CN105420156B

CN105420156B - 一株具有解磷防病促生作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN105420156B
Application number: CN201510951098.3A
Authority: CN
Inventors: 胡艳晖; 其他发明人请求不公开姓名
Original assignee: Foshan Yanhui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Foshan Yanhui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2015-12-19
Filing date: 2015-12-19
Publication date: 2018-06-29
Anticipated expiration: 2035-12-19
Also published as: CN105420156A

Abstract

本发明所涉及的一株解淀粉芽孢杆菌具有较强的解磷及促进植物生长的作用，且对多种植物病害有较好的防治效果。本发明的解磷防病促生作用的解淀粉芽孢杆菌JCD‑H‑12，保藏编号为CGMCC NO.11856，保藏日期：2015年12月10日，具有解磷，防病促生，增产提质，抑菌谱广等多重功效，本发明菌株及其菌剂能有效防治白粉病，烟草黑胫病，灰霉病，水稻稻瘟病，黄瓜枯萎病、番茄早疫病、甜椒炭疽病、西瓜菌核病、小麦赤霉病、西瓜枯萎病、辣椒疫霉病菌等，广谱抗菌并且效果稳定持久，可开发为集解磷与防治病害一体的菌肥与微生物农药制剂。

Description

一株具有解磷防病促生作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物农药与微生物肥料技术领域，具体是涉及一种具有解磷防病促生作用的解淀粉芽孢杆菌JCD-H-12。

背景技术

地壳中磷的平均含量约为 0.122%，在土壤形成过程中，磷有一定程度的迁移，随着成土过程的进行，土壤磷含量也降低。我国大部分土壤磷含量在 0.043%-0.046%之间，因而在土壤中，磷含量是比较缺乏。由于磷是植物生长发育所必需的 16 种营养元素之一，作物主要以磷酸根等化学形态吸收磷素，而土壤中的磷主要以固定态的矿物质状态存在，约占全磷含量的 70%左右，所以土壤中水溶性的无机磷酸根离子的含量高低在植物磷素营养供应中起着重要作用。南方土壤绝大多数偏酸性，一般全磷含量低于 0.04%，其中 80%以上磷为难溶状态，土壤质地多以原生矿物形态存在，少数以磷酸铝铁矿物态存在，还有一部分磷为有机磷，多以有机化合物形态如磷脂等形式存在，在一般情况下，难以直接被植物吸收利用，只有在长期的风化过程或者在适宜的条件下，这些磷酸盐通过土壤微生物的活化作用逐步转化为水溶态，才能被作物吸收利用。我国现有 1.24 亿 hm2耕地中，有 0.81 亿hm2缺磷，约占总耕地面积的 60%以上，现在的种植模式大多采用直接施用无机磷肥来满足作物对磷素的需求，由于施入的磷肥的有效作用形式为磷酸根，在土壤中极易与碱性土壤中的钙盐和酸性土壤中的铁、铝等离子发生反应，被土壤中胶体物质所固定，从而转化成无效态，最终以难溶性磷酸盐或吸附态形式固定于土壤中，因而植物难以直接吸收利用，所以磷肥的利用率很低，一般低于 20%，为了提高磷肥的利用率，减少磷肥的投入，很多农业及肥料科研工作者采用了很多方法提高磷肥的利用率，但效果不佳，其中利用解磷微生物对土壤磷的分解，是提高土壤磷有效化利用的重要途径之一。对于解磷的芽孢杆菌主要集中在巨大芽孢杆菌，而对于解淀粉芽孢杆菌，也只有王华平在专利201410095857.6中公开了一株解淀粉芽孢杆菌ZH1能利用难溶性磷酸盐为磷源进行生长，提高肥料的利用率，促进植物根系发育和对肥料的吸收，增加土壤有效磷含量。

近年来，农业生产中，作物的青枯病，烟草黑胫病，西瓜枯萎病，水稻稻瘟病，水稻纹枯病，草莓白粉病，黄瓜枯萎病等病害发病严重，针对这些病害，目前的农药在安全，有效，残留方面，都存在一定的问题。随着人们对环境保护和食品安全要求的提高，微生物农药受到广泛重视。但是，现有技术中的微生物农药，抑菌谱范围较小，抑菌效果不理想。作为微生物农药杀菌剂，解淀粉芽孢杆菌已经有较多的研究，如：乔俊卿等在专利号201310033269.5中公开了一种解淀粉芽孢杆菌FQS38可以防治番茄青枯病；朱天辉在专利号201310494832.9中公开了一种解淀粉芽孢杆菌Ba4能够有效防油橄榄果实腐烂病。牛赡光等在专利号201210410752.6中公开了一种解淀粉芽孢杆菌SDF-005能用于防核桃炭疽病；张淑梅等在专利号201010264520.5中公开了一株解淀粉芽孢杆菌TF27，该菌株能在植物体内定殖，繁殖和传导，可同时产生抗菌蛋白和脂肽类抗生素两种抗菌物质，具有防病促生，增产提质，抑菌谱广等多重功效。但还未有报道既具有解磷作用又具有防治青枯病，烟草黑胫病，西瓜枯萎病，水稻稻瘟病，水稻纹枯病，草莓白粉病，黄瓜枯萎病等病害的解淀粉芽孢杆菌。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有解磷防病促生作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用，可以作为解磷菌肥也具有防治多种土传病害与叶类病害的微生物农药。且对多种植物病害有较好的防治效果。

本发明的解磷防病促生作用的解淀粉芽孢杆菌JCD-H-12（Bacillusamyloliquefaciens），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.11856 ，保藏日期：2015年12月10日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，具有解磷，防病促生，增产提质，抑菌谱广等多重功效，本发明菌株及其菌剂能有效防治白粉病，烟草黑胫病，灰霉病，水稻稻瘟病，黄瓜枯萎病、番茄早疫病、甜椒炭疽病、西瓜菌核病、小麦赤霉病、西瓜枯萎病、辣椒疫霉病菌等，广谱抗菌并且效果稳定持久，具有开发集解磷与防治病害一体的菌肥与微生物农药制剂。

本发明的另一个目的是提供解磷防病促生解淀粉芽孢杆菌JCD-H-12的应用包含以下步骤：一、取出菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，33℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种50毫升LB培养基中，在培养箱中33℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至装液量为2L LB培养基的5L大三角瓶中， 33℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过20亿/毫升，即可作为解淀粉芽孢杆菌液体菌种；

二、将步骤一培养的解淀粉芽孢杆菌液体菌种作为种子，接种至600L发酵培养基，接种量为10%，开搅拌120r/min，每分钟通气量液气比1：0.8，33℃培养24-36小时，待芽孢含量不低于50亿/毫升，即可结束发酵，无菌灌装得到成品解淀粉芽孢杆菌菌剂；

三、对于土传病害，将步骤二制备的解淀粉芽孢杆菌菌剂稀释500-1000倍后采用灌根的方法进行防治，在移栽时和发病初期用药，总用药量为1公斤/亩；

四、对于叶部病害，将步骤二制备的菌剂稀释300-500倍采用喷雾的方法进行防治，在发病初期开始用药，每隔7天使用一次，共3-5次；

其中所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；

其中所述发酵培养基：麸皮20 g/L，葡萄糖10g/L，可溶性淀粉30 g/L，玉米浆8g/L，鱼粉5 g/L，硫酸镁0.3 g/L，硫酸锰0.2 g/L，磷酸二氢钠0.5 g/L，磷酸氢二钠2.3 g/L，pH7.2。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

其中，所述的土传病害为烟草黑胫病，西瓜枯萎病，黄瓜枯萎病，腐霉菌、黑白轮枝、肥大型桑椹菌核、苍兰根腐、番茄白绢等；

其中，所述的叶部病害为水稻稻瘟病、草莓白粉病、禾谷镰孢、黄瓜黑星、兰花炭疽、冬瓜炭疽、花柄链格孢、辣椒早疫病菌、黄瓜褐斑、长柄链格孢、烟草赤星链格孢、西瓜炭疽、棉花炭疽、白菜炭疽、芦荟炭疽、珊瑚炭疽、龙须草炭疽、甜瓜灰霉、甜瓜果腐、黄瓜黑斑、德氏霉菌、烟草赤星病等。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明

实施例1：具有解磷作用的芽孢杆菌的分离

从湖南，昌平，河北，辽宁等地分离到 167 株芽孢杆菌，其中101 株具有解磷活性，从中

筛选解磷强度高的菌株18株。通过测定 18 株芽孢杆菌摇瓶发酵液中水溶液磷，确定了各菌株对无机磷、有机磷的分解能力，如表1，从结果可以看出，解无机磷与解有机磷不是正相关的，综合了解有机磷与无机磷的结果，我们确定其中五株JCD-H-12、JCD-H-16、JCD-Q-3、JCD-L-4、JCD-L-16具有较强的解磷作用的菌株。利用下面两种植有机磷与无机磷细菌培养基进行培养48小时检测供试菌株在水溶性中解磷的性能。

解无机磷活性培养基（g/L）：(NH4)2SO40.5，MgSO4·7 H2O 0.5，NaCl 0.2，Ca3(PO4)210.0，CaCO30.5，葡萄糖 2.0，MnSO40.02，FeSO40.02，蒸馏水 1000 mL，pH7.2。

解有机磷活性培养基（g/L）：(NH4)2SO40.5，MgSO4·7 H2O 0.5，NaCl 0.2，CaCO30.5，葡萄糖 2.0，MnSO40.02，FeSO40.02，卵磷脂 0.2，蒸馏水 1000 mL。

采用钼锑抗比色法进行供试菌株培养液中水溶性磷含量的测定，确定该芽孢杆菌菌株解磷能力。

表1各菌在培养液中解磷能力

实施例2 具有较强解磷作用的芽孢杆菌的抗菌试验的筛选

将JCD-H-12、JCD-H-16、JCD-Q-3、JCD-L-4、JCD-L-16在腐霉菌（Phythium spp.）、

水稻稻瘟病（Pyriculavia oryzae cav.）、辣椒早疫病菌（Alternaria solanipepper）、蕃茄青枯病（Psevdomonas solanacearum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、白粉病菌（Erisyphe spp.）、烟草黑胫病（Phytophthora parasitica var.nicotianae）、草莓灰霉菌（Botrytis cinera Pers.ex Fr.）等病原微生物平板上划“十字”，28℃恒温培养72小时后，观察是否具有抑菌圈，结果见下表2，“+”代表有抑菌圈，“-”代表无明显抑菌圈。从表2可以看出JCD-H-12具有更广的抑菌能力，下面以此菌为研究目的菌。

表2 较强解磷作用的芽孢杆菌的抗菌试验结果

实施例3 解淀粉芽孢杆菌JCD-H-12的鉴定与广谱抗生特性试验

通过生理生化试验，革兰氏阳性菌，杆状，内生芽孢，无鞭毛；在牛肉蛋白胨培养基上形成乳白色菌落，表面光滑，边缘不整齐。葡萄糖发酵试样阳性，淀粉水解试验阳性，明胶液化试验阳性，V.P反应阳性，接触酶反应阳性，甲基红反应阳性，硝酸盐还原试验阳性，柠檬酸盐利用阳性，好氧生长，最适PH为6-8.5，生长温度为28-38℃，通过16s rDNA鉴定为解淀粉芽孢杆菌。

将JCD-H-12取一环活化菌液十字划线于PDA平板上，在距接种线3cm处接种病原菌，28℃培养7d，测量抑菌带宽度，试验结果如下表3。

表3 JCD-H-12对各种病原菌的抑制效果

实例4 解淀粉芽孢杆菌JCD-H-12的培养液的获得

取出菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，33℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种50毫升LB培养基中，在培养箱中33℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至5L大三角瓶中（装液量为2L，LB培养基），33℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过20亿/毫升，即可作为解淀粉芽孢杆菌液体菌种接种至600L发酵培养基，接种量为10%，开搅拌120r/min，通气量1：0.8(液/气)，33℃培养16-24小时，待芽孢含量不低于50亿/毫升，即可结束发酵，无菌灌装得到成品。其中所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%。其中所述发酵培养基：麸皮20g/L，葡萄糖10g/L，可溶性淀粉30 g/L，玉米浆8 g/L，鱼粉5 g/L，硫酸镁0.3 g/L，硫酸锰0.2 g/L，磷酸二氢钠0.5 g/L，磷酸氢二钠2.3 g/L，pH7.2。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。

实例5 利用解淀粉芽孢杆菌剂JCD-H-12在田间对植物病害的防治作用

利用发酵好的菌剂分别对烟草黑胫病，西瓜枯萎病，水稻稻瘟病，草莓白粉病，黄瓜枯萎病等病害的作物，进行了初步的田间药效试验。对于根部病害（如烟草黑胫病，西瓜枯萎病，黄瓜枯萎病等），将菌剂稀释500-1000倍后采用灌根的方法进行防治（在移栽时和发病初期用药），总用药量为1公斤/亩。观察并统计作物的发病率或病指。灌根产生的具体效果见表，其中空白是指作物不采取任何防治措施。对于叶部病害（如水稻稻瘟病，草莓白粉病等），将菌剂稀释300-500倍采用喷雾的方法进行防治，在发病初期开始用药，每隔7天使用一次，共3-5次。观察并统计作物的发病率或病指。喷雾达到的效果见表4，其中空白是指作物不采取任何防治措施。

表4 JCD-H-12在田间对各类病害的防治效果

实施例6利用解淀粉芽孢杆菌JCD-H-12在草莓上试验效果

1．试验地点：湖南省隆回县桃洪镇某种植户

2．试验方法：在定植期，将苗栽好，用解淀粉芽孢杆菌菌剂800倍稀释液灌根1次，在草莓生长期间，叶面喷施1：500倍解淀粉芽孢杆菌菌剂，10d（天）1次，连喷3次；施肥与对照组相同，对照组以灌根与叶面喷施以清水同时施用；

3．试验结果：

结果发现，提前开花结果,果实大而饱满,结果数多,异形果少,口感好,着色鲜亮，草莓（丰香）的单株产量平均为129.8g，较对照提高16.05％而且喷用解淀粉芽孢杆菌菌剂后草莓果实的可溶性固形物含量达10.52％，较对照相对高12.8％，同时，施用菌剂后，酸含量降低，Vc含量提高，果实的风味和品质得到明显改善，并且耐储存,比不使用菌肥的草莓多储存10天以上。使用解淀粉芽孢杆菌菌剂的地块比对照区提高产量28%，糖度比对照区提高1-2度。草莓根部肥壮,消灭了草莓的白粉病和根腐病。

使用解淀粉芽孢杆菌菌剂结果表明其对重茬、立枯、青枯、根腐等各种病害有显著效果，抗多种植物病原真菌，有效预防草莓因杂菌引起的死株，增强植株抗病性；促进植株根系发达、叶片增厚变绿、增长增大果实。修复土壤生态，对碱土、黑土有活化、保墒和改良作用，对药害、肥害而引起的僵苗、花打顶、瓜打顶、畸形果、小叶、黄叶、卷叶、老花叶等病害有显著防治效果。提高产量，延长保鲜期。

实施例7 利用解淀粉芽孢杆菌剂JCD-H-12在烤烟中作为药肥的效果

1．试验地点：湖南省隆回县滩头镇狮子村某农户种植地

2．试验方法：烤烟品种：中烟99-10-1，共设 2 个处理，4 次重复。试验面积 16亩，外设保护行。试验组：解淀粉芽孢菌剂+ 70% 常规烤烟专用基肥(N-P2O5-K2O=10-10-25)即28公斤烤烟专用肥；解淀粉芽孢菌剂的亩用量为 4 公斤：烤烟移栽苗时，用解淀粉芽孢杆菌剂800倍液灌根与沾根各一次；缓苗后20天用解淀粉芽孢杆菌剂1000倍液灌第二次，然后连续每隔20天喷施第三次和第四次。CK(对照)：常规烤烟专用基肥，烤烟专用基肥的用量为 40 公斤/亩，施肥方法为底施，与试验组同时用清水灌根；

3．试验结果：

由于狮子村的土地已经连续三年都种植烤烟，尽管每年也种一季晚稻，但其青枯病与黑胫病发病率较高且比较严重，试验组施用解淀粉芽孢菌剂后, 株高、茎围、节距、有效叶数、最大叶面积均大于对照组，说明减少70%的复合肥的情况解淀粉芽孢杆菌可以有效改善烟株的农艺性状，促进烟株健壮生长。从表5可以看出，施用的解淀芽孢杆菌剂的烟株青枯病与黑胫病发病率很低，且发病程度显著降低，而对照组则有明显的青枯病与黑胫病，使用链霉素与50%敌克松可湿性粉剂后也明显存在病害。

表5 施用解淀粉芽孢杆菌作为药肥对大田烟草对黑胫病与青枯病的防治效果

表6解淀粉芽孢杆菌剂对烟草产量产值增收效果

处理	产量（公斤/亩）	产值（元/亩）	均价（元/公斤）
				对照区	186.2	2550.9	13.74
试验组	246.6	3763.1	15.26

施用解淀粉芽孢菌剂后烟草提早成熟、提高品质，很大程度上提高烟叶的产量、均价、产值、上中等烟比例。从表6可以分析得出，试验示范区烟叶产量、产值、均价分别比对照区域高出60.4公斤/亩、1212.2元/亩、1.52元/公斤。减去增加的成本440元（其中人工360元），可净增772.2元/亩。

Claims

1.一株具有解磷防病促生作用的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JCD-H-12,该菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNO.11856保藏日期为2015年12月10日。

2.根据权利要求1所述的一株具有解磷防病促生作用的解淀粉芽孢杆菌的应用，其特征在于解磷防病促生解淀粉芽孢杆菌的应用包含以下步骤：一、取出菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，33℃培养48小时；在平板上挑取单个菌落接种至50毫升LB培养基中，在培养箱中33℃震荡培养24小时作为种子；种子采用5%的接种量，接种至装液量为2LLB培养基的5L大三角瓶中， 33℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过20亿/毫升，即可作为解淀粉芽孢杆菌液体菌种；

二、将步骤一培养的解淀粉芽孢杆菌液体菌种接种至600L发酵培养基，接种量为10%，搅拌速度为120r/min，每分钟通气量液气比1：0.8，33℃培养24-36小时，待芽孢含量不低于50亿/毫升，即可结束发酵，无菌灌装得到成品解淀粉芽孢杆菌菌剂；

其中，所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；

其中，所述发酵培养基：麸皮20 g/L，葡萄糖10g/L，可溶性淀粉30 g/L，玉米浆8 g/L，鱼粉5 g/L，硫酸镁0.3 g/L，硫酸锰0.2 g/L，磷酸二氢钠0.5 g/L，磷酸氢二钠2.3 g/L，pH7.2；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

其中，所述的土传病害为烟草黑胫病，西瓜枯萎病，黄瓜枯萎病，腐霉菌、黑白轮枝、肥大型桑椹菌核、苍兰根腐、番茄白绢；

其中，所述的叶部病害为水稻稻瘟病、草莓白粉病、禾谷镰孢、黄瓜黑星、兰花炭疽、冬瓜炭疽、花柄链格孢、辣椒早疫病菌、黄瓜褐斑、长柄链格孢、烟草赤星链格孢、西瓜炭疽、棉花炭疽、白菜炭疽、芦荟炭疽、珊瑚炭疽、龙须草炭疽、甜瓜灰霉、甜瓜果腐、黄瓜黑斑、德氏霉菌、烟草赤星病。