CN113755397B - 一株具广谱拮抗性的解淀粉芽孢杆菌、其微生物菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株具广谱拮抗性的解淀粉芽孢杆菌、其微生物菌剂及其应用，该解淀粉芽孢杆菌被命名为解淀粉芽孢杆菌F012，于2021年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号：CGMCCNo.23371。该菌株不仅能高效防治烟草青枯病，并且基于其对多种病原菌具有广谱抑菌效果，能应用于多种植物病害的防治，如番茄灰霉病、烟草根黑腐病、葡萄炭疽病、蚕豆枯萎病、烟草赤星病等；还能显著提高烟草生物量，促进植株生长，有利于减少化学农药和肥料的使用，尤其在茄科作物病害防治和生产方面具有广泛的应用前景。

Description

一株具广谱拮抗性的解淀粉芽孢杆菌、其微生物菌剂及其 应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株具广谱拮抗性的解淀粉芽孢杆菌、其微生物菌剂及其应用。

背景技术

我国是世界第一烟叶生产大国，烟草是我国重要的经济作物，对烟叶的品质和安全性要求较高。但伴随着植烟面积的不断增加，连作烟田的增多，连作年限的延长，耕作栽培制度及烟草品种的变化，烟草病害种类在增多，危害也在不断加重。其中由于土壤结构和营养的破坏，烟草青枯病成为烟草主要病害之一。传统的农业生产中，防治烟草青枯病的方式主要为化学防治，通过喷施或灌根化学农药，如青枯灵、农用链霉素等，防治烟草青枯病。然而，长期使用化学药剂造成大量现实和潜在的危害，包括环境污染、菌株耐药性以及农药残留等严重问题。因此迫切需要寻求一种安全、高效、环保的防治方法，缓解目前不可持续的农作方式。

微生物菌剂作为化肥农药的替代品近年来成为广大植病科研工作者的研究热点，虽在国内外已有大量研究，但目前可利用的优良菌株资源少，且存在菌株易退化、效果不稳定等难以克服的问题。并且，目前可应用于烟草青枯病防治的生防菌少，并且存在抑菌谱窄，效果不稳定、应用范围较为局限。

因此，现有技术有待进一步改进。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种可高效防治烟草青枯病且具广谱拮抗性的解淀粉芽孢杆菌以利用该菌株的微生物菌剂及其在作物病害防治方面的应用。

第一方面，本发明提供一株具广谱拮抗性的解淀粉芽孢杆菌，该菌株被命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)F012，该菌株于2021年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号：CGMCC No.23371，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明所述的拮抗菌F012从番茄灰霉病发病区域的健康番茄植株土壤中经过筛选获得，编号为F012。

该菌株对烟草青枯病具有良好防治效果且对多种经济作物病害病原菌有广谱拮抗性的拮抗菌F012，丰富了生防菌菌种资源，为研究开发拮抗菌菌剂奠定基础。

菌株F012的形态特征为：在LB培养基上菌落整体为不规则圆形；初期无色透明、表面光滑、湿润、粘稠、边缘整齐；后期为乳白色，表面干燥且有明显圆形凸起、边缘有褶皱产生、直径2～3mm。综合各项生理生化试验结果和分子生物学分析，该菌鉴定为解淀粉芽孢杆菌。

第二方面，本发明一种微生物菌剂，其包括上述的解淀粉芽孢杆菌。此外，为了进一步优化和提高该微生物菌剂的杀菌效果，该微生物菌剂还包括其他配合使用的杀菌活性成分，如杀菌谱存在互补作用的其他生防菌、抑菌物质等。

优选地，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌F012的菌液、菌体或芽孢。可将菌液或菌体(如干粉)与芽孢组合作用。

第三方面，本发明还提供上述的解淀粉芽孢杆菌和前述的微生物菌剂在防治植物病害、促进植物生长方面的应用。

优选地，所述植物包括茄科植物；进一步优选地，所述植物为烟草。

可选地，所述植物病害包括烟草青枯病。所述拮抗的植物病害病原菌包括烟草青枯病菌、烟草黑胫病菌、烟草赤星病菌、葡萄白腐病菌、葡萄炭疽病菌、西瓜枯萎病菌、蚕白僵病菌、烟草根腐病菌、小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌和蚕豆枯萎病菌。

第四方面，本申请还提供一种上述微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

从固体培养基平板上挑取拮抗菌F012单菌落制备种子液，然后将种子液接种于液体培养基中，培养温度为27-30℃，液体培养基的pH值为6.5-7.5，接种量1-5％，发酵转速100-180r/min，装瓶量20-40％，培养48-80h，待菌株生长至平稳期时，稀释菌液，获得所述微生物液体菌剂，或者进一步加工处理得到菌体冻干粉。

优选地，上述制备方法具体为：挑取在从固体培养基平板拮抗菌F012单菌落制备种子液，然后接种于液体培养基中，在培养温度28℃，pH值7.0，接种量2％，发酵转速140r/min，装瓶量30％，培养72h，待菌株生长至平稳期时，使用无菌水稀释菌液，获得所述微生物菌剂。这种培养条件下最利于解淀粉芽孢杆菌F012的发酵，利于生物量的提高。

上述固体培养基和液体培养基可以选择常规的微生物培养基，如常规的LB培养基。

但是，针对解淀粉芽孢杆菌F012的特点，本发明给出了优化后的发酵培养基，该优化的培养基包括以下质量体积浓度的各组分：麦芽糖1％-3％、酵母浸膏1％-3％、胰蛋白胨0.5％-1.5％、Mg SO4·7H2O 0.05％-0.2％、CuSO4·7H₂O 0.0001％-0.001％。可根据上述培养制成液体培养基，或者加入相应浓度的琼脂后制成相应的固体培养基。其与常规的培养基，优化后的该培养基针对解淀粉芽孢杆菌F012的菌株特点和营养需求而设计，能够有效提高解淀粉芽孢杆菌F012的发酵菌数，保证后期微生物菌剂中的有效活菌数，而且适合大量生产。

进一步优选地，上述培养基包括以下质量体积浓度的各组分：麦芽糖2％、酵母浸膏2％、胰蛋白胨1.2％、MgSO₄·7H₂O 0.1％、CuSO₄·7H₂O 0.0009％。该培养基的效果最佳。

本发明具有以下有益效果：

本申请从健康植株土壤中筛选到一株广谱拮抗性生防菌F012，通过对该菌株的遗传特性和生理生化特性进行测定，确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，并对其进行平板抑菌实验、盆栽实验以及大田实验，结果表明，该菌株不仅能高效防治烟草青枯病，并且基于其对多种病原菌具有广谱抑菌效果，能应用于多种植物病害的防治，如番茄灰霉病、烟草根黑腐病、葡萄炭疽病、蚕豆枯萎病、烟草赤星病等；还能显著提高烟草生物量，促进植株生长，有利于减少化学农药和肥料的使用，该拮抗菌菌株及其菌液具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明提供的拮抗菌F012的菌落形态图；

图2为本发明提供的拮抗菌F012的基因序列扩增示意图,图A为16S rDNA；图B为gyrB；

图3为本发明提供的拮抗菌F012的基于gyrB和16S rDNA基因序列构建的系统发育树；

图4为本发明提供的拮抗菌F012的功能定性鉴定图；图4A为不接种拮抗菌效果图，图4B为接种拮抗菌F012后效果图；图4C为接种对照菌拮抗菌F028效果图；

图5为本发明提供的拮抗菌F012拮抗广谱性分析；

图6为本发明提供的拮抗菌F012对团棵期云烟87品种烟草的烟草青枯病的防治效果；图6A为拮抗菌F012防治烟草青枯病效果图，图6B为拮抗菌F012处理过后各处理的病情指数和相对防效；图6C为拮抗菌F012对烟草青枯病的相对防效；

图7为本发明提供的拮抗菌F012对感染烟草青枯病的幼苗期K326品种烟草根系发育的影响；图7A为拮抗菌F012感染烟草青枯病的幼苗期K326品种烟草根系发育的效果图，图7B为拮抗菌F012感染烟草青枯病的幼苗期K326品种烟草根重；

图8为本发明提供的拮抗菌F012对感染烟草青枯病的幼苗期NC55品种烟草根系发育的影响；图8A为拮抗菌F012感染烟草青枯病的幼苗期NC55品种烟草根系发育的效果图，图8B为拮抗菌F012感染烟草青枯病的幼苗期NC55品种烟草根重；

图9为本发明提供的拮抗菌F012对烟草生长的影响；

图10为本发明提供拮抗菌F012对辣椒生长的影响；

图11为本发明提供的拮抗菌F012对番茄生长的影响；

图12为本发明提供的拮抗菌F012对烟草、辣椒、番茄株高的影响；

图13为本发明提供的拮抗菌F012对烟草、辣椒、番茄茎粗的影响；

图14为本发明提供的拮抗菌F012对烟草、辣椒、番茄叶片数的影响；

图15为本发明提供的拮抗菌F012对烟草、辣椒、番茄叶绿素的影响；

图16为本发明提供的拮抗菌F012基础培养基选择；

图17为不同培养基成分对拮抗菌F012生物量的影响；A：碳源优化；B：氮源优化；C、D：无机盐优化；

图18为不同浓度培养基成分对拮抗菌F012生物量的影响；A：碳源优化；B：氮源优化；C、D：无机盐优化；

图19为不同发酵条件对拮抗菌F012生物量的影响；A：温度优化；B：转速优化；C：PH优化；D：接种量优化；E：装瓶量优化；

图20为不同发酵条件组合对拮抗菌F012生物量的影响；A.装瓶量和接种量对拮抗菌F012生物量的影响；B.转速和接种量对拮抗菌F012生物量的影响；C.装瓶量和转速对拮抗菌F012生物量的影响；

图21为接抗菌F012培养基优化正交实验的因素水平趋势图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

本发明中，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株F012或被简称为拮抗菌F012。本发明所提供的拮抗菌F012，既可以发病前施加预防病害，也可以发病后施加治疗病害。下述实施例中培养基成分的浓度单位都为质量体积浓度。

实施例1拮抗菌F012菌株鉴定

实验室前期从山东省青岛市番茄灰霉病发病区的健康植株根系土壤中分离出的一株具有拮抗广谱性的菌株F012，保存于本实验室。对拮抗菌F012进行了形态学鉴定、生理生化鉴定以及分子生物学鉴定，确定其为解淀粉芽孢杆菌。

1.形态学鉴定

如图1所示，拮抗菌F012在LB固体培养基上菌落整体为不规则圆形；初期无色透明、表面光滑、湿润、粘稠、边缘整齐；后期为乳白色，表面干燥且有明显圆形凸起、边缘有褶皱产生、直径2～3mm。

2.生理生化鉴定

参考《常见细菌系统鉴定手册》，通过对耐盐促生菌菌株进行生理生化测定进行初步鉴定，鉴定结果如下：

表2拮抗菌F012生理生化鉴定

3.分子生物学鉴定

(1)16S rDNA的分子鉴定：

将菌株F012提取DNA并作为模板，16S rDNA通用上游引物为27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(序列表中的序列3)，下游引物为1492R:5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′(序列表中的序列4)，对16SrDNA核苷酸片段进行扩增，将扩增的片段直接进行序列测定。16S rDNA的PCR体系反应条件见表3。

表3 16S rDNA PCR体系反应条件

组分	使用量(μL)/管
		细菌组DNA	2
引物27f(10μmol/L)	1
		引物1492r(10μmol/L)	1
Taq DNA聚合酶	0.25
		dNTP(2.0mmol/L)	2
10×PCR buffer	2.5
		ddH<sub>2</sub>O	16.25
总体积	25

(2)gyrB基因的分子鉴定：

提取菌株拮抗菌F012的DNA并作为扩增模板，并以gyrB通用上游引物gyrB UP1(见序列表中序列5)和下游引物gyrB UP2(见序列表中序列6)对gyrB核苷酸片段进行扩增，将扩增的片段直接进行序列测定。

表4 gyrB PCR体系反应条件

组分	使用量(μL/管)
		细菌组DNA	2
引物UP1(10μmol/L)	1.5
		引物UP2(10μmol/L)	1.5
Taq DNA聚合酶	0.5
		dNTP(2.0mmol/L)	2
10×PCR buffer	2.5
		ddH<sub>2</sub>O	15
总体积	25

(3)实验结果及分析

将拮抗菌F012的16S rDNA和gyrB的测序结果分别依次见序列表中序列1和序列2，将该结果分别输入NCBI网站上的BLAST程序进行比对，结果显示：该菌株16SrDNA和gyrB核苷酸序列与GenBank基因库中芽孢杆菌属中的Bacillus amyloliquefaciens的同源度最高，因此鉴定为解淀粉芽孢杆菌。如图2-3和序列表2所示；通过DNAMAN6.0对Genbank中已有的芽孢杆菌属的16SrDNA序列进行遗传进化分析，结果显示，拮抗菌F012 16S rDNA与Bacillus amyloliquefaciens同源性最高，因此可以初步判定该菌株F012为芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌。

通过前述的形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析可知，该菌株为解淀粉芽孢杆菌，命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)F012，该菌株已于2021年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23371。

实施例2拮抗菌F012的功能定性鉴定

1.实验方法：

本实施例实验之前先将拮抗菌F012进行摇瓶培养，活化扩繁，配制NA固体培养基，准备好灭好菌的平板，培养基灭好菌之后等温度降到55摄氏度左右加入1ml活化好的拮抗菌F012，倒板，凝固后放到28℃培养箱培养24h。将青枯雷尔氏菌如上述步骤进行倒板，凝固后用打孔器对培养至长满拮抗菌F012的带菌培养基(培养基与菌的混合物)和未进行培养的带有青枯雷尔氏菌的带菌培养基分别进行打孔。将带青枯雷尔氏菌的培养基打出的菌饼(直径0.5cm)挑出，将带拮抗菌F012菌株的培养基菌饼挑至带青枯雷尔氏菌的培养基被打出的孔中，放置到28℃的培养箱中培养24h。对照平板不加拮抗菌F012菌饼。

以实验室前期筛选的另一株拮抗性优良的拮抗菌解淀粉芽孢杆菌F028(见申请号为202011568910.1中的专利公开文本)作为对照，实验方法同上。

抑菌能力评估标准：测定抑菌圈直径。

2、实验结果及分析：

如图4所示，拮抗菌F012对烟草青枯病菌的抑菌圈十分明显，抑菌圈直径可达31.33mm，远大于F028的抑菌圈直径。

实施例3拮抗菌F012的对多株病原真菌的拮抗性

1、实验方法：

将灭好菌的PDA培养基倒班，待凝固后在平板两侧距平板中心2cm的地方放置两个牛津杯，再次导入PDA培养基，待凝固后去出牛津杯，在平板中心接种病原真菌，两侧孔中加入2μL拮抗菌F012。对照平板不加菌液。28度条件下培养7d后测定抑菌圈直径并按照以下公式计算拮抗菌F012对各种病原菌的抑菌率。

抑菌率计算公式：抑菌率＝[(对照菌落直径-菌饼直径)-(处理菌落直径-菌饼直径)]/(对照菌落直径-菌饼直径)×100％。

表5拮抗菌抑菌广谱性

2、实验结果及分析

结果见表1、2，可知，拮抗菌F012具有优异的广谱抑菌性，对烟草青枯病菌、烟草黑胫病菌、烟草赤星病菌、葡萄白腐病菌、葡萄炭疽病菌、西瓜枯萎病菌、蚕白僵病菌、烟草根腐病菌、小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌和蚕豆枯萎病菌等多种不同病原菌都具有良好拮抗效果。其中，拮抗菌F012对番茄灰霉病的抑菌率最高，高达73.68％，对烟草青枯病的抑菌直径高达31.33mm。

实施例4拮抗菌F012对烟草青枯病的防治效果

1、实验方法：

将大小一致生长至四叶一心期的云烟87品种烟草移栽后缓苗10天，移入带有青枯病菌的土中继续生长。分为四个处理，分别为正常生长对照组、只接病原菌对照组、接病原菌和化学药剂(青枯灵)对照组以及接病原菌和拮抗菌F012处理。化学药剂和拮抗菌F012菌液十倍稀释液于第二次移栽时同时灌根100mL，并每隔7天灌根一次。其他处理与正常生长对照相同。二次移栽21天后拍照，记录数据。

2、实验结果及分析：

如图6所示，拮抗菌F012对烟草青枯病有良好的防治效果，并且其防治效果优于化学药剂青枯灵，F012的相对防效达58.33％，而化学药剂青枯灵处理组的相对防效仅达到33.33％。

实施例5拮抗菌F012对感染烟草青枯病的烟草幼苗根系发育的影响

1、实验方法：

本实施例中，将大小一致生长至四叶一心期的K326和NC55品种烟草移栽后缓苗7天，用浓度为1×10⁹的青枯病菌菌液和稀释十倍的拮抗菌F012菌液灌根。分为三个处理，分别为正常生长对照、只接病原菌对照以及接病原菌和拮抗菌F012处理。青枯病菌菌液与拮抗菌F012菌液十倍稀释液于移栽7天后同时灌根20mL，其他处理与正常生长对照相同。

2、实验结果：如图7、8所示，拮抗菌F012能大幅度地减弱烟草青枯病对烟草幼苗根系的破坏，对其根部发育起到较好的保护作用。

实施例6拮抗菌F012对烟草、辣椒和番茄生长的影响

1、实验方法：

选择烟草K326品种、辣椒超大2010品种以及番茄‘特大瑞光’品种进行育苗，培养3周，每周浇两次水，一次1500mL。幼苗出土后两周进行移苗，缓苗一周后进行处理。共两个处理，分别为正常生长处理和灌根拮抗菌F012菌液100倍稀释液，每周灌根一次，每次50mL。处理35d后测量各试验组和对照组植株的各种形态学参数，包括株高、茎粗、叶片数、叶绿素含量等并做统计学分析。

2、实验结果及分析：

如图9-15的结果说明，相对于对照组，进行拮抗菌F012的灌根处理的实验组的烟草、辣椒和番茄在株高、茎粗、叶片数、叶绿素含量等方面都得到大幅度的提高，尤其是对株高和茎粗的影响更大；显然，拮抗菌F012能显著促进烟草烟草等茄科植物的生长，在茄科经济作物的生产方面具有很好的应用前景。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

实施例7拮抗菌F012的发酵优化

(1)基础供试培养基的选择

A、实验方法：

初步筛选7种培养基作为拮抗菌F012基础培养基筛选的供试培养基。培养方法为：将种子液按2％接种量分别接种于装有100mL不同培养基的250mL锥形瓶中，28℃、140r/min条件下振荡培养，培养72h后检测拮抗菌F012的生物量，不同培养基重复3次。

7种供试基础培养基如下：

Ⅰ培养基：可溶性淀粉0.5％、比例为3:1的胰蛋白胨酵母粉混合氮源1.5％、NaCl0.1％、蒸馏水1000mL。

Ⅱ培养基：牛肉膏0.3％、蛋白胨1％、NaCl 0.5％、蒸馏水1000mL。

Ⅲ培养基：胰蛋白胨0.8％、酵母膏0.5％、蔗糖0.9％、蒸馏水1000mL。

Ⅳ培养基：蔗糖2％、酵母浸膏2％、牛肉膏1.5％、MgSO4·7H2O 0.06％、Fe SO4·7H2O 0.000 9％、蒸馏水1000mL。

Ⅴ培养基：葡萄糖8g、玉米粉15g、黄豆粉15g、蒸馏水1000mL。

Ⅵ培养基：麦芽糖8.0％、蛋白胨4.0％、MgSO4 0.08％、蒸馏水1000mL。

VII培养基：乳糖2.157％、复合氮源0.26％(蛋白胨：硫酸铵＝1：3)、硫酸锰0.021％、磷酸氢二钾0.015％、七水合硫酸镁0.012％、蒸馏水1000mL。

B、实验结果分析

从图16的实验结果可知，7种供试培养基中Ⅳ培养基和Ⅵ培养基更利于拮抗菌F012的生物量的提高，且无显著性差异，因此将Ⅳ培养基作为基础，进行后续培养基优化实验。

(2)拮抗菌F012的培养基成分优化

A.实验方法：

氮源优化：用蛋白胨、胰蛋白胨、尿素、硫酸铵、碳酸铵、硝酸铵和氯化铵分别替代基础培养基Ⅳ中的牛肉膏，其他成分不变，分别设置实验组，每处理3次重复。按照1％的接种量将种子液接种各处理后于28℃、140r/min条件下振荡培养72h，检测各处理F012的生物量。

碳源优化：用葡萄糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、甘露醇、甘油、柠檬酸和糊精替代基础培养基Ⅳ中的蔗糖，其他成分不变，分别设置实验组，每处理3次重复，后续实验同上。

无机盐优化：用氯化钠、氯化钙、碳酸钙、碳酸钠、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾替代基础培养基Ⅳ中的硫酸镁(浓度相同)，用硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰和氯化铁替代基础培养基中的硫酸亚铁(浓度相同)，其他成分不变，每处理3次重复。后续实验同上。

B、实验结果

如图17的实验结果所示，氮源中，以胰蛋白胨对生物量的增幅最大；碳源中，麦芽糖的效果优于其他碳源；而无机盐中，分别以硫酸镁、硫酸铜的效果最佳。

因此，经过培养基成分优化后的培养基成分为：酵母浸膏、胰蛋白胨、麦芽糖、硫酸镁、硫酸铜。基于Ⅳ培养基进一步确定的培养基为：酵母浸膏2％、胰蛋白胨1.5％、麦芽糖2％、MgSO₄·7H₂O 0.06％、CuSO₄·7H2O 0.000 9％。后续培养基优化实验是在此配方基础上进行开展的。

(3)拮抗菌F012培养基成分的含量优化

A、实验方法：

麦芽糖含量优化：将麦芽糖的质量体积浓度分别设置为1.8％、1.9％、2.0％、2.1％和2.2％，其他成分不变，每处理3次重复。按照1％的接种量接种各处理后，28℃，140r/min培养72h后，检测各处理的菌体含量和芽孢量。

胰蛋白胨含量优化：设置胰蛋白胨的质量体积浓度为1.1％、1.2％、1.3％、1.4％和1.5％，其他成分不变，每处理3次重复。后续实验同碳源优化。

硫酸镁含量优化：设置硫酸镁的质量体积浓度为0.06％、0.07％、0.08％、0.09％和0.1％，其他成分不变，每处理3次重复。后续实验同碳源优化。

硫酸铜含量优化：设置硫酸铜的质量体积浓度为0％和0.0009％，其他成分不变，每处理3次重复。后续实验同碳源优化。

B、实验结果

如图18所示，麦芽糖浓度为2.1％时，培养菌体的生物量最高；胰蛋白胨浓度为1.3％时，培养菌体的生物量最高；七水合硫酸镁浓度为0.09％时，培养菌体的生物量最高；五水合硫酸铜含量为0.0009％时，培养菌体的生物量更高。

(3)拮抗菌F012培养基正交设计

A、实验方法：

进行正交设计，选择三个影响较大的因素采用三因素三水平正交设计，实验设计具体见表6，筛选最佳培养基配方。

表6正交设计因素表

表7正交设计实验结果

注：K1、K2、K3的涵义：参加试验的因素取了几个水平后，每一个水平参与几次试验就会由他导致几个试验结果，把这些实验结果相加求出每一个因素，各个水平导致结果之和为K1、K2、K3：R为极差。

B、实验结果及分析：

为了探究F012最适培养基成分组合后的最佳含量，采用三因素三水平的培养基正交试验设计(表6和表7)进行实验。利用极差法对各因素不同水平对拮抗菌F012生物量进行了分析，得到图21的结果，根据该实验结果得到：最佳培养基组合为A₂B₂C₂，经验证培养基最佳组合为A₂B₂C₂，即麦芽糖2％、酵母浸膏2％、胰蛋白胨1.2％、Mg SO4·7H₂O 0.1％、CuSO4·7H₂O 0.0009％。因此，拮抗菌F012的最佳培养基配方为麦芽糖2％、酵母浸膏2％、胰蛋白胨1.2％、MgSO4·7H₂O 0.1％、CuSO4·7H₂O 0.0009％、蒸馏水1000mL。该培养基的效果最佳。

(4)拮抗菌F012的发酵条件优化

温度优化：设置24℃、26℃、28℃、30℃和32℃不同温度处理。

转速优化：设置80r/min、100r/min、120r/min、140r/min和160r/min不同转速处理，每处理3次重复。后续实验同培养时间优化。

pH优化：设置pH 5、pH 6、pH 7、pH 8和pH 9不同pH处理，每处理3次重复。后续实验同培养时间优化。

接种量优化：设置1％、2％、3％、4％和5％不同接种量处理。

装瓶量优化：设置20％、30％、40％、50％、60％和70％不同装瓶量处理。

实验结果：

如图19所示，培养的温度为28℃时，培养菌体的生物量最高；PH值为7时，培养菌体的生物量最高；接种量为2％时，培养菌体的生物量最高；转速为140r/min，培养效果最好；装瓶量为30％时，培养菌体的生物量最高。(5)拮抗菌F028发酵条件响应面优化

A、实验方法

根据Plackett-Burman中心组合实验设计原理，选择三个影响较大因素采用三因素三水平响应面优化，实验组设计参照表8。

通过上述拮抗菌F012的发酵条件优化试验，我们筛选出三个对F012生物量影响最大的因素，接种量、转速和装瓶量。为接种量、转速和装瓶量三个因素之间的相互作用及对F012生物量的影响，采用三因素三水平的响应面试验设计(见表8和表9)。

表8拮抗菌F012响应面设计因素水平

表9拮抗菌F012响应面设计实验

表10响应面设计方差分析

(2)实验结果及分析

根据上述检测的生物量试验结果，利用minitab 15进行数据分析，其中失拟值为0.123，模型不失拟，说明拟合效果尚可。上述模型方程中的3个因素及其相互作用对响应值的影响可通过响应面图直观反映出来，从图中可知响应值存在最大值。通过Minitab 15进一步分析得到菌体含量最大值时对应的接种量为2％，转速为140r/min，装瓶量为30％，这是拮抗菌F012优化的发酵条件。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一株具广谱拮抗性的解淀粉芽孢杆菌、其微生物菌剂及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1825

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌F012的16S rDNA(16S rDNA of Bacillus amyloliquefaciensF012)

<400> 1

gcccgtgggc gggtgctata catgcagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg 60

ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg 120

ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtc tgaaccgcat ggttcagaca taaaaggtgg 180

cttcggctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240

caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300

acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360

acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga 420

agaacaagtg ccgttcaaat agggcggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 480

taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg 540

gcgtaaaggg ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg 600

gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta 660

gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt 720

aactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca 780

cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaac 840

gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg 900

gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960

ggtcttgaca tcctctgaca atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg cagagtgaca 1020

ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggtatcgtc accactggga 1080

ctgagacaca ccagactcta cggaggcagc agtagggatc tcgcatgaac gaaagtcgac 1140

gagcacgccg cgtgagtgat gagattttcg gatcgtaaag ctctgttgta gggaagaaca 1200

agtgccgttc aaatagggcg gcaccttgac ggtacctaac ccagaaagcc acggctaact 1260

acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta 1320

aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg 1380

tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt 1440

gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc gactctctgg tctgtaactg 1500

acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 1560

taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt 1620

aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc 1680

cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct 1740

tgacatcctc tgacaatcct agagatagga cgtccccttc gggggcagag tgacaggtgg 1800

tgcatggttg tcgtcagctc gtgtc 1825

<210> 2

<211> 1377

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌F012的gyrB基因( gene gyrB of Bacillus amyloliquefaciensF012)

<400> 2

accgggggaa agcggggata taaagtatcc gggcggtctt cacggtgtag gggcatccgt 60

cgtaaacgcc ttgtcgacca ctcttgacgt tacggttcat cgtgacggaa aaatccatta 120

tcaggcgtac gagcgcggtg tacctgtggc cgatcttgaa gtgatcggcg aaactgataa 180

gaccggaacg attacgcact tcgttccgga cccggaaatt ttcaaagaaa caactgtata 240

tgactatgat ctgctttcaa accgtgtccg ggaattggcc ttcctgacaa aaggcgtaaa 300

catcacgatt gaagacaaac gtgaaggaca agaacggaaa aacgagtacc actacgaagg 360

cggaatcaaa agctatgttg agtacttaaa ccgttccaaa gaagtcgttc atgaagagcc 420

gatttatatc gaaggcgaga aagacggcat aacggttgaa gttgcattgc aatacaacga 480

cagctataca agcaatattt attctttcac aaataatatc aacacatacg aaggcggcac 540

gcacgaggcc ggatttaaaa ccggtctgac ccgtgtcata aacgactatg caagaagaaa 600

agggattttc aaagaaaatg atccgaattt aagcggggat gatgtgagag aagggctgac 660

tgccattatt tcaattaagc accctgatcc gcaattcgaa gggcagacga aaaccaagct 720

cggcaactcc gaagcgagaa cgatcactga tacgctgttt tgcgtcgtac ctggtggcct 780

gattcttgaa gtgaatcggc gaacctgata aagaccggga acgatacgca cttcgatccg 840

gacccggcaa ttttcaaaga aacaactgta tatgactatg atctgctttc aaaccgtgtc 900

cgggaattgg ccttcctgac aaaaaggcgt aaacatcacg attgaagaca aacgtgaagg 960

acaagaacgg aaaacgagta ccactacgaa ggcggaatca aaagctatgt tgagtactta 1020

aaccgttcca aagaagtcgt tcatgaagag ccgatttata tcgaaggcga gaaagacggc 1080

ataacggttg aagttgcatt gcaatacaac gacagctata caagcaatat ttattctttc 1140

acaaataata tcaacacata cgaaggcggc acgcacgagg ccggatttaa aaccggtctg 1200

acccgtgtca taaacgacta tgcaagaaga aaagggattt tcaaagaaaa tgatccgaat 1260

ttaagcgggg atgatgtgag agaagggctg actgccatta tttcaattaa gcaccctgat 1320

ccgcaattcg aagggcagac gaaaaccaag ctcggcaact ccgaagcgag aacgatc 1377

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 27F(人工序列27F)

<400> 3

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 1492R(人工序列1492R)

<400> 4

tacggttacc ttgttacgac tt 22

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> gyrB UP1(人工序列gyrB UP1)

<400> 5

gaagtcatca tgaccgttct gcaygcnggn ggnaarttyg a 41

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> gyrB UP2(人工序列gyrB UP2)

<400> 6

agcagggtac gcatgtgcga gccrtcnacr tcngcrtcng tcat 44

Claims (6)

1.一株具广谱拮抗性的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，该菌株被命名为解淀粉芽孢杆菌F012，其保藏号为CGMCC No.23371。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌。

3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌F012的菌液、菌体或芽孢。

4.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌和如权利要求2所述的微生物菌剂在防治植物病害、促进烟草、番茄和辣椒生长方面的应用，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌和所述微生物菌剂用于防治以下病原菌：烟草青枯病菌、烟草黑胫病菌、烟草赤星病菌、葡萄白腐病菌、葡萄炭疽病菌、西瓜枯萎病菌、蚕白僵病菌、烟草根腐病菌、小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌和蚕豆枯萎病菌。

5.一种如权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

从固体培养基平板上挑取拮抗菌F012单菌落制备种子液，然后将种子液接种于液体培养基中，培养温度为27-30℃，液体培养基的pH值为6.5-7.5，接种量1-5%，发酵转速100-180r/min，装瓶量20-40%，培养48-80h，待菌株生长至平稳期时，稀释菌液，获得所述微生物液体菌剂，或者进一步加工处理得到菌体冻干粉。

6.根据权利要求5所示的制备方法，其特征在于，所述培养基包括以下质量体积浓度的各组分：麦芽糖1%-3%、酵母浸膏 1%-3%、胰蛋白胨0.5%-1.5%、Mg SO₄⋅7H₂O 0.05%-0.2%、CuSO₄⋅7H₂O 0.0001%-0.001%。

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