CN112746041B - 广布泛菌lsnsy15-4菌株及其在促进烟草生长方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种广布泛菌LSNSY15‑4菌株及其在促进烟草生长中的应用，属于微生物技术领域，该广布泛菌LSNSY15‑4保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21240，为一种来源于烟草根际中的植物根际促生细菌。与现有技术相比，该广布泛菌LSNSY15‑4菌株能够解磷、分泌IAA，对烟草株高、叶片数、根长和鲜重具有明显的促进作用，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种广布泛菌LSNSY15-4菌株及其在促进烟草生长方面的应用。
背景技术
化学肥料的大量施用虽起到明显的增产效果，但长期大量施用造成土壤板结、肥力下降，在很大程度上危害土壤生态环境和农业的可持续发展。而微生物肥料的施用能够改良土壤化学性质，提高土壤养分的可利用性，满足植物养分的同时，还能够改善作物品质，调节根际微生物群落，抑制病害。目前常用的微生物肥料主要为植物根际促生细菌和真菌。
植物根际促生细菌是指生存在植物根际范围内的有益细菌，能促进植物生长和提高植物抗病能力，并且对环境友好和人畜安全，与化学肥料混合施用使用可以降低化肥施用量，符合农业的可持续发展。植物根际促生细菌主要包括假单胞菌属(Pseudomonasspp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、固氮菌属(Azotobacter spp.)、沙雷氏菌属(Serratia spp.)、泛菌属(Pantoea spp.)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia spp.,)、根瘤菌属(Rhizobium spp.) 等。植物根际促生细菌在植物根际成功定殖后，通过提高磷等营养元素的可利用性，分泌吲哚乙酸、赤霉素、亚精胺等植物生长调节剂，或产生挥发性化合物等方式促进植物生长；还可以通过拮抗作用、诱导系统抗性、竞争营养和空间位点等方式防治植物病害。
目前关于泛菌属促进植物生长方面的报道大多集中在C9菌株。C9菌株分离自柠条根系，通过分泌有机酸溶解难溶磷来提高土壤中磷元素的可利用性。此外，泛菌C9-1菌株被证实能有效抑制病原菌欧文氏菌(Erwinia amylovora)，已被开发成产品BlightBan C9-1用于防治梨火疫病，但对烟草生长方面是否具有促进作用，以及烟草相关的植物根际促生细菌鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种广布泛菌LSNSY15-4菌株及其在促进烟草生长方面的应用，以提供一种对烟草生长方面具有显著促进作用的新的泛菌属菌株，填补烟草方面植物根际促生细菌种类匮乏，促生效果较差的技术问题。
本发明采用以下技术方案来实现：
本发明提供了一种广布泛菌LSNSY15-4菌株，分类命名为广布泛菌Pantoeavagans，该菌株于2020年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.21240。
该广布泛菌LSNSY15-4菌株是从烟草根际土中分离获得的，为革兰氏阴性菌、杆状、周生鞭毛、能运动；在牛肉膏蛋白胨培养基上的单菌落为圆形，黄色，菌落表明光滑不透明； gyrB基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；该广布泛菌LSNSY15-4具有解磷能力、能够产生较高水平的IAA，对烟草具有很好的促生作用。
本发明还提供了上述广布泛菌LSNSY15-4菌株在促进烟草生长方面的应用，具体为，将所述广布泛菌LSNSY15-4菌株制成菌剂，对烟草进行灌根处理。
作为本发明的进一步优化方案，所述烟草的叶龄为5-6叶龄。
作为本发明的进一步优化方案，所述菌剂中广布泛菌LSNSY15-4菌株浓度为1×108 cfu/mL，每颗烟草的菌剂用量为10mL，每间隔7d灌根处理一次，共处理3次。
本发明还提供了一种广布泛菌LSNSY15-4菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将上述广布泛菌LSNSY15-4菌株接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，于30℃培养 48h；
(2)挑取步骤(1)中的单菌落于20mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、180r/min震荡培养48h；
(3)8000r/min离心10min后弃上清，用无菌水悬浮菌体并调节菌悬液浓度至1×108 cfu/mL，获得广布泛菌LSNSY15-4菌剂。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种广布泛菌LSNSY15-4菌株及其在促进烟草生长方面的应用，该广布泛菌LSNSY15-4菌株具有解磷能力、产生的IAA含量超过200mg/mL，对烟草具有很好的促生作用，利用该菌株对烟草进行灌根处理后，烟草株高、根长和鲜重的增幅分别为22.45％、35.57％和155.72％，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明所述的广布泛菌LSNSY15-4在牛肉膏蛋白胨培养基上的的菌落图片；
图2为本发明所述的广布泛菌LSNSY15-4基于gyrB基因序列构建的系统发育树；
图3为本发明所述的广布泛菌LSNSY15-4对难溶性无机磷的解磷效果；
图4为本发明所述的广布泛菌LSNSY15-4分泌IAA含量；
图5为本发明所述的广布泛菌LSNSY15-4对烟草叶片(A)和株高(B)的影响。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
实施例1
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
2.1广布泛菌LSNSY15-4菌株的分离纯化
本发明的广布泛菌LSNSY15-4是从烟草根际通过稀释涂板法和平板划线法分离纯化获得的，分离方法为：取10g根际土放入带有玻璃珠的90mL生理盐水中，180r/min震荡30min，制成10-1稀释液。吸取100μL10-1稀释液于900μL无菌水中得到10-2稀释液，按此方法依次获得10-3和10-4稀释液。分别吸取100μL 10-3、10-4倍稀释液涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，30℃恒温培养48h后，挑取牛肉膏蛋白胨固体培养基上不同形态的细菌菌落于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化细菌菌株，分别编号保存并进行菌种筛选，获得编号为LSNSY15-4菌株。如图1所示，为LSNSY15-4菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落图片。
2.2广布泛菌LSNSY15-4菌株的鉴定
提取LSNSY15-4的基因组，采用gyrB引物进行PCR扩增，扩增产物测序后通过NCBI数据库在线比对，利用MEGA软件构建系统发育树。
引物序列为：
上游引物：5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3’；
下游引物：5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTT YGA-3’；
其中，R、N、Y为兼并碱基，R表示A/G，N表示A/G/C/T，Y表示C/T。
LSNSY15-4扩增产物序列如SEQ ID NO.1所示。
如图2所示，LSNSY15-4与广布泛菌(Pantoea vagans)相似度最高，因此将LSNSY15-4 归入广布泛菌(Pantoea vagans)，命名为广布泛菌LSNSY15-4菌株。
2.3广布泛菌LSNSY15-4菌株的解磷效果
挑取广布泛菌LSNSY15-4单菌落于20mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、180r/min 振荡培养至OD600约为0.5左右，取10μL点接于以Ca3(PO4)2为唯一磷源的PVK培养基中心，置于30℃培养箱中培养2-5d后，观察溶磷圈大小，根据菌落周围溶磷圈半径大小初步确定广布泛菌LSNSY15-4菌株是否具有溶磷活性。无机磷培养基(PVK)配方：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.2g，KCl 0.2g，FeSO4·7H2O 0.003g，MnSO4 0.03g，MgSO4·7H2O0.03g，酵母膏0.5g，Ca3(PO4)2 5g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L，pH 6.8-7.0。结果如图3所示，图中可以看出广布泛菌LSNSY15-4菌株在PVK培养基上产生溶磷圈，具有解磷效果。
2.4广布泛菌LSNSY15-4产IAA能力测定
挑取广布泛菌LSNSY15-4单菌落于20mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、180r/min 振荡培养至OD600约为0.5左右。取100μL菌悬液加入到含有L-色氨酸(1000mg/L)的LB液体培养基中，30℃、180r/min振荡培养。于培养12h、24h和36h后，吸取1mL菌悬液至1.5mL离心管，8000r/min离心10min去除菌体，取800μL上清液至新的10mL 离心管中，同时加入1600μL Salkowski比色液。室温、避光放置35min后，分光光度计测定反应液在540nm的吸光值，根据IAA标准曲线比较不同菌株在不同时间的IAA产量。 Salkowski比色液配方：FeCl34.5g，溶于10.8mol/L浓硫酸中，冷却后定容至1L。
为进一步验证本发明广布泛菌LSNSY15-4菌株性能，以张磊等人公开的文献中使用的泛菌属GWR3菌株作为对照，进行上述相同操作(张磊、袁梅、孙建光等，马铃薯内生固氮菌的分离及其促生特性研究，中国土壤与肥料，2016，6：139-145)，分别测定本发明广布泛菌 LSNSY15-4菌株和泛菌属GWR3菌株的产IAA能力。结果如图4所示，广布泛菌LSNSY15-4具有产IAA能力，培养12-36h时IAA产生量均超过200mg/L，且在培养24h时达到最大值，优于泛菌属GWR3菌株。
2.5广布泛菌LSNSY15-4菌株对烟草生长的影响
将广布泛菌LSNSY15-4菌株接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，于30℃培养48h；挑取步骤(1)中的单菌落于20mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、180r/min震荡培养48h；8000r/min离心10min后弃上清，用无菌水悬浮菌体并调节菌悬液浓度至1×108 cfu/mL，获得广布泛菌LSNSY15-4菌剂。用上述菌剂对5-6叶龄烟苗进行处理，以等量无菌水为对照。每棵烟苗用量为10mL，每处理10棵烟苗，间隔7d处理1次，共处理3次。于最后一次处理7d后调查烟草生长情况、株高、叶片数、根长和鲜重等指标。同时，以已报道的泛菌属GWR3菌株作为对照。结果如下表1和图5所示：
表1广布泛菌LSNSY15-4对烟草的促生作用
注：小写字母表示在0.05水平差异显著。
表1和图5结果表明，LSNSY15-4处理可以明显促进烟草生长，处理后烟草株高、根长和鲜重的增幅分别为22.45％、35.57％和155.72％。由此表明，LSNSY15-4菌株对烟草具有较好的促生效果，且效果优于现有的GWR3菌株。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 安徽农业大学
贵州省烟草公司遵义市公司
<120>广布泛菌LSNSY15-4菌株及其在促进烟草生长方面的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1078
<212> DNA
<213> 成团泛菌(Pantoea vagans)
<400> 1
gggaaagcaa agtccttcag cagttttcgt ccccggggta cctgaggcac cgctggcggt 60
cactggtgat accgacatca ctggtacccg cgtgcgtttc tggccaagct atgaaacctt 120
taccaacgtg cgcgatttcg agtatgagat tctggcaaaa cgcctgcgcg aactgtcgtt 180
cctgaactcg ggcgtgtcga ttcgcctgga agacaagcgt gatggcaaaa ccgaccactt 240
ccattacgaa ggcggtatca aggcgtttgt tgagtacctc aacaaaaaca aaactccgat 300
tcaccctacc gtgttctatt tctctaccga gaaagatggc attggcgtgg aagtggcgct 360
gcagtggaac gacggcttcc aggaaaatat ttactgcttt accaacaaca tcccgcagcg 420
cgatggcggt acgcaccttg ccggtttccg cgcagcgatg acgcgtaccc tgaatgccta 480
catggataaa gagggttaca gcaagaaagc caaagtcagc gccaccggtg atgatgcgcg 540
tgaaggcctg atcgccgtgg tttcggtaaa agtgccggat ccaaaattct cctcacagac 600
caaagacaaa ctggtctcgt cagaggtgaa atcggcggtt gagcagcaga tgaatgaact 660
gctggcagaa tacctgctgg aaaacccgtc agacgccaaa atcgtcgtgg gcaaaattat 720
cgatgccgca cgtgcccgtg aagcagcacg ccgcgcccgt gaaatgaccc gccgtaaagg 780
cgcgctggat ctggctggtc tgccaggtaa gctggcggat tgtcaggagc gtgacccggc 840
gctctctgaa atctacctgg tggagggtga ctccgcaggc ggctcggcca aacagggccg 900
taaccgtaaa aaccaggcga ttctgccact gaaaggtaag atccttaacg ttgagaaagc 960
gcgtttcgac aagatgctcg cctcgcagga agtggccacg ctgatcaccg cactgggttg 1020
cggtattggt cgcgatgagt acaacccgga caagctgcgc tatcagatac atcatact 1078
Claims (6)
1.一种广布泛菌(Pantoea vagans)LSNSY15-4菌株，其特征在于，该菌株的生物保藏编号为CGMCC No.21240。
2.一种如权利要求1所述的广布泛菌LSNSY15-4菌株在促进烟草生长方面的应用。
3.根据权利要求2所述的一种广布泛菌LSNSY15-4菌株在促进烟草生长方面的应用，其特征在于，将所述广布泛菌LSNSY15-4菌株制成菌剂，对烟草进行灌根处理。
4.根据权利要求3所述的一种广布泛菌LSNSY15-4菌株在促进烟草生长方面的应用，其特征在于，所述烟草的叶龄为5-6叶龄。
5.根据权利要求4所述的一种广布泛菌LSNSY15-4菌株在促进烟草生长方面的应用，其特征在于，所述菌剂中广布泛菌LSNSY15-4菌株浓度为1×108 cfu/mL，每颗烟草的菌剂用量为10mL，每间隔7d灌根处理一次，共处理3次。
6.一种广布泛菌LSNSY15-4菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将权利要求1所述的广布泛菌LSNSY15-4菌株接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，于30 ℃培养48 h，获得单菌落；
（2）挑取步骤（1）中的单菌落于20 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30 ℃、180 r/min震荡培养48 h；
（3）8000 r/min离心10 min后弃上清，用无菌水悬浮菌体并调节菌悬液浓度至1×108cfu/mL，获得广布泛菌LSNSY15-4菌剂。
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