性单菌落进行PCR和测序验证后进行扩大培养；取菌液1μL稀释后涂抹在载玻片上，使用荧光倒置显微镜进行观察，菌体显绿色和红色，并且红色荧光更为明显，结果见图12。

实施例5：生根培养基中白芨组培苗与荧光假单胞菌BsEB-1共培养实验

将转入pBBR1MCS-2-mRFP1的BsEB-1细菌用LB液体培养基扩大培养后离心后，OD₆₀₀值达0.6-0.8时，取5mL加入到50℃的500mLMS生根固体培养基中，迅速混匀后分装到组培瓶中，4℃保存备用。将无菌已生根白芨幼苗接种到无菌或有菌的MS生根固体培养基中，每隔三天取1组白芨幼苗，将其幼根使用EDTA溶液冲洗后，纵切制片使用激光共聚焦显微镜进行观察；直至共培养的第七天，白芨幼根的成熟区内部出现红色荧光（图13），其余部位没有荧光，未与内生菌共培养的白芨幼根中无红色荧光（图14），培养至20天后，结果和第七天的一样；

将株高、大小相近的白芨无根幼苗接种到无菌或加菌的MS培养基中，观察白芨苗和根系的生长情况；发现与BsEB-1菌共培养的白芨苗长势和根系发育情况更好，结果见图15。

实施例6：共培养组培苗移栽成活率实验

将有BsEB-1菌共培养或无菌培养的生长情况一致的白芨组培苗各12株，经过炼苗后移栽到无菌土壤中后进行观察。10天后发现与BsEB-1菌共培养的苗很快定植生长，存活率达到100%，而未和菌共培养的苗部分出现叶片枯萎后重新出叶，部分死亡，最终存活率为65%左右，结果见图16。30天之后与BsEB-1菌共培养的苗长势也更好（见图17），说明BsEB-1内生菌具有提高组培苗移栽存活率和促进白芨苗生长的能力。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一株荧光假单胞菌BsEB-1及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1397

<212> DNA

<213> 白芨(Bletillastriata)

<400> 1

taagaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc ggtagagaga agcttgcttc 60

tcttgagagc ggcggacggg tgagtaaagc ctaggaatct gcctggtagt gggggataac 120

gttcggaaac ggacgctaat accgcatacg tcctacggga gaaagcaggg gaccttcggg 180

ccttgcgctc ccagatgagc ctaggtcgga ttagctagtt ggtgaggtaa tggctcacca 240

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ggcattaacc taatacgttt ttttaaaaat agtgtttcga cgttaccgac agaataagca 480

ccggctaact ctgtgccagc agccgcggta atacagaggg tgcaagcgtt aatcggaatt 540

actgggcgta aagcgcgcgt aggtggtttg ttaagttgga tgtgaaggcc ccgggctcaa 600

cctgggaact gcatccaaaa ctgactgacc gcggcgcgcg cgctagagta tggtagaggg 660

tggtggaatt tcctgtgtag yggtgaaatg cgttgatata ggcgaccacc tggactaata 720

ctgacactga ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780

ccgtaaacga tacggtcgca aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggn ccgcacaagc 840

ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggcc ttgacatcca 900

atgaactttc tagagataga ttggtgcctt cgggaacatt gagacaggtg ctgcatggct 960

gtcgtgcggc aaatttcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg taacgagcgc 1020

aaccttgtcg atagttacca gcacgtaatg gtgggcactc taaggagact gccggtgaca 1080

aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt catcatggcc cttacggcct ggcctacaca 1140

cgtgctacaa tggtcggtac agaggggggg ccccaaatcg actgcgtgaa gtcggaatcg 1200

ctagtaatcg cgaatcagaa tgtcgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1260

cgtcacacca tgggagtggg tgcaccagaa gtagctagtc taaccttcgg gaggacggtt 1320

accacggtgt gattcatgac tggagtgaag tcgtaacaag gtagccgtag gggaacctgc 1380

ggctggatca cctccgg 1397

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

ctcgagatgg cctcctccga ggacgt 26

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

gaattcttag gcgccggtgg agtggc 26

Claims (2)

1.一株荧光假单胞菌（Pseudomonas Fluorescens）BsEB-1，其是一株分离自白芨的内生菌，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.23364。

2.权利要求1所述的荧光假单胞菌（Pseudomonas Fluorescens）BsEB-1在提高白芨组培苗的移栽成活率以及促进白芨生长中的应用。

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