CN105734000A - 一株有促生防病能力的多粘类芽孢杆菌nsy50 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一株多粘类芽孢杆菌NSY50，于2016年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.12189。本发明还公开了含有多粘类芽孢杆菌NSY50的菌剂。本发明菌株可以合成IAA，能够产生蛋白酶和纤维素酶，具有ACC脱氨酶活性，对黄瓜枯萎病菌、甜瓜蔓枯病病菌、小麦赤霉病和番茄青枯病菌等多种植物病原菌都具有较好的抑制作用。温室实验表明：该菌株制得的菌剂能够显著促进黄瓜幼苗的生长、降低黄瓜枯萎病的发生，通过采用该菌制备的生防菌剂在移栽时进行灌根处理，温室条件下对黄瓜枯萎病的生防效果高达75.90％～82.83％。

Description

一株有促生防病能力的多粘类芽孢杆菌NSY50

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一株多粘类芽孢杆菌NSY50，含有多粘类芽孢杆菌NSY50的菌剂、以及该菌剂在促进黄瓜幼苗生长、防治黄瓜枯萎病中的应用。

背景技术

黄瓜是一种全球性的重要蔬菜作物，保护地栽培面积达62万公顷，是第一大保护地栽培作物，我国是世界上黄瓜生产面积最大、总产量最高的国家。近年来，设施黄瓜栽培过程中土传枯萎病日趋严重，其病原菌是半知菌亚门尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusariumoxysporumf.sp.Cucumerinum)。近年来国内黄瓜主栽区普遍发生，一般可导致黄瓜减产10％～30％，严重时可达80％～90％。同时该病菌能够在土壤中存活长达数年，极大的影响了广大农民种田的经济效益。由于抗病品种的缺乏，传统的农业生产上通过化学农药如甲基溴土壤熏蒸、多菌灵等方法容易造成环境污染、产品安全及作物病害抗药性等问题。而通过嫁接换根、轮作倒茬甚至换土等措施，操作繁琐、工作量大、成本较高，因此，利用安全高效的生防制剂防治黄瓜枯萎病具有重要意义。

目前，非致病性尖孢镰刀菌、木霉菌、草酸青霉菌、芽孢杆菌、荧光假单胞菌、链霉菌等生防因子在防治植物枯萎病方面的研究应用较多。主要集中在可以利用微生物产生抗病物质，与病原菌竞争营养、空间位点，以及诱导植物产生系统抗病性等方式，具有对环境和人畜安全、不易产生抗药性等优点，是一种经济有效的防治植物病害的方法，具有广阔的开发利用前景。因此，开发新的、更为高效安全的微生物制剂，来丰富这种环境友好型的防治植物病害生物制剂资源，对我国农业的安全可持续发展具有重要的意义。

发明内容

本发明目的是提供一种能够促进黄瓜植株生长、防治连作黄瓜枯萎病的拮抗菌及其菌剂，缓解或克服现有技术中没有对黄瓜枯萎病有较高且安全的防治措施的现状，确保农业集约化、现代化生产的顺利发展。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一株具有促生防病能力的生防菌株NSY50，分类命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)，于2016年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.12189。

该菌能够合成吲哚乙酸，降解乙烯合成前体物质1-氨基环丙烷基羧酸，分泌包括蛋白酶、纤维素酶等多种物质。合成IAA能够直接促进植物生长，植物生长健壮，一定程度上有效防御病害的侵害。NSY50具有ACC脱氨酶活性，其功能在于能够将ACC降解成氨和α-丁酮酸。ACC是植物激素乙烯的合成前体，在外界各种胁迫环境下ACC含量会升高(Glicketal.,1998)。植物根际有益细菌附着在寄主植物的表面，产生的ACC脱氨酶分解ACC，降低细菌内ACC含量，植物体内的ACC流入根际细菌，并被ACC脱氨酶继续水解(Glicketal.,1998)，最终引起植物体内乙烯含量降低到一个有益的水平。综上所述，ACC脱氨酶可以降低有害乙烯的含量，促进植物生长，缓解胁迫环境的影响。蛋白酶和纤维素酶等水解酶不仅能够作用于真菌细胞壁相应的底物，使病原真菌的菌丝体和孢子的生长受到抑制，而且这些拮抗菌产生的细胞壁降解酶类(纤维素酶)还能作为诱导寄主植物普遍的抗病防卫反应的激发(Leeetal.,2010；Ajitetal.,2006；Chenetal.,2010)。总之，这些水解酶类是生防菌的一个至关重要的特征，它在抑制病原菌的生长，防治植物病害方面起了非常重要的作用。所述的多粘类芽孢杆菌NSY50能够抑制植物病原菌生长。所述的植物病原菌为黄瓜枯萎病菌、甜瓜蔓枯病病菌、小麦赤霉病菌、番茄青枯病菌。本发明的另一个目的是提供所述的多粘类芽孢杆菌NSY50在防治植物病原真菌引起的植物病害中的应用。所述的植物真菌病害为黄瓜枯萎病菌、甜瓜蔓枯病病菌、小麦赤霉病和番茄青枯病菌；优选的，所述的植物真菌病害为黄瓜枯萎病。

所述的多粘类芽孢杆菌NSY50在促进黄瓜生长中的应用。

本发明的另一个目的是提供含有本发明所述的多粘类芽孢杆菌NSY50的菌剂；所述的菌剂中活菌总浓度为1×10⁸～1×10¹⁰CFU/mL。

所述的菌剂是通过以下方法制得的：将菌株NSY50接种在LB培养液中，28℃、180rpm振荡培养24-48h，然后8000rpm离心5min，取沉淀用无菌水重悬浮，制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×10⁸～1×10¹⁰CFU/mL。

本发明所述的含有所述的多粘类芽孢杆菌NSY50的菌剂的制备方法，包括：将菌株NSY50接种在LB培养液中，25-30℃、180rpm振荡培养24-48h，然后8000rpm离心5min，取沉淀用无菌水重悬浮，制成活菌总浓度为1×10⁸～1×10¹⁰CFU/mL的菌剂。

本发明所述的含有多粘类芽孢杆菌NSY50的菌剂在防治植物病原真菌引起的植物病害中的应用。所述的植物真菌病害为黄瓜枯萎病菌、甜瓜蔓枯病病菌、小麦赤霉病和番茄青枯病菌；优选的，所述的植物真菌病害为黄瓜枯萎病。

所述菌剂在防治黄瓜枯萎病方面的应用方法为：作物移栽时，每株幼苗使用含有多粘类芽孢杆菌NSY50的菌剂灌根处理，施用量为：15mL菌剂/每株，菌剂中活菌浓度为1×10⁸～1×10¹⁰CFU/mL。温室栽培条件下对黄瓜枯萎病的生防效果为75.90％～82.83％。

所述的含有多粘类芽孢杆菌NSY50的菌剂在促进黄瓜生长中的应用。

所述的菌剂为促吲哚乙酸合成、促1-氨基环丙烷基羧酸(ACC)脱氨水解的菌剂。

本发明的有益效果：

本发明从具有防治黄瓜枯萎病病害能力的醋糟基质中分离得到一株多粘类芽孢杆菌NSY50，该菌株可以合成IAA，能够产生蛋白酶和纤维素酶，具有ACC脱氨酶活性，对黄瓜枯萎病菌、甜瓜蔓枯病病菌、小麦赤霉病和番茄青枯病菌等多种植物病原菌都具有较好的抑制作用。

能够显著的促进黄瓜幼苗生长、防治黄瓜枯萎病。温室实验表明：该菌株制得的菌剂能够显著促进黄瓜幼苗的生长、降低黄瓜枯萎病的发生，通过采用该菌制备的生防菌剂在移栽时进行灌根处理，温室条件下对黄瓜枯萎病的生防效果高达75.90％～82.83％。制成生物菌剂使用，避免了因为化学农药的使用所带来的一系列问题，安全有效，利于蔬菜的无公害生产，能够有效降低农民对化学农药的利用和依赖，节约生产成本。

附图说明

图1为多粘类芽孢杆菌NSY50在电镜下的形态。

图2为多粘类芽孢杆菌NSY50在含100mg/L色氨酸LB培养液中的IAA合成能力。

图3为多粘类芽孢杆菌NSY50对植物病原菌的抑制作用；其中A：多粘类芽孢杆菌NSY50；B：黄瓜枯萎病菌；C：甜瓜蔓枯病病菌；D：小麦赤霉病菌；E：番茄青枯病菌。

图4为多粘类芽孢杆菌NSY50产生蛋白酶。

图5为多粘类芽孢杆菌NSY50产生纤维素酶。

图6多粘类芽孢杆菌NSY50具有1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶活性。

图7多粘类芽孢杆菌NSY50对黄瓜幼苗的促生效果。

生物材料保藏信息

NSY50，分类命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)，于2016年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNO.12189。

具体实施方式

实施例1多粘类芽孢杆菌NSY50的分离

筛选方法：从具有对黄瓜枯萎病较好防治效果的醋糟基质中分离出来。

其中，醋糟基质由镇江培蕾基质科技发展有限公司提供，原料来自当地酿醋工业废料，经发酵工艺而成醋糟基质。分离方法按照以下几个步骤进行：

(1)拮抗菌的初选：将醋糟基质与无菌水按质量体积比(g/mL)为1：10的比例在28℃、180rpm振荡培养6-8h，滤纸过滤得到浸提液。在超净工作台中，将100μL浸提液涂布于含有固体PDA培养基的90mm培养皿中，风干5-10min，在培养皿中央转接事先培养好的直径为5mm的黄瓜枯萎病病菌菌块，封口膜密封，于28℃的生化培养箱中培养5-7天，观察平板上有无形成抑菌圈。

(2)目标细菌的纯化：待平板上形成抑菌圈后，将对枯萎病病菌生长有明显抑制作用的目标细菌挑选出来，在LB固体平板上采用三线法划线，纯化。

(3)拮抗菌的复选：采用平板对峙的四点法将纯化的目标细菌的菌液分别接到含有病原菌的PDA平板上，通过观察抑菌圈的有无、大小，筛选出拮抗菌。得到一株拮抗效果较明显和稳定的菌株，命名为NSY50。

(4)菌种保存：将NSY50采用LB培养液培养12h-24h后，分装到15mL离心管中，加入40％甘油，保存于-70℃超低温冰箱中。

实施例2多粘类芽孢杆菌NSY50的鉴定

鉴定方法：通过形态特征，生理生化实验和16SrDNA序列分析对该菌株进行鉴定。

采用扫描电镜观察菌体形态和大小(见图1)。

将筛选获得的菌株NSY50在LB培养基上进行活化，然后转移到50mlLB培养液中，在28℃、180rpm振荡培养24-48h，得到活化的NSY50菌液，备用。

产IAA能力检测：灭菌的LB液体培养基中添加100g/L的色氨酸，接种活化后的NSY50菌液0.2ml，采用Salkowski法测定产IAA能力，540nm下测定吸光度(表1)。

分别在蛋白酶检测培养基平板、纤维素酶检测培养基平板中央点接种NSY50菌液5μL，每个处理重复5皿。28℃生化培养箱培养3-5d，观察有无透明圈，有透明圈表示有该酶活性。结果如图4、5，在蛋白酶检测培养基平板、纤维素酶检测培养基平板均出现透明圈，说明NSY50产生蛋白酶和纤维素酶。

蛋白酶检测培养基：脱脂奶粉100g，琼脂18g，溴百里酚兰pH7.4左右，定容到1L。

纤维素酶检测培养基：羧甲基纤维素钠10g，酵母粉10g，NaCl5g，磷酸二氢钾1g，琼脂18g，定容到1L，pH7.0。

ACC脱氨酶活性检测培养基：

DF盐培养基：KH₂PO₄4.0g，Na₂HPO₄6.0g，MgSO₄·7H₂O0.2g，葡萄糖2.0g，葡萄糖酸2.0g，柠檬酸2.0g，(NH₄)₂SO₄2.0g，去离子水定容到1L，pH7.2；

ADF培养基：ACC溶于灭菌的超纯水后，用0.22μm一次性无菌过滤器过滤除菌，加到不含有(NH₄)₂SO₄的DF盐培养基中，使ACC最终浓度为3.0mmol/L。

将活化的NSY50菌液接种到LB培养液中，28℃、180rpm振荡培养1d。取1ml转接到150mLDF盐培养基中，相同条件下培养1d。然后再取1ml经DF培养液培养后的菌液加入100mLADF培养液中，培养24-48h，观测菌液能否浑浊，浑浊表示NSY50菌株能够在该培养基中存活，具有ACC脱氨酶活性。结果如图6(图6中“DF培养基”、“ADF培养基”表示没有接种NSY50的空培养基，作为空白对照)，左侧DF盐培养基中接种了NSY50菌液后变浑浊，表示NSY50菌株首先在DF培养基中能够存活，然后将其转接到右侧的ADF培养基中，发现接种了NSY50菌液的培养瓶中菌液变浑浊，表示NSY50能够在该培养基中存活，表示NSY50能够利用ACC，最终表明该菌株具有ACC脱氨酶活性。

表1菌株NSY50的形态特征及生理生化特征

16SrDNA基因扩增和序列分析：

将该菌株在LB培养基中28℃培养24h，采用细菌DNA提取试剂盒BacterialDNAKit(50)OMEGAD3350-01提取细菌的基因组DNA，以通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1494R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′扩增细菌16SrDNA序列。扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检验，PCR产物送上海英俊生物技术有限公司进行测序。通过BLAST对该序列进行同源性比较(见表2)。

表2NSY50菌株的测序比对结果

菌株NSY50鉴定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)。

实施例3多粘类芽孢杆菌NSY50广谱拮抗能力检测

采用平板对峙的四点法对NSY50的抗菌谱进行测定：将活化的NSY50菌液(实施例2制得)分别接种到含有黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.Cucumberinum)、甜瓜蔓枯病病菌(Didymellabryoniae)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、番茄青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)的PDA平板上，封口膜密封，于28℃的生化培养箱中培养5-7天，观察平板上有无形成抑菌圈，若出现透明抑菌圈，说明多粘类芽孢杆菌NSY50对该病原菌具有抑制作用。结果见图3，上述4个PDA平板均出现透明圈，说明多粘类芽孢杆菌NSY50对黄瓜枯萎病菌、甜瓜蔓枯病病菌、小麦赤霉病菌和番茄青枯病菌均有抑制作用。

实施例4多粘类芽孢杆菌NSY50对黄瓜幼苗的促生效果

多粘类芽孢杆菌NSY50在LB液体培养基中28℃，180rpm条件下培养24-48h，8000rpm离心5min，弃上清液，将沉淀用无菌水重悬浮，无菌水重悬，调整活菌总浓度为1×10⁸CFU/mL，制得菌剂，备用。

挑选饱满的黄瓜种子(‘津春二号’)催芽后播种于含基质的(泥炭：蛭石＝2：1)15孔育苗穴盘中，待黄瓜幼苗长到两叶一心期，每株幼苗采用25mLNSY50菌剂对进行灌根处理；对照组添加等体积清水；每个处理设置3盘，每盘15株。12天后拍照并测量株高、茎粗、植株干鲜重、总叶面积(见图7和表3)。

表3多粘类芽孢杆菌NSY50对黄瓜幼苗的促生效果

注：同列不同字母表示显著水平P<0.05。

与对照相相比，经过多粘类芽孢杆菌NSY50菌剂处理的黄瓜幼苗，植株株高、茎粗、植株鲜重、干重、总叶面积分别增加86.0％、4.0％、72.4％、69.5％、100.8％。

实施例5NSY50菌剂的温室防效试验

NSY50菌剂的制备：将菌株NSY50在LB培养液28℃、180rpm振荡培养24-48h，然后8000rpm离心5min，弃上清液，将沉淀用无菌水重悬浮，制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×10⁸CFU/mL，备用。

病原菌的制备：黄瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌F.oxysporumf.sp.cucumberinumKW2-1由中国农业科学院植物保护研究生李世东课题组惠赠，最初分离于感病植株。将病原菌在PDA培养液中，25℃、150rpm条件下培养7天，用三层灭菌纱布过滤得到孢子悬浮液。血球计数板测定孢子浓度，用无菌水稀释至1×10⁷个孢子/ml，备用。

选用一叶一心的黄瓜壮苗(‘津春二号’品种)进行移栽，移栽后采用NSY50菌剂处理：每株苗用15mL制得的NSY50菌剂进行灌根处理；对照组用等体积的清水处理，每个处理10株，重复3次。NSY50菌剂处理3天后，每株幼苗浇灌10mL病原菌孢子悬浮液。待黄瓜苗开始发病后，观察记录叶片黄化状况，病原菌处理20天后统计发病情况。

按Huang(Huangetal.2012)的病情统计方法分级，病情指数按照以下方法计算：

0级—叶面无症状，健康植株；

1级—1/2以下叶片出现枯萎症状；

2级—1/2以上叶片出现枯萎病症状但植株未死亡；

3级—植株死亡。

病情指数(％)＝[∑(病级数×该病级植株数)/(最高病级×总植株数)]×100％

生防效果(％)＝[(对照病情指数-处理组病情指数)/对照病情指数]×100％

在病原菌处理20天后的调查结果显示，NSY50菌剂对黄瓜枯萎病的生防效果达到75.90％～82.83％(见表4)。

表4生防菌剂NSY50对黄瓜枯萎病的生防效果

Claims (10)

1.一株具有促生防病能力的生防菌株NSY50，分类命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)，于2016年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.12189。

2.权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌NSY50在防治植物病原真菌引起的植物病害中的应用；所述的植物真菌病害为黄瓜枯萎病菌、甜瓜蔓枯病病菌、小麦赤霉病和番茄青枯病菌。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的植物真菌病害为黄瓜枯萎病。

4.权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌NSY50在促进黄瓜生长中的应用。

5.含有权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌NSY50的菌剂；所述的菌剂中活菌总浓度为1×10⁸～1×10¹⁰CFU/mL。

6.权利要求5所述的含有多粘类芽孢杆菌NSY50的菌剂的制备方法，其特征在于包括：将菌株NSY50接种在LB培养液中，25-30℃、180rpm振荡培养24-48h，离心，取沉淀用无菌水重悬浮，制成活菌总浓度为1×10⁸～1×10¹⁰CFU/mL的菌剂。

7.权利要求5所述的含有多粘类芽孢杆菌NSY50的菌剂在防治植物病原真菌引起的植物病害中的应用；所述的植物真菌病害为黄瓜枯萎病菌、甜瓜蔓枯病病菌、小麦赤霉病和番茄青枯病菌。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的植物真菌病害为黄瓜枯萎病。

9.权利要求5所述的菌剂在防治黄瓜枯萎病方面的应用方法为：作物移栽时，每株幼苗使用含有多粘类芽孢杆菌NSY50的菌剂灌根处理，施用量为：15mL菌剂/每株，菌剂中活菌浓度为1×10⁸～1×10¹⁰CFU/mL。

10.权利要求5所述的含有多粘类芽孢杆菌NSY50的菌剂在促进黄瓜生长中的应用。