CN117904010A - 多粘类芽孢杆菌ipp209-1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物防治领域，具体涉及一株多粘类芽孢杆菌IPP209‑1及其应用。本发明提供的多粘类芽孢杆菌IPP209‑1，其保藏编号为CGMCC No.29530。该菌株能够有效抑制梨火疫病菌、番茄青枯病菌、水稻白叶枯病菌、草莓炭疽病菌、小麦赤霉病菌和辣椒疫霉病菌，对梨火疫病和草莓炭疽病具有显著的防治效果，在植物病害的生物防治中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物防治领域，具体涉及一株多粘类芽孢杆菌IPP209-1及其应用。
背景技术
梨火疫病是由梨火疫欧文氏菌（Erwinia amylovora）引起的重大细菌性病害，严重时可以在一至几个生长季内将整个果园毁灭，造成严重的经济损失。
梨火疫欧文氏菌为我国一类进境植物检疫危险性有害生物，其寄主范围广泛，可侵染蔷薇科40多属220多种植物，其中危害最严重的是梨、苹果、山楂等仁果类果树。该病原菌多侵害新梢、花叶、果实和树枝，也可侵染树干。病原菌侵染嫩梢后，造成枝上的叶片全部凋萎，幼果僵化，挂在树上；侵染花器后，会相继扩展到花梗和同一花簇中的其他花朵及周围的叶片，受害的花和叶片逐渐枯萎呈深褐色；侵染叶片从叶缘开始，再沿叶脉逐步扩展至全叶，病斑呈水渍状，后变黑褐色，直至枯萎；侵染果实后，受侵染部位呈褐色凹陷状，后逐渐扩展至全果实。病原菌侵染后造成的枯枝和枯叶，远远望去像是被霜打和火烧的一样，故称为火疫病。
迄今为止，梨火疫病安全有效的防控依然是世界性难题。目前梨火疫病的防治手段主要包括隔离检疫、施用化学农药以及物理剪枝挖树等。鉴于人们的环保意识逐渐增强和对绿色有机农产品的需求增加，以及剪枝挖树造成的生产成本上升和产量降低，迫切需要开发绿色环保高效安全的生防产品来解决梨火疫病对梨产业的威胁。
发明内容
为了安全有效地防治梨火疫病和降低生产成本，本发明提供一株多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa），命名为IPP209-1。经实验证明，该菌株不仅能够有效抑制植物病原细菌（梨火疫病菌、番茄青枯病菌、水稻白叶枯病菌），还能有效抑制植物病原真菌（草莓炭疽病菌、小麦赤霉病菌、辣椒疫霉病菌），对梨火疫病和草莓炭疽病具有显著的防治效果，在植物病害的生物防治中具有良好的应用前景。
本发明提供的多粘类芽孢杆菌IPP209-1（本文也称为菌株IPP209-1、IPP209-1菌株或IPP209-1），其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（China GeneralMicrobiological Culture Collection Center, CGMCC）的保藏编号为CGMCC No. 29530。
IPP209-1菌株具有序列表中SEQ ID NO:1所示的16SrDNA序列，与多粘类芽孢杆菌ATCC842的相似性为99.50%。
本发明还提供一种产品，其包含所述多粘类芽孢杆菌IPP209-1。
所述产品可为预防和/或治疗梨火疫病的产品。
所述产品可为预防和/或治疗番茄青枯病的产品。
所述产品可为预防和/或治疗水稻白叶枯病的产品。
所述产品可为预防和/或治疗草莓炭疽病的产品。
所述产品可为预防和/或治疗小麦赤霉病的产品。
所述产品可为预防和/或治疗辣椒疫霉病的产品。
所述产品可为抑制梨火疫病菌、番茄青枯病菌、水稻白叶枯病菌、草莓炭疽病菌、小麦赤霉病菌和/或辣椒疫霉病菌的产品。
所述产品可为固体或液体菌剂。
所述产品还可包括其它的能够预防和/或治疗梨火疫病、番茄青枯病、水稻白叶枯病、草莓炭疽病、小麦赤霉病和/或辣椒疫霉病的菌株。
所述产品还可包括其它的能够抑制梨火疫病菌、番茄青枯病菌、水稻白叶枯病菌、草莓炭疽病菌、小麦赤霉病菌和/或辣椒疫霉病菌的菌株。
所述产品还可包括赋形剂、乳化剂、增稠剂、保菌剂、分散剂、表面活性剂、稳定剂和/或pH调节剂。
所述产品的剂型可以是粉剂型、颗粒剂型或液体剂型。
本发明还提供制备所述产品的方法，其包括培养所述多粘类芽孢杆菌IPP209-1并将其作为活性成分制备所述产品。
本发明还提供所述多粘类芽孢杆菌IPP209-1或所述产品在预防和/或治疗梨火疫病中的应用。
本发明还提供所述多粘类芽孢杆菌IPP209-1或所述产品在预防和/或治疗番茄青枯病中的应用。
本发明还提供所述多粘类芽孢杆菌IPP209-1或所述产品在预防和/或治疗水稻白叶枯病中的应用。
本发明还提供所述多粘类芽孢杆菌IPP209-1或所述产品在预防和/或治疗草莓炭疽病中的应用。
本发明还提供所述多粘类芽孢杆菌IPP209-1或所述产品在预防和/或治疗小麦赤霉病中的应用。
本发明还提供所述多粘类芽孢杆菌IPP209-1或所述产品在预防和/或治疗辣椒疫霉病中的应用。
本发明还提供所述多粘类芽孢杆菌IPP209-1或所述产品在抑制梨火疫病菌、番茄青枯病菌、水稻白叶枯病菌、草莓炭疽病菌、小麦赤霉病菌和/或辣椒疫霉病菌中的应用。
抑菌实验结果表明，IPP209-1不仅能够有效拮抗梨火疫病菌(Erwinia amylovora)、番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)和水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)这三种植物病原细菌，还能够明显抑制草莓炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)和辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)这三种植物病原真菌。IPP209-1对梨火疫病菌、番茄青枯病菌和水稻白叶枯病菌的抑菌圈直径分别为4.12 cm、2.92 cm和3.65cm（实施例2）。IPP209-1对草莓炭疽病菌、小麦赤霉病菌和辣椒疫霉病菌的抑菌率分别为78.21%、73.96%和68.18%（实施例2）。因此，IPP209-1可用于防治由这些病原菌引起的梨火疫病、番茄青枯病、水稻白叶枯病、草莓炭疽病、小麦赤霉病和辣椒疫霉病。室内防效测定结果表明，IPP209-1对梨火疫病的室内防效为85.22%（实施例3），对草莓炭疽病的室内防效为92.17%（实施例4）。
本发明提供的多粘类芽孢杆菌 IPP209-1的专利保藏信息如下：
生物材料(株)：IPP209-1
分类命名：多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa
保藏日期：2024年01月08日
保藏编号：CGMCC No. 29530
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为菌株IPP209-1的菌落形态图。
图2为菌株IPP209-1对不同植物病原细菌的平板抑菌实验结果；第一排左图为含梨火疫病菌的NA固体培养基、右图为含梨火疫病菌的NA固体培养基的中央放置了IPP209-1菌饼；第二排左图为含番茄青枯病菌的NA固体培养基、右图为含番茄青枯病菌的NA固体培养基的中央放置了IPP209-1菌饼；第三排左图为含水稻白叶枯病菌的PSA固体培养基、右图为含水稻白叶枯病菌的PSA固体培养基的中央放置了IPP209-1菌饼。
图3为菌株IPP209-1对不同植物病原真菌的平板对峙实验结果；对照（正面）表示仅接种病菌的培养基平板的正面；对照（背面）表示仅接种病菌的培养基平板的背面；处理（正面）表示接种了病菌和IPP209-1的培养基平板的正面；处理（背面）表示接种了病菌和IPP209-1的培养基平板的背面。
图4为菌株IPP209-1对梨火疫病的室内防效测试结果；位置1只接种了梨火疫病菌菌液（OD600=1.0）；位置2接种了IPP209-1菌液（OD600=1.0）和梨火疫病菌菌液（OD600=1.0）的等体积混合菌液；位置3接种了LB液体培养基和NA液体培养基的1:1混合液。
图5为菌株IPP209-1对草莓炭疽病的室内防效测试结果；处理：接种了草莓炭疽病菌孢子悬浮液（1.0×106CFU/mL）和IPP209-1菌液（OD600=1.0）的等体积混合菌液；对照1只接种了草莓炭疽病菌孢子悬浮液（1.0×106CFU/mL）；对照2只接种了LB培养基与无菌水的1:1混合液；图中用圆圈圈出了草莓叶片上的接种位置。
序列说明
SEQ ID NO: 1为菌株IPP209-1的16SrDNA序列。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明的技术方案进行详细描述。需要理解的是，以下实施例仅用于解释和说明，不用于限制本发明的保护范围。
以下实施例中使用的梨火疫病菌(Erwinia amylovora)、番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)、草莓炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)和辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)均来源于本实验室的菌库，由本实验室分离和保存。其中水稻白叶枯病菌是Chao Yu, Nu Wang, Maosen Wu, Fang Tian, Huamin Chen,Fenghuan Yang, Xiaochen Yuan, Ching-Hong Yang, Chenyang He.OxyR-regulatedcatalase CatB promotes the virulence in rice via detoxifying hydrogenperoxide in Xanthomonas oryzae pv. oryzae. BMC Microbiology (2016)16:269. DOI10.1186/s12866-016-0887-0.中记载的Xanthomonas oryzaepv.oryzae菌株。公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得上述菌株。
以下实施例中使用的培养基：
LB培养基（胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂15 g，蒸馏水1000mL，pH 7.2）
NA培养基（蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 mL，pH7.4）
PSA培养基（蛋白胨10 g，蔗糖10 g，谷氨酸1 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 mL，pH7.0）
PDA培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0）
上述配方为固体培养基配方，液体培养基配方为相应固体培养基配方中不加琼脂。
以下实施例中使用的库尔勒香梨从市场上购买获得。
以下实施例中使用的草莓植株为已知草莓品种“红颜草莓”，由本实验室种植。
若未特别说明，以下实施例中使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特别说明，以下实施例所使用的实验方法和条件均为本领域常规实验方法和条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。
实施例1菌株IPP209-1的分离、纯化和鉴定
1、细菌的分离、纯化
本发明的土壤样品取自湖北省荆门市某山坡的梨园中，分离纯化的方法如下：
称取土壤样品10 g，加入装有90 mL无菌水的三角瓶中，振荡摇匀后80 °C水浴10min，水浴期间摇匀2-3次，使之水浴充分，即配成10-1浓度的土壤悬浮液原液。将土壤悬浮液原液继续稀释至10-2浓度，然后吸取200 μL稀释液涂布到事先准备好的含有梨火疫病菌(Erwinia amylovora)的NA培养基平板（平板直径15 cm）上，重复3次，待涂布好的平板晾干后放入28 °C恒温培养箱中静置培养48 h，随后对着光观察平板上的抑菌圈，挑取有抑菌圈的菌株，在新的LB平板上划线培养48 h，获得了一株梨火疫病菌(Erwinia amylovora)的拮抗菌，命名为IPP209-1，其菌落形态如图1所示。
2、菌株IPP209-1的鉴定
将IPP209-1菌株接种于LB液体培养基中，于28 °C、180 r/min震荡培养24 h后收集菌体，使用细菌DNA提取试剂盒提取基因组DNA，然后使用芽孢杆菌16SrDNA通用引物27F/1492R通过PCR扩增IPP209-1菌株的16SrDNA。扩增产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测合格后，送到北京六合华大基因科技有限公司进行测序，所得序列通过EzBioCloud数据库（https://www.ezbiocloud.net/）进行在线比对，以同源性最高菌株的序列作为参比对象，确定IPP209-1菌株的分类地位。
序列比对结果显示IPP209-1菌株的16SrDNA序列（SEQ ID NO: 1）与多粘类芽孢杆菌ATCC842菌株的相似性最高，其相似性为99.50%，因此判断IPP209-1菌株是多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）。
3、菌株IPP209-1的专利保藏
IPP209-1菌株已于2024年01月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC），保藏编号为CGMCC No. 29530。
实施例2菌株IPP209-1对不同植物病原菌的拮抗活性测定
1、IPP209-1对植物病原细菌的拮抗作用
采用固体琼脂打孔法测定IPP209-1菌株对梨火疫病菌(Erwinia amylovora)、番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)和水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)这三种植物病原细菌的拮抗作用。方法如下：将IPP209-1菌株在LB固体培养基上活化后，用直径为0.5 cm打孔器取下菌饼，随后将IPP209-1菌饼分别接种至含梨火疫病菌的NA固体培养基、含番茄青枯病菌的NA固体培养基以及含水稻白叶枯病菌的PSA固体培养基的中央，于28 °C恒温静置培养48 h，测量并记录抑菌圈直径，每个处理重复3次。
结果如图2所示，IPP209-1对梨火疫病菌的拮抗作用最强。经测量，IPP209-1对梨火疫病菌的抑菌圈直径为4.12 cm，对番茄青枯病菌的抑菌圈直径为2.92 cm，对水稻白叶枯病菌的抑菌圈直径为3.65 cm（表1）。
2、IPP209-1对植物病原真菌的拮抗作用
本实验测定IPP209-1菌株对草莓炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)和辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)这三种病原真菌的拮抗作用。针对每一种病原真菌，设置对照组和处理组。处理组：将病原真菌在PDA固体培养基上28 °C恒温静置培养5天后，用打孔器打取直径为0.5 cm的菌饼，放置在新鲜的PDA平板中央；将准备好的IPP209-1菌饼围绕病原真菌呈三角形放置（图3），于28 °C恒温静置培养5天。对照组不接种IPP209-1菌饼，其余同处理组。观察IPP209-1的抑菌效果，并计算抑菌率。每个处理重复3次。
抑菌率=（对照的病菌菌落半径-IPP209-1处理后的病菌菌落半径）/对照的病菌菌落半径*100%。
结果如图3所示，菌株IPP209-1对草莓炭疽病菌、小麦赤霉病菌和辣椒疫霉病菌均有明显的拮抗作用。经测量和计算，菌株IPP209-1对草莓炭疽病菌、小麦赤霉病菌和辣椒疫霉病菌的抑菌率分别为78.21%、73.96%和68.18%。
实施例3菌株IPP209-1对梨火疫病的室内防效测定
挑取新鲜的IPP209-1菌株接种至LB液体培养基中，挑取新鲜的梨火疫病菌(Erwinia amylovora)接种至NA液体培养基中，于28 °C、180 r/min震荡培养24 h，测定菌液浓度并调至OD600=1.0。将等体积的IPP209-1菌液（OD600=1.0）和梨火疫病菌菌液（OD600=1.0）混合均匀，取10 μL混合菌液注射至完好的库尔勒香梨上（位置2），然后在同一个库尔勒香梨上与位置2间隔一定的距离注射5 μL梨火疫病菌菌液（OD600=1.0）作为阳性对照（位置1），并与位置2间隔一定的距离注射LB液体培养基和NA液体培养基的1:1混合液10 μL作为阴性对照（位置3）。将接种后的香梨放置于28 °C条件下，于接种后第5天和第7天分别记录发病情况，拍照，并计算防治效果。每个处理重复5次。
防治效果=（只接病菌的病斑直径-同时接种病菌和IPP209-1的病斑直径）/只接病菌的病斑直径*100%）。
结果如图4所示，菌株IPP209-1对梨火疫病的室内防效为85.22%。
实施例4菌株IPP209-1对草莓炭疽病的室内防效测定
将草莓炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)接种在PDA固体培养基上，于28 °C培养8 d，刮取菌丝放入适量无菌水中，用无菌涂布棒搅拌混匀，四层无菌纱布过滤，采用血球计数板统计滤液中的孢子浓度，并用无菌水将孢子悬浮液稀释至1.0×106CFU/mL，备用。挑取新鲜的 IPP209-1菌株接种在LB液体培养基中，于28 °C、180 r/min震荡培养48 h，测定菌液浓度并调至OD600=1.0。将等体积的草莓炭疽病菌孢子悬浮液（1.0×106CFU/mL）和IPP209-1菌液（OD600=1.0）混合均匀，吸取10 μL混合菌液注射至健康草莓植株的叶片上，每个叶片在主叶脉两侧各接种一处。对照1：只注射5 μL草莓炭疽病菌孢子悬浮液（1.0×106CFU/mL）。对照2：注射LB液体培养基和无菌水的1:1混合液10 μL。将接种后的叶片放置于28 °C条件下，于接种后第4天和第6天分别记录发病情况，拍照，并计算防治效果。每个处理重复5次。
防治效果=（只接病菌的病斑直径-同时接种病菌和IPP209-1的病斑直径）/只接病菌的病斑直径*100%）。
结果如图5所示，菌株IPP209-1对草莓炭疽病的室内防效为92.17%。
实施例5菌株IPP209-1在大田防治中的应用
使用菌株IPP209-1进行大田防治前，将菌株IPP209-1经发酵后制备成10亿CFU/mL的水剂（以下简称为IPP209-1水剂）。
梨火疫病的防治：在梨火疫病发病初期，将IPP209-1水剂兑水稀释1000倍，对植株进行喷施，间隔7天喷施1次，连续喷施3次。
番茄青枯病的防治：在番茄播种后10-15天，将IPP209-1水剂兑水稀释300-500倍后对苗床进行泼浇；大田定植缓苗后，将IPP209-1水剂兑水稀释300-500倍后对番茄植株进行灌根；始花期至团棵期，将IPP209-1水剂兑水稀释300-500倍后对番茄植株进行灌根，间隔7天施药1次，共施药3次。在番茄青枯病发病初期，将IPP209-1水剂兑水稀释300-500倍后对植株进行泼浇或灌根，间隔7天施药1次，共施药3次。
Claims (10)
1.一株多粘类芽孢杆菌IPP209-1，其保藏编号为CGMCC No. 29530。
2.一种产品，其包含权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌IPP209-1。
3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品为预防和/或治疗梨火疫病的产品。
4.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品为预防和/或治疗草莓炭疽病的产品。
5.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品为抑制梨火疫病菌、番茄青枯病菌、水稻白叶枯病菌、草莓炭疽病菌、小麦赤霉病菌和/或辣椒疫霉病菌的产品。
6.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品为固体或液体菌剂。
7.制备权利要求2-6任一所述的产品的方法，其包括培养权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌IPP209-1并将其作为活性成分制备所述产品。
8.权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌IPP209-1或权利要求2-6任一所述的产品在预防和/或治疗梨火疫病中的应用。
9.权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌IPP209-1或权利要求2-6任一所述的产品在预防和/或治疗草莓炭疽病中的应用。
10.权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌IPP209-1或权利要求2-6任一所述的产品在抑制梨火疫病菌、番茄青枯病菌、水稻白叶枯病菌、草莓炭疽病菌、小麦赤霉病菌和/或辣椒疫霉病菌中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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