CN104498386A

CN104498386A - 酸枣内生解淀粉芽孢杆菌新菌株sz23及发酵液的制备方法和应用

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Publication number: CN104498386A
Application number: CN201410683826.2A
Authority: CN
Inventors: 刘慧平; 刘�东; 刘慧芹; 张宝俊; 韩巨才; 张晓宇; 任璐
Original assignee: Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Agricultural University
Priority date: 2014-11-25
Filing date: 2014-11-25
Publication date: 2015-04-08
Anticipated expiration: 2034-11-25
Also published as: CN104498386B

Abstract

酸枣内生解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23及发酵液的制备方法和应用，本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌（ Bacillus amyloliquefaciens ）新菌株SZ23，于2014年7月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9481。本发明详细描述了解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23的形态特征、生理生化指标及16S rDNA序列测定结果等。经抑菌试验表明，本发明解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23的发酵液对梨黑斑病菌、西瓜枯萎病菌、辣椒枯萎病菌、番茄早疫病菌、黄瓜枯萎病菌、棉花立枯病菌、小麦赤霉病菌和番茄灰霉病菌等8种病菌均具有较好的抑菌活性，抑菌率在55.6%～92.2%，说明酸枣内生解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23具有较好的广谱性抑菌作用。经生产性试验，本发明新菌株SZ23的发酵液对梨黑斑病的防治效果在75%以上。

Description

酸枣内生解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23及发酵液的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及植物内生细菌的利用领域，具体地说是涉及一种酸枣内生解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）新菌株SZ23及发酵液的制备方法和应用。

背景技术

植物内生细菌(endophytic bacteria)是生存在植物细胞内或细胞间隙的细菌，它能够与其建立和谐关系。植物内生细菌不会引起植物的表型特征或功能发生变化。Paestur在1876年从葡萄中获得内生细菌后人们才真正开始了植物内生细菌的研究。1992年Kleopper第一次提出“植物内生细菌”(endophytic bacteria)的概念，使得植物学家、微生物学家和微生态学家对其进行了大量的研究。目前研究已经证实内生细菌存在于健康植物体内，还具有各种生物学作用，如促生、固氮、防治病虫害和降解重金属等。利用内生细菌防治植物病害的研究也是生物防治的热点之一。

内生细菌已成为植物微生态系统中的重要组成部分之一，内生细菌能够增强植物对恶劣环境的适应能力，改善系统生态平衡，保持寄主植物健康生长。利用内生细菌作为生防因子具有很大优势，体现在以下几个方面：（1）植物内生细菌在植物组织中不仅获得充足营养，而且通过植物组织保护，不会受外界环境如高温、干旱、强光等影响，具有稳定的生存环境，易于发挥其生物防治作用。（2）在植物被病原因子侵入后，无论易感植株或抗病植株，都会产生抗生素、植保素等抗菌物质提高自身免疫，这些抗菌物质会对土壤或植物根际的细菌有拮抗作用。而内生细菌长期寄生在植物体内，导致其细胞特性与腐生类细菌不同，会对植物抗菌毒性物质产生抗性，使植物的自身防卫系统不会对其造成影响，因而作为生防菌更具有优势。（3）植物内生细菌分布在植物根、茎、叶等各种器官中，方便病菌侵入后直接作用于病菌等致病因子，或产生拮抗物质运输到患病部位，或使寄主植物产生诱导抗性。（4）将内生细菌的某些抗病或抗菌基因导入其他工程细菌中，通过高产代谢物作为生物农药防治病虫害，不仅对环境友好，还可避免病原菌产生抗药性。如将棉花内生细菌抗虫基因导入Bt工程菌中，通过有效发酵液制成生物农药来防治玉米茎蛀螟和棉花的蚜虫。

植物内生细菌生防作用机制主要包括产生次生代谢物、竞争生态位、诱导寄主产生系统抗性及产生胞外溶菌酶降解病原菌细胞壁等方式。其中，产生次生代谢物抑制植物病原菌生长是植物内生细菌生防机制中一个重要组成部分，目前发现内生芽孢杆菌属所产生的拮抗物质主要有三大类：（1）蛋白类。包括多肽类、几丁质酶、抗菌蛋白，已报道的部分抗菌蛋白对蛋白酶、肽酶等多种酶不敏感。（2）抗菌肽。抗菌肽分子结构一般为环状或线状，具有分子量低、水溶性好、热稳定、耐强碱性和广谱抗菌等特点，如plipastatinBl、FungicinM-4和bacillomycinD等。（3）脂肽类。脂肽类物质易溶于水，有良好的表面活性，但易被降解。另外有些芽孢杆菌还可产生多烯类、香豆素、大环内酯类、酚类物质、含有双糖的氨基糖苷类抗生素等抗菌物质。

内生细菌的筛选须考虑植物的种植年龄、生长环境、抗病虫、食用和药用价值等。种植年代越久的植物，其内生细菌的种类可能更丰富，抗病虫性强的植物内生细菌也常会分泌与寄主相似的抗菌和杀虫活性物质。

酸枣(Ziziphus acidojujuba C.Y ChengetM.J.Liu)是鼠李科(Rhamnaceae枣属Ziziphus Mill.)植物。酸枣的环境适应能力强，可在低洼盐碱及干旱裂缝中上生长，也可在高温多雨及风沙寒冷中生长。酸枣果实营养成分丰富，果仁可以入药，使用价值高，是一种绿色的健康果品。酸枣中富含糖类、有机酸及多种的维生素，其中的维生素P 具有健脑功能及维生素 E 可以促进血液循环和组织生长。酸枣仁具有静心、补肝、生津等药用价值。另外酸枣中还含有皂苷、黄酮、三萜类、生物碱类、多种脂肪酸和氨基酸等对人体有益的化学成分。因此，根据酸枣药用性及较强的环境适应性和抗病能力，以内生细菌的研究技术为基础，对酸枣的内生细菌进行分离、筛选、鉴定，并对其抗菌活性物质产生条件及抗菌物质分离纯化等方面进行研究。该研究对利用植物内生细菌开发新生物农药提供了理论和物质基础。

发明内容

本发明的目的是提供酸枣内生解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23及发酵液的制备方法。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的。

酸枣内生解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）新菌株SZ23于2014年7月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 9481，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

所述的酸枣内生解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）新菌株SZ23是从山西省太谷地区的酸枣植株根组织为材料分离得到的内生细菌。

将酸枣内生解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23在NA培养基上30℃恒温培养，初期菌落呈乳白色、圆形、脓状、边缘整齐、菌落隆起，表面粘稠；随着培养时间的延长，菌落变干，出现褶皱，颜色变为浅黄色(图1)。经扫描电镜观察（图2），菌株SZ23菌体呈杆状，周生鞭毛，大小(0.87～1.3)μm×（1.5～2.8）μm。该菌革兰氏染色阳性，产芽孢。根据《常见细菌系统鉴定手册》对菌株SZ23进行了生理生化鉴定，结果见表1。

表1 菌株SZ23的生理生化特征

注：＋表示呈阳性反应；－表示呈阴性反应.

提取新菌株SZ23的DNA，经PCR反应后得到一条约为1500bp左右的DNA片段（图3）。测序后获得序列1451bp，将其上传至GenBank获取登录号为KF483660，序列在NCBI网站Blast比对，发现与Bacillus amyloliquefaciens（GU125620）和Bacillus subtilis (GQ199598)相似度都达到100%。

Neighbor-Joining构建系统发育树(图4)。结果显示菌株SZ23与Bacillus amyloliquefaciens（GU125620）和Bacillus subtilis (GQ199598)聚为一类，在系统发育上亲缘关系较近。结合形态观察及生理生化试验，确定新菌株SZ23为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Bacillus amyloliquefaciens。

酸枣内生解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23发酵液的制备方法，包括如下步骤：

(1) 种子液制备从试管斜面上用接种针挑取菌株SZ23到斜面培养基上，恒温25℃培养24h后接种到装有100mL的 LB培养液的三角瓶中，180r/min振荡培养12h，制得解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23的种子液；

(2) 发酵液制备将解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23的种子液按照1%的比例接入发酵培养基，培养条件是：25－35℃、初始pH为9.0、摇床转速180 －200r/min震荡培养30h，制得解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23的发酵液。

所述的发酵培养基是由下列质量体积比的成分组成：可溶性淀粉20、酵母浸膏5、蛋白胨10、K₂HPO₄·3H₂O 2、蒸馏水1000。

将上述制备的解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23的发酵液进行抑菌效果试验

1. 供试病原菌

供试病原菌由山西农业大学农药学实验室提供，包括梨黑斑病菌（Alternaria alternata）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）、辣椒枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp.cucurmerinum）、棉花立枯病菌（Rhizocton iasolani）、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)和番茄灰霉病菌（Bortytis cinerea）。

2.试验方法　

按照酸枣内生解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23发酵液的制备方法制备出新菌株SZ23发酵液，离心去除菌体得到细菌胞外代谢物。将代谢物和冷却至36－40℃的PDA培养基按体积1︰9混合后倒入培养皿，冷却凝固后分别接入5mm新鲜的梨黑斑病菌、西瓜枯萎病菌、辣椒枯萎病菌、番茄早疫病菌、黄瓜枯萎病菌、棉花立枯病菌、小麦赤霉病菌和番茄灰霉病菌菌块，以不加代谢物的PDA培养基作为空白对照。25℃恒温培养5d后测量菌落直径。

按以下公式计算抑制率：

菌丝生长抑制率%= ×100%

所述的PDA培养基是由下列质量体积比的成分组成：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂15，蒸馏水1000。

3.试验结果

试验结果见表2，结果表明，酸枣内生解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23发酵液对上述8种病原菌的抑菌率分别为90.5%、72.1%、58.1%、92.2%、70.8%、55.6%、72.1%、84.1%，均具有较好的抑菌活性，说明酸枣内生解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23具有较好的广谱性抑菌作用。

表2　解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23对8种植物病原菌的抑菌效果

因此，对本发明的解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23的发酵液在实验室试验抑菌效果超过80%的，可以用于生产上植物病害防治试验，包括由梨黑斑病菌、番茄早疫病菌和番茄灰霉病菌引起的相关病害。本发明重点就梨黑斑病菌引起的梨果实贮藏性梨黑斑病进行了试验。

用本发明的解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23的发酵液对梨黑斑病的防治试验方法

(1) 梨果采收前防治方法梨果采收前3～5天用喷雾器在果实表面喷洒解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23发酵液的50倍稀释液，收获后入保鲜库贮藏，入库10天后统计对梨黑斑病的防治效果。梨果实发病程度分级标准：

0 级 — 无病;

1 级 — 病斑占果表面积的1%以下；

3 级 —病斑占果表面积的2%～3% ；

5 级 —病斑占果表面积的4%～6% ；

7 级 —病斑占果表面积的7%～10% ；

9 级 — 病斑占果表面积的11% 以上；

病情指数=∑(各级腐烂果数 × 该级代表值)/ 总数 × 最高级代表值×100

防治效果 (% ) =（对照病情指数－处理病情指数　/　对照病情指数× 100

(2) 梨果采收后防治方法梨果采收后立即在解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23发酵液的50倍稀释液中浸泡2 min～3 min，待果实自然晾干后入保鲜库贮藏，入库10天后统计对梨黑斑病的防治效果。梨果实发病指数及防治效果同（1）。

试验结果

（1）梨果采收前3～5天用喷雾器在果实表面喷洒解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23发酵液的50倍稀释液，对梨黑斑病的防治效果为82.6%。

（2）梨果采收后立即在解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23发酵液的50倍稀释液中浸泡2 min～3 min，待果实自然晾干后入保鲜库贮藏，入库10天后统计对梨黑斑病的防治效果为75.5%。

本发明的有益效果

(1) 本发明的酸枣内生解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）新菌株SZ23，经实验室抑菌试验，表明对梨黑斑病菌、西瓜枯萎病菌、辣椒枯萎病菌、番茄早疫病菌、黄瓜枯萎病菌、棉花立枯病菌、小麦赤霉病菌和番茄灰霉病菌8种均具有较好的抑菌活性，抑菌率在55.6%～92.2%，说明酸枣内生解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23具有较好的广谱性抑菌作用。（2）经生产性试验，本发明的酸枣内生解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）新菌株SZ23的发酵液对梨黑斑病的防治效果在75%以上；（3）本发明的酸枣内生解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）新菌株SZ23的发酵液的制备工艺简单，发酵条件不苛刻，容易实现工业化生产。

附图说明

图1是本发明酸枣内生解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23的菌落形态。

图2是本发明酸枣内生解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23的扫描电镜照片。

图3是本发明酸枣内生解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23的16S rDNA PCR扩增。

图4是本发明酸枣内生解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23的16S rDNA 序列系统发育树。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）新菌株SZ23，于2014年7月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 9481，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）新菌株SZ23是从山西省太谷地区的酸枣植株根组织为材料分离得到的内生细菌。

表1 菌株SZ23的生理生化特征

注：＋表示呈阳性反应；－表示呈阴性反应.

实施例2

采用本发明的解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23发酵液防治梨黑斑病。

1、解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23发酵液的制备方法如下：

(2) 发酵液制备将解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23的种子液按照1%的比例接入由质量体积份的可溶性淀粉20份、酵母浸膏5份、蛋白胨10份、K₂HPO₄·3H₂O 2份、蒸馏水1000份制成的发酵培养基中，培养条件是：25－35℃、初始pH为9.0、摇床转速180 －200r/min震荡培养30h，制得解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23的发酵液。

2、在梨果采收前3～5天用喷雾器在果实表面喷洒解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23发酵液的50倍稀释液，选择天气晴朗、日照充足的时间段实施防治，该发酵液可有效预防梨果田间病原菌对采后贮藏期的侵染，减少贮期梨采后黑斑病的发生。经抽样调查，对梨采后黑斑病的防治效果达到80%以上。

实施例3

1、解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23发酵液的制备方法同实施例2。

2、将解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23发酵液用水稀释50倍，梨果采摘后立即用该稀释液浸泡2 min ~3 min，置于塑料周转箱，待果实自然晾干后再入保鲜库预冷、贮藏。注意在自然晾干过程中，避免将梨果与土壤等其他可能携带病原菌的物质接触。此法亦可有效预防梨果田间病原菌对采后贮藏期的侵染，减少贮期梨采后黑斑病的发生。经抽样调查，对梨采后黑斑病的防治效果达到75%以上。

Claims

1.一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）新菌株SZ23，于2014年7月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9481。

2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）新菌株SZ23，其特征在于，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）新菌株SZ23是从山西省太谷地区的酸枣植株根组织为材料分离得到的内生细菌；将解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23在NA培养基上30℃恒温培养，初期菌落呈乳白色、圆形、脓状、边缘整齐、菌落隆起，表面粘稠；随着培养时间的延长，菌落变干，出现褶皱，颜色变为浅黄色，经扫描电镜观察，菌株SZ23菌体呈杆状，周生鞭毛，大小(0.87～1.3)μm×（1.5～2.8）μm，该菌革兰氏染色阳性，产芽孢，根据《常见细菌系统鉴定手册》对菌株SZ23进行了生理生化鉴定，结果如下表所示：

菌株SZ23的生理生化特征

注：＋表示呈阳性反应；－表示呈阴性反应.

提取新菌株SZ23的DNA，经PCR反应后得到一条约为1500bp左右的DNA片段，测序后获得序列1451bp，将其上传至GenBank获取登录号为KF483660，序列在NCBI网站Blast比对，发现与Bacillus amyloliquefaciens（GU125620）和Bacillus subtilis (GQ199598)相似度都达到100%；构建Neighbor-Joining系统发育树，结果显示菌株SZ23与Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus subtilis聚为一类，在系统发育上亲缘关系较近；结合形态观察及生理生化试验，确定新菌株SZ23为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Bacillus amyloliquefaciens。

3.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）新菌株SZ23发酵液的制备方法如下：

4.用解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）新菌株SZ23发酵液防治梨黑斑病的方法是：

在梨果采收前3 ～5天用喷雾器在果实表面喷洒解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23的发酵液的50倍稀释液，选择天气晴朗、日照充足的时间段实施防治；

或

将解淀粉芽孢杆菌新菌株SZ23发酵液用水稀释50倍，梨果采摘后立即用该稀释液浸泡2 min～3 min，置于塑料周转箱，待果实自然晾干后再入保鲜库预冷、贮藏，注意在自然晾干过程中，避免将梨果与土壤等其他可能携带病原菌的物质接触。