CN109402027B

CN109402027B - 一株具有抑制西瓜专化型尖孢镰刀菌作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用

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Publication number: CN109402027B
Application number: CN201811536231.9A
Authority: CN
Inventors: 徐伟慧; 王志刚; 王恒煦; 吕智航; 史一然
Original assignee: Qiqihar University
Current assignee: Zhongke Liyuan Environmental Technology Co ltd
Priority date: 2018-12-14
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2038-12-14
Also published as: CN109402027A

Abstract

本发明公开了一株具有抑制西瓜专化型尖孢镰刀菌作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用。西瓜专化型尖孢镰刀菌(FON)是西瓜枯萎病的病原菌，生物防治是控制西瓜枯萎病的重要手段。本发明从小麦根际筛选到一株抑制FON的菌株，经鉴定为Bacillus amyloliquefaciens LZN01。试验结果表明，Bacillus amyloliquefaciens LZN01对FON的抑菌率为57.07％，对FON孢子萌发抑制率为86.21％。在‑20℃～60℃和pH值在4～9之间，Bacillus amyloliquefaciens LZN01的发酵上清液抑菌效果稳定，其上清液的抑菌物质含有Myriocin、Sphingofungin E、Sphingofungin F、Sphingofungin C、Gabapentin。因此，Bacillus amyloliquefaciens LZN01对FON具有较好的抑制能力，且抑菌效果稳定，在西瓜枯萎病生物防治方面具有较大开发和应用价值。

Description

一株具有抑制西瓜专化型尖孢镰刀菌作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其应用，特别涉及一种具有抑制西瓜专化型尖孢镰刀菌(FON)作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用。本发明属于农业生物技术领域。

背景技术

西瓜在世界园艺生产中占有重要位置，中国是西瓜生产和消费的第一大国，年种植面积200万hm²，年产量约为7000余万吨(黄春艳等，2016)。西瓜枯萎病是限制西瓜生产的重要因素之一，其致病菌是西瓜专化型尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum，FON)(于天祥，2004)。随着西瓜种植面积的逐年扩大，连作重茬导致病原基数升高，加重了西瓜枯萎病的发生。探究有效防治西瓜枯萎病的方法，已经成为当今西瓜生产上亟需解决的问题(任迁琪，2016)。

近年来，针对西瓜枯萎病的防治，国内外学者已经做了大量研究。1902年，由美国的Orten最早采用抗性育种方法成功育出有效防治西瓜枯萎病的抗性品种Conquero，并证明其抗性的可遗传性(孔庆国，2001)。目前，我国培育的抗病品种主要有西农8号、京抗1号、秀丽等(丁建成等，2005)，但由于西瓜遗传多样性极低，因此可被选育的抗病种质资源非常有限，而且常规育种周期长，进度慢，技术难度系数高，所育出的抗病品种只是相对抗病，生命力不强，易受周围环境的影响(王万成，2008)，无法从根本上解决问题；化学药剂对西瓜枯萎病防治能够起到显著效果(严蕾艳等，2016)，但其所产生的药物残留造成环境污染，伤害非靶标生物，甚至破坏生态平衡，严重制约西瓜产业的绿色发展；利用葫芦、冬瓜等植物的根类进行嫁接栽培对防治西瓜枯萎病的治理有很好的效果并得到广泛应用(Sakata etal.,2007)，但工作量大，影响果实的口感和品质；物理防治西瓜枯萎病能够起到一定的防治效果，但工作量较大，耗工耗时(孙义春等，2005)。

基于以上防治措施存在的问题，生物防治是目前最有效且安全的防治手段，利用有益微生物或拮抗微生物抑制FON的生长，降低土壤中该病菌的数量，从而控制枯萎病病害的发生。

发明内容

本发明的目的在于筛选一株FON的拮抗菌株，研究其发酵上清液的稳定性和抑菌效应，为后续生防菌剂的生产应用和贮存提供技术手段。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明从小麦根际筛选到一株抑制FON的菌株，经鉴定为Bacillusamyloliquefaciens LZN01。本发明研究了Bacillus amyloliquefaciens LZN01对FON的抑制效应。试验结果表明，Bacillus amyloliquefaciens LZN01对FON的抑菌率为57.07％；FON孢子悬液与解淀粉芽孢杆菌LZN01发酵上清液按1:1比例混合培养6h、12h和24h，孢子萌发抑制率分别为86.21％、67.50％和56.04％，抑制率随时间的增加呈下降趋势；经Bacillus amyloliquefaciens LZN01发酵上清液处理，通过扫描电镜观察发现FON菌丝末端膨大畸变，菌丝和孢子表面严重受损；温度在-20℃～60℃和pH值在4～9之间，Bacillusamyloliquefaciens LZN01的发酵上清液抑菌效果稳定，其上清液的抑菌物质含有Myriocin、Sphingofungin E、Sphingofungin F、Sphingofungin C、Gabapentin。因此，Bacillus amyloliquefaciens LZN01对FON具有较好的抑制能力，且抑菌效果稳定，在西瓜枯萎病生物防治方面具有较大开发和应用价值。

本发明分离得到的一株具有抑制西瓜专化型尖孢镰刀菌作用的解淀粉芽孢杆菌，命名为Bacillus amyloliquefaciens LZN01，分类命名为Bacillus amyloliquefaciensLZN01，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在中国.武汉.武汉大学，其菌种保藏编号为CCTCC NO.M 2018725，保藏时间为2018年10月29日。

进一步的，本发明还提出了所述的解淀粉芽孢杆菌LZN01在抑制西瓜专化型尖孢镰刀菌中的应用。以及

所述的解淀粉芽孢杆菌LZN01在防治西瓜枯萎病中的应用。

更进一步，本发明还提出了一种所述的解淀粉芽孢杆菌的发酵方法，包括以下步骤：

将本发明所述的Bacillus amyloliquefaciens LZN01菌体接入LB液体培养基中，置于30℃，200r/min震荡培养10-14h，制成种子液；再将种子液接种于LB液体培养基中，30℃，200r/min震荡培养40-50h后，在10000r/min、4℃的条件下离心10-20min，取上清液，再将上清液用0.22μm过滤器过滤，即得发酵上清液。

再进一步的，本发明还提出了所述的发酵方法制备得到的解淀粉芽孢杆菌的发酵上清液。

其中，优选的，所述的发酵上清液中含有Myriocin、Sphingofungin E、Sphingofungin F、Sphingofungin C以及Gabapentin等抑菌成分。

最后，本发明还提出了所述的发酵上清液在抑制西瓜专化型尖孢镰刀菌中的应用。以及

所述的发酵上清液在防治西瓜枯萎病中的应用。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1、本发明从小麦根际中分离得到一株对FON生长具有很强抑制作用的菌株，经鉴定为Bacillus amyloliquefaciens LZN01。目前国内外的拮抗菌株对尖孢镰刀菌的抑制率较低，其中对香蕉枯萎病菌的抑制率为41％(Nel et al.,2007)，拮抗细菌对棉花枯萎病菌的抑制率为32％(游春平等，2005)；解淀粉芽孢杆菌HAB-7对芒果炭疽菌的抑制率为52.03％(刘文波等，2017)，解淀粉芽孢杆菌对西瓜枯萎病的防治效果为48.78％(康金磊等，2016)。与前人研究结果相比，本发明分离得到的Bacillus amyloliquefaciens LZN01对FON菌丝生长的最高抑菌率为57.07％，对孢子的萌发抑制率为86.21％，抑菌效果显著，具有很大的开发和应用价值。

2、采用超高效液相色谱-双分压线性阱-静电场轨道阱串联质谱仪分析菌株LZN01上清液的抑菌成分，同时对部分差异成分进行了抑菌性试验，发现低浓度和高浓度的myriocin都有抑制FON的效果，而Gabapentin低浓度没有抑菌效果。Myriocin首次被Kluepfel et al.(1972)报道，分离于Myriococcum albomyces；Melanconis flavovirens,Isaria sinclairii和Paecilomyces variotii ATCC 74097也分泌myriocin(Pereira1etal.,2015)。鞘磷脂是真核细胞膜中普遍存在的组成部分，在质膜中尤为丰富，鞘脂类和它们的代谢物调控各种细胞事件包括繁殖、变异和细胞凋亡，丝氨酸棕榈酰转移酶催化所有鞘脂类合成的第一步(Akiko et al.,2005)，Myriocin是一种丝氨酸棕榈酰转移酶的抑制剂，抑制鞘脂类的合成(Lee et al.,2012),使丝氨酸棕榈酰转移酶失活阻止Aspergillusnidulans孢子萌发的极性生长(Cheng et al.,2011)，降低烟曲霉生物膜的生物量，减少顶端菌丝的生长(Riquelme,2013)，被myriocin处理后，烟曲霉细胞损伤，出现质壁分离，菌丝细胞壁塌陷，质膜退化(Federica et al.,2015)；Sphingofungin是一种抗菌物质，Sphingofungin E和Sphingofungin F与myriocin的结构相似，同样抑制丝氨酸棕榈酰转移酶(Tsuyoshi and Masao,2002)。我们在菌株LZN01的无菌上清液中不仅检测到了myriocin，还有Sphingofungin F、Sphingofungin E、Sphingofungin C，这几种物质都会抑制细胞鞘脂类合成，这可能是菌株LZN01抑制西瓜专化型尖孢镰刀菌(FON)的原因之一。Gabapentin结构与γ-氨基丁酸类似，酵母乳酸菌有抗真菌和细菌的效果，氨基丁酸是其功能成分，可抗青霉和腐霉(Fatmanur et al.,2017),γ-氨基丁酸能降低扩展青霉的发病率，但在体外，没有直接的抗菌活性(Da et al.,2017)。检测到菌株LZN01无菌代谢物中含有gabapentin，发现其低浓度对FON的菌丝生长和孢子萌发没有影响，高浓度对FON有抑制活性。

3、解淀粉芽孢杆菌CMN1308抑菌效果随温度的升高抑菌效果增加(张雪花等，2016)，而本发明的菌株LZN01在-20℃～60℃时抑菌效果稳定，80℃以上Bacillusamyloliquefaciens LZN01发酵上清液的抑菌率急速下降；解淀粉芽孢杆菌CMN1308只耐碱(游春平等，2005)，而本发明的解淀粉芽孢杆菌LZN01在pH3～10范围内均有抑制效果，当pH在4～9之间的抑菌率在60％左右。Bacillus amyloliquefaciens LZN01发酵产生的抑菌物质热稳定性较好，耐酸耐碱。

附图说明

图1为基于LZN01和相关菌株的16S rDNA序列采用邻接法建立的系统发育树；

图2为Bacillus amyloliquefaciens LZN01对FON的抑制效应；

A和B：对峙实验；C和D：发酵液抑制实验；

图3为Bacillus amyloliquefaciens LZN01上清液对FON菌丝微观形态的影响；

A，C：正常生长FON菌丝和孢子；B，D：在Bacillus amyloliquefaciens LZN01发酵上清液处理的FON菌丝和孢子；

图4为Bacillus amyloliquefaciens LZN01发酵上清液对FON孢子萌发率的影响；

A：培养6h；B：培养12h；C：培养24h；D：解淀粉芽孢杆菌LZN01对FON孢子萌发抑制率的影响；

图5为在不同温度和pH值条件下Bacillus amyloliquefaciens LZN01发酵上清液的抑菌活性；

A：抑菌活性的温度稳定性；B：抑菌活性的pH稳定性；

图6为菌株LZN01不同时间代谢差异产物；

图7为不同代谢物对FON菌丝生长的影响；

A：Myriocin对FON菌丝生长的影响；B：3-Methyl-2-oxovaleric acid对FON菌丝生长的影响；C：Gabapentin对FON菌丝生长的影响。

图8为Myriocin定量结果。

A：菌株LZN01发酵72h无菌上清液；B：不加菌株发酵72h无菌上清液(CK)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。需要说明的是，下述实施例仅用于说明，而并非用于限制本发明。本领域技术人员根据本发明的教导所做出的各种变化均应在本申请权利要求所要求的保护范围之内。

实施例1解淀粉芽孢杆菌LZN01的筛选、鉴定以及在抑制西瓜尖孢镰刀菌(FON)中的应用

1材料与方法

1.1试验材料

供试药品：磷酸缓冲液(pH 7.2)：配制Na₂HPO₄和NaH₂PO₄储液，称取Na₂HPO₄ 138g和NaH₂PO₄ 142g，分别溶于适量水中，待其溶解后定容至1L；量取72mL Na₂HPO₄溶液和28mLNaH₂PO₄溶液，混合后即得到pH 7.2的磷酸缓冲溶液，4℃冰箱保存；2.5％戊二醛缓冲溶液：0.2mol/L磷酸缓冲液50mL加25％戊二醛溶液10mL，双蒸水定容至100mL。

供试培养基：PDA培养基(g/L)：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，琼脂15-20g，120℃灭菌20min；LB培养基(g/L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 8g，蒸馏水1000mL，120℃灭菌20min。

供试材料：小麦根际土壤；西瓜尖孢镰刀菌(FON)分离于西瓜枯萎病株，属于生理小种2号。

1.2菌种鉴定

(1)生理生化鉴定，生理生化试验方法参照《常见细菌系统鉴定手册》，接触酶试验、淀粉水解试验、V-P试验、耐盐性试验(2g、5g、7g、10g、20g)、柠檬酸铵利用试验、酷素水解试验方法分别参照文献(Zhang et al.,2015)。

(2)菌株16S rDNA测序：以LZN01菌株基因组DNA为模板，采用细菌通用引物sgF：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′进行PCR扩增。PCR反应体系20μL：2.0μL10×Ex Taq buffer，1.6μL 2.5mM dNTP Mix，0.8μL 5p Primer 1，0.8μL 5pPrimer2，0.5μL Template，0.2μL 5u Ex Taq，14.1μL dd H₂O。PCR反应条件：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃1min，24个循环，72℃延伸10min。由上海美吉生物公司进行测序，菌株测序结果于NCBI中GenBank数据库中进行Blast比对，寻找与目的序列同源性最高的已知分类地位菌种的16S rDNA序列。采用MEGA5.0软件以邻接法构建系统发育树(Rocha et al.,2015)。

1.3菌株LZN01及上清液对FON生长的影响

菌株LZN01对FON生长的抑制：采用平板对峙法，在PDA平板中央接入培FON菌碟

培养48h后距FON菌碟2cm处接入已培养24h的菌株LZN01，置于30℃恒温暗箱中培养5d，以不接菌株LZN01的平板为对照，观察FON菌碟的生长情况。

将LZN01菌体接入盛有100mL LB液体培养基中，置于30℃，200r/min震荡培养12h，制成种子液。再将1mL种子液接种于100mL LB液体培养基中，30℃，200r/min震荡培养48h后，在10000r/min、4℃的条件下离心15min，取上清液，再将上清液用0.22μm过滤器过滤，既得发酵上清液，于4℃冰箱备用。

将LZN01发酵上清与未凝固的PDA培养基按1:1、2:1混合，以培养基与无菌水按同样比例混合作为空白对照，待培养基凝固后，在平板上接种FON菌碟

30℃培养5d(三组平行试验)，待对照菌落长满平板2/3时，用十字交叉法测量病原菌菌落直径，计算抑菌率(张艳群等，2014)。

1.4菌株LZN01上清液对FON形态的影响

挑取PDA平板中培养5d的FON菌丝悬浮于无菌水中，经过6层纱布过滤后，室温下10000r/min离心5min收集孢子，孢子悬浮液的浓度调至10⁶cfu/mL。将菌株LZN01上清液与FON的孢子悬液按1:1比例(v：v)混合后，放入培养皿中，以无菌水与FON的孢子悬液按同样比例混合作为空白对照，在30℃黑暗条件下培养12h。分别吸取混合液滴在盖玻片上风干，使用2.5％戊二醛缓冲液固定，置于4℃冰箱过夜，再用pH 7.2的磷酸缓冲液将其固定，冲洗两次，依次将样品置于浓度为50％、70％、80％、90％、100％酒精中脱水置换，每级脱水时间为10～15min，最后置换100％酒精加无水硫酸铜脱水10～15min，置于冷冻室固化一夜，每组3个平行，扫描电镜下观察其形态(郭志红等，1998)。

1.5菌株LZN01上清液对FON孢子萌发的影响

按1.4中方法制备孢子悬浮液，向已灭菌的离心管中加入10μL孢子悬液，按1:1比例(v:v)加入菌株LZN01上清液，以同样比例的FON孢子悬液和无菌水为对照，混合均匀后，倒入无菌凹玻片中，放在铺有湿润滤纸的培养皿中，30℃黑暗条件下培养，每组3个平行。分别在6h、12h、24h观察孢子萌发情况。按公式测孢子萌发抑制率。

1.6菌株LZN01上清液抑菌能力的稳定性试验

(1)pH的影响

将发酵上清液分别用1M HCL或0.5M NaOH调节pH至3，4，5，6，7，8，9，10，处理1h，再将pH调回到初始pH值(pH 6.6)，测定其抑菌活性，以无菌水作对照，比较处理前后菌丝变化情况，计算抑菌率。

(2)温度的影响

将发酵上清液分别置于-20℃，0℃，4℃，20℃，60℃，80℃，100℃和120℃，保温30min，室温平衡3min后测定LZN01上清液对FON的抑菌率(按照公式1计算)。

1.7菌株LZN01上清液抑菌成分分析

样品包括菌株LZN01生长12h的上清液、生长72h的上清液和对照(不加菌株LZN01的LB培养基，震荡培养72h)，处理和对照各10个平行。

样品处理：

取1mL的上清液，加入20μL内标(L-2-氯苯丙氨酸，0.3mg/mL，甲醇配置)，在离心管中冻干；用300μL甲醇-乙腈(2:1)复溶，涡旋30s，在冰水浴中用超声清洗机提取5min；离心15min(13000rpm，4℃)；取200μL上清液装入带内衬管的LC-MS进样小瓶中，进行LC-MS分析。

采用超高效液相色谱-双分压线性阱-静电场轨道阱串联质谱仪(UHPLC-LTQOrbitrap)分析菌株LZN01上清液的抑菌成分。色谱条件为：色谱柱为BEH C18柱(100mm×2.1mm i.d.,1.7μm；Waters,Milford,USA)；流动相A为水(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1％甲酸)；梯度洗脱程序为0–1.5min：5％–25％B，1.5–10.0min：25％–100％B，10.0-13.0min：100％B，13.0-13.5min：100％-5％，5％B维持1.0min。流速为0.40mL/min，进样量为3μL，柱温为45℃。质谱条件为：样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式，电喷雾毛细管电压，进样电压和碰撞电压分别为:3.0kV，40V和30eV。毛细管和离子温度分别为：350℃，载气流量：45L/h，质谱扫描范围：50-1000m/z，分辨率为：30000。

采用多维分析OPLS-DA方法筛选组件差异代谢物(VIP>1，p value＜0.05)，筛选的差异代谢物用代谢组学软件progenesis QI(Waters Corporation，Milford，USA)进行定性。

1.8差异代谢物对FON菌丝和孢子萌发的生长

无菌条件下，将差异代谢物用无菌水配制成相应浓度，用0.22μm微孔滤器过滤，与已灭菌的PDA培养基等体积混匀，阴性对照用无菌水，阳性对照用两性霉素B，倒平板，每个处理三次重复。采用生长速率法，用直径5mm的打孔器打取同龄等量的菌落原片，放在含有不同浓度代谢物的PDA平板培养基上，每个培养皿1片，测量菌落直径，按照公式(1)计算菌丝抑制率。不同浓度代谢产物孢子萌发试验方法同1.5。

1.9差异代谢物的定量分析

将myriocin标准品稀释成浓度为40μg/mL、8μg/mL、1.6μg/mL、0.32μg/mL、0.064μg/mL、0.0128μg/mL，在超高效液相色谱/四极杆-轨道阱质谱联用仪上测量标曲，得出标准曲线方程。将活化后的菌株LZN01接种至LB液体培养基中，分别培养12h和72h，以不接种LZN01培养72h作为对照；培养结束后，将对照组及培养组离心，过0.22μm的滤器，将过滤后的无菌滤液分装至规格为2毫升的无菌离心管中，用超高效液相色谱/四极杆-轨道阱质谱联用仪定量。

2结果与分析

2.1菌种鉴定

菌株LZN01生理生化指标鉴定如表1，接触酶试验阳性，淀粉水解试验阳性，V-P试验阳性，不能够利用柠檬酸铵，酷素水解试验阳性，菌株在NaCl含量>5％的固体培养基中不生长。

表1 LZN01生理生化反应鉴定

注：+阳性反应-阴性反应

菌株LZN01的16S rDNA测序结果在NCBI网站进行Blast比对，发现菌株LZN01与Bacillus amyloliquefaciens BA17(MH894213.1)相似率高，在系统发育树上聚为一支(图1)，结合生理生化特征、同源性和系统发育分析，将菌株LZN01鉴定为解淀粉芽孢杆菌LZN01(Bacillus amyloliquefaciens LZN01)。

2.2解淀粉芽孢杆菌LZN01对FON菌丝生长的影响

平板对峙试验表明，当对照FON(图2A)长满培养皿时，试验组FON的生长呈现规避解淀粉芽孢杆菌LZN01的现象(图2B)，说明Bacillus amyloliquefaciens LZN01能够显著抑制FON的菌丝生长；当Bacillus amyloliquefaciens LZN01发酵上清液与培养基按1:1和2:1比例混合后，FON菌落直径为2.77cm(图2C)和1.79cm(图2D)，其抑菌率分别为34.82％和57.07％，说明Bacillus amyloliquefaciens LZN01能够显著抑制FON的生长。

2.3解淀粉芽孢杆菌LZN01对FON微观形态的影响

通过扫描电镜观察发现(图3)，对照FON菌丝和孢子较为光滑完整(图3A和C)，经Bacillus amyloliquefaciens LZN01发酵上清液处理后，FON菌丝表面变得粗糙和模糊，菌丝末端膨大变形，孢子皱缩不饱满，表面凹陷变形(图3B和D)，说明FON菌丝生长受到抑制，且细胞表面受损。此结果与菌落生长受抑制的实验结果一致。

2.4解淀粉芽孢杆菌LZN01对FON孢子萌发的影响

FON孢子悬液与Bacillus amyloliquefaciens LZN01上清液1:1比例混合，培养6h、12h、24h后的孢子萌发率，分别为2.40％、18.20％、42.17％(图4)，孢子萌发抑制率分别为86.21％、67.50％、56.05％，随着时间的增加孢子萌发抑制率呈下降趋势，可以看出Bacillus amyloliquefaciens LZN01对FON孢子萌发的抑制作用显著。

2.5Bacillus amyloliquefaciens LZN01抑菌能力的稳定性试验

温度在-20℃～60℃时，发酵上清液的抑菌活性较为稳定(图5A)，抑菌率基本保持在40％左右，当温度高于80℃时抑菌活性逐渐减弱，在100℃和121℃处理时抑菌率仅为4.33％和2.20％；当pH 3～10范围内均有抑制效果(图5B)，抑菌率为38.90％～62％，pH在4～9范围内抑菌率稳定且维持在60％左右；因此，Bacillus amyloliquefaciens LZN01发酵上清液的抑菌功能物质在pH 4～9、-20℃～60℃温度下能发挥较好的抑菌作用。

2.6LZN01上清液差异代谢物的分析

测定菌株LZN01生长曲线发现12h和72h LZN01分别处于对数生长期和衰亡期，测定了不同生长时期上清液的抑菌效果，发现衰亡期的抑菌效果最强。不同时期上清液差异代谢物分析表明：Sphingofungin E、Sphingofungin F、Sphingofungin C、Myriocin、Gabapentin、3-Methyl-2-oxovaleric acid等代谢物在CK中不存在(图6)。选择市面可售的代谢差异物做抑菌性试验，结果表明：Myriocin有抑制FON的活性(图7A)，低浓度的Gabapentin没有抑制FON菌丝生长的作用，高浓度能抑制FON菌丝生长，5mg/mL和10mg/mL的Gabapentin对FON菌丝生长的抑制率分别为23.30％和29.67％(图7C)；不同浓度的3-Methyl-2-oxovaleric acid没有抑制FON菌的活性(图7B)。

2.7菌株LZN01上清液中myriocin的定量

Myriocin标准曲线方程为y＝4×10^-13x+0.0006，R²＝0.9896；从图8中可以看出，菌株LZN01发酵72h的上清液在9.45min时出现一个峰，峰面积为6428638，由标准曲线测得菌株LZN01发酵72h上清液中myriocin的量约为0.60μg/mL；而对照的上清液在9.45min左右没有出现任何峰，说明对照中不含有myriocin。

3结论

Bacillus amyloliquefaciens LZN01对FON具有很好的抑菌效果；FON被Bacillusamyloliquefaciens LZN01发酵上清液处理后，菌丝和孢子有严重受损现象；Bacillusamyloliquefaciens LZN01发酵上清液的热稳定性较好，耐酸耐碱，其上清液中含有Sphingofungin E、Sphingofungin F、Sphingofungin C、Myriocin、Gabapentin等抑菌物质。

Claims

1.一株具有抑制西瓜专化型尖孢镰刀菌作用的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，命名为Bacillus amyloliquefaciens LZN01，保藏在中国典型培养物保藏中心，其菌种保藏编号为CCTCC NO.M 2018725。

2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在抑制西瓜专化型尖孢镰刀菌中的应用。

3.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在防治西瓜枯萎病中的应用。

4.一种权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求1中所述的Bacillus amyloliquefaciens LZN01菌体接入LB液体培养基中，置于30℃，200 r/min震荡培养10-14 h，制成种子液；再将种子液接种于LB液体培养基中，30℃，200 r/min震荡培养40-50 h后，在10000 r/min、4℃的条件下离心10-20 min，取上清液，再将上清液用0.22 μm过滤器过滤，即得发酵上清液。