CN112375700A - 一株贝莱斯芽孢杆菌05-1205、获取方法及其应用 - Google Patents

一株贝莱斯芽孢杆菌05-1205、获取方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌05‑1205、获取方法及其应用，属于微生物应用技术领域。所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05‑1205，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M 2020568。获取方法包括分离、筛选、纯化工序，首先从健康烟株中分离内生细菌，以烘烤期烟草霉变病原菌米根霉为指示剂，筛选拮抗米根霉的内生细菌，最后在培养基平板上纯化即得。菌株的应用包括烟草霉变病防治中的应用，所述菌株贝莱斯芽孢杆菌05‑1205能实现对烘烤期烟草霉变病的有效控制，相对防效在70％以上。其次，所述贝莱斯芽孢杆菌05‑1205抑菌谱广，除烘烤期烟草霉变病病原菌外，还对烟草青枯病菌、灰霉病菌、菌核病菌、靶斑病菌、根腐病菌、赤星病菌均具有很好的抑菌作用。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌05-1205、获取方法及其应用
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌05-1205、 获取方法及其应用。
背景技术
烟叶烘烤损失是烟叶在烤房中的非正常烘烤而引起的损失，对烟叶生产和烟 农造成重大损失。近年来，烘烤期烟草霉变病已成为我国福建、云南、广西等南 方部分烟区烘烤环节的重要经济损失之一。烘烤期烟草霉变病主要是由于烟叶烘 烤变黄期低温、高湿，烟叶受米根霉(Rhizopus oryzae)侵染引起。
烘烤期霉变病的防治方法主要包括烘烤设备改进、化学防治和生物防治等。
烘烤设备改进主要是基于现有烤房通风排湿效果差而进行的改进或建立新 型烤房，例如蔡永占等发明了一种防止气流上升式密集烤房烘烤霉烂病的烘烤工 艺(CN111067129A)，例如陈二龙等采用调控密集烤房内气流运动可减轻烟叶霉 变。烘烤工艺或设计的改变对烟草霉变病的防治最为简便、快捷、有效，但成本 较高。
烟草霉变病的化学防治方面研究较多。汪汉成等研究表明米根霉对氟硅唑和 苯醚甲环唑较为敏感。蔡刘体等在离体叶片法防治烟草霉变病，结果表明嘧菌酯、 啶酰菌胺的防效在以上，但未尚不清楚上述药剂在烤房内的防治效果。苏家恩等 在田间、编烟后施用百菌清、多菌灵、甲霜锰锌3种农药杀菌剂均可有效防治红 花大金元烤中霉变病。苏家恩等对抗微生物制剂在烟草霉变病中的应用进行了研 究，结果表明烘烤期烟草霉变病可采用烤前喷施0.5％脱氢乙酸钠溶液或0.2％纳 他霉素溶液进行预防。王永栋等用二氧化氯、三氯异氰尿酸熏蒸装烟后的烤房， 防效在60～70％。虽然烘烤期烟草霉变病的化学防治效果较好，但因其存在农药 残留和容易产生耐药性等问题，影响烟叶的安全性，其应用受到限制。
生物防治由于其防效高、专一性强、环境友好，以及不易产生抗药性等优点， 因而受到青睐。
目前，用于防治烘烤期霉变病的微生物菌剂较少，仅有胶质芽孢杆菌 (Bacillusmucilaginosus)(CN110384247A)、组合微生物菌剂(CN110250209A) 作为生防产品防治烘烤期烟草霉变病的报道。急需研发不同种属的生防菌，为有 效防治烟草烘烤期烟草霉变病提供更多绿色解决方案。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一株能实现高效防治烘烤期霉变病的贝莱斯芽 孢杆菌05-1205。本发明的第二目的在于提供所述贝莱斯芽孢杆菌05-1205的获 取方法。本发明的第三目的在于提供所述贝莱斯芽孢杆菌05-1205在烘烤期烟草 霉变病防治中的应用。本发明的第四目的在于提供所述贝莱斯芽孢杆菌05-1205 在烟草青枯病、灰霉病、菌核病、靶斑病、根腐病、赤星病中的应用。
本发明的第一目的是这样实现的：一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，命名为05-1205，经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的一个株系， 是从烟株组织中分离得到，已于2020年10月5日保藏于中国典型培养物保藏中 心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，中国 典型培养物保藏中心，邮编：430072)，其保藏编号为CCTCC No：M 2020568。
本发明的第二目的是这样实现的：一种所述贝莱斯芽孢杆菌的获取方法，具 体包括以下步骤：
第一步，分离，包括：
(1)取经检验表面灭菌彻底的烟株组织0.4～0.6g，与灭菌钢珠一并放入2 mL灭菌离心管中，加入400～700μL无菌水，用组织研磨器研磨2.5～3.5min， 频率为20～40r/s；
(2)梯度稀释研磨后的组织液至10-4，每梯度各取100～300μL匀浆液涂分 离培养基，每处理重复4次；
(3)经暗培养后，后根据菌落形态、颜色等不同挑取单菌落，重新于分离 培养基上划线纯化，挑取划线培养的单菌落移入分离培养基试管斜面保存；
第二步，筛选，包括：
(1)采用平板对峙法，用直径0.5～0.8cm的打孔器将烟草霉变病菌米根霉 菌丝块贴接于筛选培养基平皿中心，两侧对称划线接种内生细菌，以只接烟草霉 变病菌米根霉菌丝块的处理为对照；
(2)恒温培养，待对照长满全皿时，检查对峙培养结果，记录抑菌带的宽 度，根据两菌菌落发展速度、菌落之间有无抑制带、菌落边缘的菌丝是否发生稀 疏和萎缩的现象等来判断分离的内生细菌对病原菌有无拮抗作用，每个处理3 次重复；
第三步，纯化，包括：
将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落， 即贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205。
在第一步分离中：暗培养条件为：25～30℃，时间36～72h；分离培养基成 分以g/L计为：蛋白胨3.0～7.0，牛肉浸膏2～4.0，氯化钠6.0～10.0，琼脂15～18； 其pH为6.8～7.5。
在第二步筛选中：培养条件为：28℃，时间48～60h；筛选培养基成分以g/L 计为：马铃薯180～220，葡萄糖18～25，琼脂15～18，加蒸馏水至1000mL；其 pH为6.8～7.4。
在第三步纯化中：培养条件为：25～30℃，时间40～55h；纯化培养基成分 以g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0、琼脂15.0～19.0； 其pH为7.0～7.5。
在第一步分离中：所述的烟株组织为烤烟“红花大金元”的叶片和/或茎。
本发明的第三目的是这样实现的：一种所述贝莱斯芽孢杆菌05-1205在烘烤 期烟草霉变病防治中的应用，具体包括以下步骤：
步骤a，发酵，包括：
(1)将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205接种到斜面培养基上， 得到发酵种子；
(2)将发酵种子接种到种子培养液中，接种量为3～5v/v％，摇瓶装液量为 25～35v/v％，得到发酵菌剂；
步骤b，接种，包括：
在烟叶编制成杆前或编制后，将发酵菌剂稀释1～4倍，按照每杆烟50～200 mL喷施烟叶叶柄伤口处；
步骤c，调制，包括：
烟叶经喷施过发酵菌剂的按正常调制程序烘烤。
在步骤a发酵中：培养条件为：25～30℃，时间48～72h；斜面培养基成分以 g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0、琼脂15.0～19.0， pH 7.0～7.5；所述的发酵菌剂的有效活菌数为1×1010～1×1012CFU/mL。
在步骤b接种中：培养条件为：25～30℃，时间48～72h；种子培养液成分 以g/L计为：胰蛋白胨8.0～12.0、酵母浸膏4.0～6.0、氯化钠4.0～6.0，pH 7.0～7.5； 所述的接种还可以在编制过程中、装烟过程中或烘烤前进行。
步骤c调制中，对于在编制过程中的烟叶，无需设定特殊调制条件，对于在 装烟过程中或烘烤前接种的烟叶，需控制菌剂喷施量不宜超过150mL/杆，并按 正常调制条件烘烤7～11d；所述的调制指的是由鲜烟叶到干烟叶的过程，包括烤 烟的烘烤、晾晒烟的晾晒及烟叶的调制后陈化过程。
本发明的第四目的是这样实现的：一种所述贝莱斯芽孢杆菌05-1205在防治 烟草青枯病(Ralstonia pseudosolanacearum)、烟草灰霉病(Botrytis cinerea)、烟 草菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)、烟草靶斑病(Thanatephorus cucumeris)、烟 草根腐病(Fusarium oxysporum)和/或烟草赤星病(Alternaria alternata)中的应 用，
具体包括：
筛选：采用平板对峙法，用直径0.5～0.8cm的打孔器将烟草霉变病菌米根霉 菌丝块贴接于筛选培养基平皿中心，两侧对称划线接种内生细菌，以只接烟草青 枯病菌、黑胫病菌、灰霉病菌、菌核病菌、靶斑病菌、根腐病菌、赤星病菌菌丝 块的处理为对照。恒温培养，待对照长满全皿时，检查对峙培养结果，记录抑菌 带的宽度，根据两菌菌落发展速度、菌落之间有无抑制带、菌落边缘的菌丝是否 发生稀疏和萎缩的现象等来判断分离的内生细菌对病原菌有无拮抗作用，每个处 理3次重复；
培养条件为：28℃，时间48～60h；
筛选培养基成分以g/L计为：马铃薯180～220，葡萄糖18～25，琼脂15～18， 加蒸馏水至1000mL，pH 6.8～7.4。
本发明所述贝莱斯芽孢杆菌05-1205可应用于烘烤期烟草霉变病的防治，具 有以下优点：
1、本发明所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205是一种烘烤期 烟草霉变病的高效生防菌，对烟叶调制过程中霉变病的相对防效在70％以上；
2、本发明所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205能在含有0～85g/L氯化钠，pH 3.0～10.0的培养基中生长，生长温度范围为4～60℃，具有 良好的抗逆性，能充分适应烟叶调制过程中的温、湿度环境变化和水、热交换特 点，定殖效果好，活性高；
3、本发明所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205大量存在于烟 株与土壤中，来源广泛，易于分离、培养；
4、本发明所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205生产工艺简单，成本低廉，施用便利，且所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205处 理的烟叶无农药残留，对人、畜无害，有利于该菌株的工业化生产和应用普及；
5、本发明所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205具有广谱性杀 菌作用，对包括烟草青枯病菌(Ralstonia pseudosolanacearum)、烟草灰霉病菌 (Botrytiscinerea)、烟草菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、烟草靶斑病菌 (Thanatephoruscucumeris)、烟草根腐病菌(Fusarium oxysporum)、烟草赤星病 菌(Alternariaalternata)均具有较强的抑菌能力，即对上述6种烟草病害具有较 好的生防潜力。
附图说明
图1为实施例1的贝莱斯芽孢杆菌05-1205与米根霉菌对峙培养菌落形态对 比图。
图2为实施例2的贝莱斯芽孢杆菌05-12052培养48h的菌落形态及芽孢染 色图。
图3为利用MEGA7软件构建的系统发育树。
附图标记：培养皿中培养48h的菌落形态X1，养皿中培养48h的菌落形态局 部放大图X2，芽孢染色图Y。
具体实施方式
下面对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本 发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205，已在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC No：M 2020568。
所述菌株为革兰氏阳性，芽孢椭圆形中生或端生，不膨大，芽孢比菌体小， 存在于菌体中，在培养基上菌落呈圆形，直径2～4mm，扁平，中间有褶皱，乳 白色，有光泽，边缘不整齐，为好氧菌。所述菌株可在含有0～85g/L氯化钠， pH 3.0～10.0的培养基中生长，生长温度范围为4～60℃。
所述菌株对烟草霉变病菌(Rhizopus oryzae)、烟草青枯病菌(Ralstoniapseudosolanacearum)、烟草灰霉病菌(Botrytis cinerea)、烟草菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、烟草靶斑病菌(Thanatephorus cucumeris)、烟草根腐病菌(Fusariumoxysporum)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)具有较强的抑制能力。
所述菌株对烘烤期烟草霉变病的相对防效在70％以上。
所述菌株的获取方法，包括分离、筛选及纯化工序，具体包括：
A、分离：取经检验表面灭菌彻底的烟株组织0.4～0.6g，与灭菌钢珠一并放 入2mL灭菌离心管中，加入400～700μL无菌水，用组织研磨器研磨2.5～3.5min， 频率为20～40r/s。梯度稀释研磨后的组织液至10-4倍，每梯度各取100～300μL 匀浆液涂分离培养基，每处理重复4次。暗培养36～72h后根据菌落形态、颜色 等不同挑取单菌落，重新于分离培养基上划线纯化，挑取划线培养的单菌落移入 分离培养基试管斜面保存；
培养条件为：25～30℃，时间36～72h；
分离培养基成分以g/L计为：蛋白胨3.0～7.0，牛肉浸膏2.0～4.0，氯化钠 6.0～10.0，琼脂15～18，pH 6.8～7.5；
B、筛选：采用平板对峙法，用直径0.5～0.8cm的打孔器将烟草霉变病菌菌 丝块贴接于筛选培养基平皿中心，两侧对称划线接种内生细菌，以只接烟草霉变 病菌米根霉菌丝块的处理为对照。恒温培养，待对照长满全皿时，检查对峙培养 结果，记录抑菌带的宽度，根据两菌菌落发展速度、菌落之间有无抑制带、菌落 边缘的菌丝是否发生稀疏和萎缩的现象等来判断分离的内生细菌对病原菌有无 拮抗作用，每个处理3次重复；
培养条件为：25～30℃，时间48～60h；
筛选培养基成分以g/L计为：马铃薯180～220，葡萄糖18～25，琼脂15～18， 加蒸馏水至1000mL，pH 6.8～7.4；
C、纯化：将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛 的单菌落，即贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205；
培养条件为：25～30℃，时间40～55h；
纯化培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠 4.0～6.0、琼脂15.0～19.0，pH 7.0～7.5。
步骤A所述的烟株组织为烟株的叶片或茎。
步骤A所述的烟株组织优选为烤烟“红花大金元”的叶片或茎。所述的植 烟土壤为烤烟“红花大金元”的植烟土壤。
步骤A所述的分离优选将0.4g，与灭菌钢珠一并放入2mL灭菌离心管中， 加入600μL无菌水，用组织研磨器研磨3min，频率为30r/s。获得组织匀浆。
步骤A所述的室温指的是20～25℃。
步骤A所述的培养条件优选为28℃，时间48h。
步骤B所述的烟草霉变病病原为米根霉(Rhizopus oryzae)。
步骤B所述的培养条件优选为28℃，时间48h。
步骤C所述的培养条件优选为28℃，时间48h。
一种贝莱斯芽孢杆菌05-1205在烟草霉变病防治中的应用，包括发酵、接种 及调制工序，具体包括：
a、发酵：首先将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205接种到斜面 培养基上，得到发酵种子；
培养条件为：25～30℃，时间48～72h；
斜面培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠 4.0～6.0、琼脂15.0～19.0，pH 7.0～7.5；
然后将发酵种子接种到种子培养液中，接种量为3～5v/v％，摇瓶装液量为 25～35v/v％，得到发酵菌剂；
培养条件为：25～30℃，时间48～72h；
种子培养液成分以g/L计为：胰蛋白胨8.0～12.0、酵母浸膏4.0～6.0、氯化钠 4.0～6.0，pH 7.0～7.5；
b、接种：在烟叶编制成杆前或编制后，将发酵菌剂稀释1～4倍，按照每杆 烟50～200mL进行喷施；
c、调制：喷施过发酵菌剂的烟叶按正常调制程序烘烤7～11d，即可实现烟 草霉变病的有效防控。
步骤a所述的发酵，摇瓶转速为180～225r/min。
步骤a所述的培养条件优选为28℃，时间24h。
步骤a所述的发酵菌剂的有效活菌数为1×1010～1×1012CFU/mL。
步骤b所述的接种也可以在编烟过程中、装烟过程中或烘烤前进行。
步骤b及步骤c所述的烟叶包括烤烟、雪茄烟、白肋烟或晒烟中的任一种。
步骤b及步骤c所述的烟叶优选烤烟。
步骤b所述的调制指的是由鲜烟叶到干烟叶的过程，具体为烤烟的烘烤过程、 晾晒烟的晾晒及烟叶的调制后陈化过程。
步骤c所述的调制，对于在编制过程中的烟叶，无需设定特殊调制条件，对 于在装烟过程中或烘烤前接种的烟叶，需控制菌剂喷施量不宜超过150mL/杆， 并按正常调制条件烘烤7～11d。
步骤c所述的调制，喷施过发酵菌剂的烟叶保持7～11d的调制时间后，烟 草霉变病相对防效在70％以上。
下面结合具体的实施例对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明：
实施例1
——贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205的获取
A、分离：取经检验表面灭菌彻底的烟株的茎0.4g，与灭菌钢珠一并放入2 mL灭菌离心管中，加入600μL无菌水，用组织研磨器研磨3min，频率为30r/s。 梯度稀释研磨后的组织液至10-4，每梯度各取200μL匀浆液涂分离培养基(蛋 白胨5.0g/L，牛肉浸膏3.0g/L，氯化钠8.0g/L，琼脂15.0g/L，pH 7.05)，每处 理重复4次。28℃暗培养48h后根据菌落形态、颜色等不同挑取单菌落，重新 于分离培养基上划线纯化，挑取划线培养的单菌落移入分离培养基试管斜面保存；
B、筛选：采用平板对峙法，用直径0.8cm的打孔器将烟草霉变病菌菌丝块 贴接于筛选培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，加蒸馏水至1000mL， pH 7.2)平皿中心，在距菌饼中心3.5cm的两侧对称划线接种内生细菌，以只接 烟草霉变病菌米根霉菌丝块的处理为对照。28℃恒温培养，待对照长满全皿时， 检查对峙培养结果，记录抑菌带的宽度，根据两菌菌落发展速度、菌落之间有无 抑制带、菌落边缘的菌丝是否发生稀疏和萎缩的现象等来判断分离的内生细菌对 病原菌有无拮抗作用，每个处理3次重复。
C、纯化：将筛选到的菌株用纯化培养基(蛋白胨10.0g/L、牛肉浸膏3.0g/L、 氯化钠5.0g/L、琼脂15g/L，pH 7.2)平板进行划线纯化，置于28℃培养48h， 获得长势旺盛的单菌落。
试验结果：结果从216株烟草内生细菌中筛选出一株对烟草霉变病具有良好 抑菌能力的菌株，命名为05-1205。菌株05-1205与米根霉(Rhizopus oryzae)对 峙培养时(图1左图)，米根霉的气生菌丝体稀疏，仅在菌饼周围形成菌丝，而 在对照平板(图1右图)中菌丝已布满培养皿；米根霉在平板内的生长也受到限 制，菌株05-1205拮抗米根霉在培养基内的生长可形成的平均抑菌带为5.00mm (表1和附图1)。菌株05-1205不仅抑制米根霉气生菌丝的生长，还抑制菌丝在 培养基内的生长，说明菌株05-1205可能通过多种机制抑制米根霉。
表1 05-1205菌株对烟草霉变病的拮抗作用试验结果
Figure BDA0002772853980000091
实施例2
——贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205的鉴定与保藏
(1)贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205的鉴定
对上述选育的菌株05-1205，通过常规方法进行生物学和生理生化特性检测 与分子生物学方法鉴定。分子鉴定方法如下：细菌基因组DNA的提取试剂盒， 方法参见试剂盒说明书。PCR扩增选用引物F27/R1492，常规条件扩增，扩增产 物经胶回收后，连接于载体pEAZY-T5 Zero载体，热激转化大肠杆菌感受态细 胞DH5α，挑取菌落以M13F/M13R为引物进行菌落PCR鉴定。阳性克隆送上海 英骏生物技术有限公司进行序列测定。
试验结果记录如下：
1、培养特征：该菌株于28℃在NA平板培养基上培养，培养初期菌落淡乳 白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落淡 黄色，菌落扁平，边缘不整齐，表面干燥且有褶皱(见附图2)；在液体培养基 中静止培养，表面形成白色菌膜。上述形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》(东 秀珠等编著.科学出版社.2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步 判断05-1205菌株为芽孢杆菌。
2、形态特征：该菌株于28℃培养，在显微镜下，芽孢中生或端生，椭圆形， 不膨大，芽孢比菌体小。抗酸染色阴性，无伴胞晶体，能运动，鞭毛周生。菌体 平均大小为0.60～0.70μm×2.0～2.8μm，革兰氏染色为阳性。
3、稳定性特征：该菌株可在含有0～85g/L氯化钠，pH 3.0～10.0的培养 基中生长，生长温度范围为4～60℃，最适宜生长温度为28～35℃，最适宜pH 值为7.0～7.2。
4、16S rDNA序列分析：将该菌株的16S rDNA序列与Ezbiocloud数据库 (https://www.ezbiocloud.net/)收录的序列比对，其与芽孢杆菌属的16S rDNA序 列同源性达到，其与标准菌株Bacillus velezensis CR-502序列同源性为99.93％， 与Bacillus subtilis模式菌株NCIB 3610、Bacillus siamensis模式菌株KCTC 13613 序列同源性为99.79％，与Bacillus nematocida模式菌株B-16序列同源性为 99.72％，与Bacillusamyloliquefaciens模式菌株DSM 7序列同源性为99.65％。 运用NCBI在线分析工具BLASTn比对rRNA/ITS数据库，发现05-1205菌株16S rDNA序列与Bacillus velezensis菌株CBMB205序列同源性为99.93％，与Bacillus velezensis菌株FZB42序列同源性最高为99.86％。上述结果说明菌株05-1205的 16S rDNA序列与Bacillus velezensis同源性最高。利用MEGA7软件构建系统发 育树，结果(见图1)05-1205菌株与4株Bacillusvelezensis和1株Bacillus siamensis 聚为一支。
该菌株通过序列比对和生物学特性将05-1205菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。
本发明所述的05-1205菌株其16S rDNA序列见序列表。
(2)贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205的保藏
通过上述鉴定结果，确认菌株05-1205为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的一个株系，命名为05-1205。已于2020年10月5日保藏于中国典型培养物保 藏中心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学， 中国典型培养物保藏中心，邮编：430072)，其分类命名为Bacillus velezensis 05-1205，其保藏编号为CCTCC No：M2020568。
实施例3
——贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205对烘烤期烟草霉变病的 防治试验
试验在云南省大理州下关市凤仪镇进行，供试烟叶为烤烟品种“红花大金元” 中部烟叶。
试验方法：
a、发酵：从-80℃超低温冰箱活化菌株05-1205于斜面培养基(蛋白胨10.0 g/L、牛肉浸膏3.0g/L、氯化钠5.0g/L、琼脂15.0g/L，pH 7.0)，置于28℃恒温 培养箱培养48h；挑取一环菌接种于含有10mL种子培养液(蛋白胨10.0g/L、 牛肉浸膏3.0g/L、氯化钠5.0g/L、琼脂15.0g/L，pH 7.0)的50mL离心管内， 置于28℃恒温培养箱培养24h；再将种子液转接至含有1000mL发酵培养基中 (蛋白胨10.0g/L、牛肉浸膏3.0g/L、氯化钠5.0g/L、琼脂15.0g/L，pH 7.0)， 置于28℃恒温培养箱培养72h，得到发酵菌剂；
b、接种：试验在大理州下关市凤仪镇进行，在烟叶编制成杆编制后，将发 酵菌剂按照每杆烟200mL进行喷施于叶柄的伤口处，并以发酵培养基喷施叶柄 的处理为对照，每处理10杆烟，每处理重复3次；
c、调制：喷施过发酵菌剂的烟叶按正常调制程序烘烤9d，调制完毕后调查 各处理的发病等级，并计算病情指数和相对防效。烟叶发病程度按病害等级划分 为0、1、3、5、7和9级(表2)，病情指数＝100×∑(各级病株数×各级代表 值)/(调查总株数×最高级代表值)，生防菌相对防效＝100×(对照组病情指数- 处理组病情指数)/(对照组病情指数)。
表2烟叶霉烂病病情等级划分
病情等级 霉变发生情况
0 正常烟叶
1 烟柄发霉小于1cm，叶片不发病
3 烟柄发霉大于1cm，叶片不发病
5 烟柄发霉，且叶片发霉面积达1％～25％以上
7 烟柄发霉，且叶片发霉面积达26％～50％以上
9 烟柄发霉，且叶片发霉面积达50％以上
试验结果：由表3数据可知，菌株05-1205对烘烤期烟草霉变病的防治效果 较好。经烟叶编制成杆后喷施05-1205发酵液的处理，烘烤后调查病情指数为 18.52；而喷施发酵液培养基的处理病情指数为62.96。结果表明，经05-1205菌 剂发酵液处理烟叶的叶柄，可有效防治烟草霉变病的发生，相对防效达70.58％。
表3菌株05-1205对烟草霉变病防效的对比试验结果
处理 病情指数 相对防效(％)
05-1205液体制剂 18.52b 70.58％
CK 62.96a -
实施例4
——贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205对烘烤期烟草霉变病的 防治试验
实施例4除以下试验及结果不同外，其余操作步骤与实施例3相同。
1、试验在云南省大理州南涧县南涧镇进行，烟叶为“红花大金元”上部叶 片。
2、试验在烟叶编制成杆后，采用菌株05-1205发酵液2倍稀释液，每杆烟 75mL喷施于叶柄处。
3、试验中菌株05-1205发酵液共处理80杆烟；对照不经任何处理以自然发 病。
表4菌株05-1205对烟草霉变病防效的对比试验结果
Figure BDA0002772853980000121
试验结果：试验共处理80杆烟，其中49杆未发病，31杆病害等级为1级， 发病率为38.75％，病情指数为4.31；对照共81杆，其中11杆未发病，40杆为 1级，剩余30杆为3级，发病率为86.42％，病情指数为17.83。从相对防效上看， 05-1205发酵液2倍稀释液对烘烤期烟草霉变病的相对防效为75.85％。贝莱斯芽 孢杆菌05-1205对烘烤期烟草霉变病防治的效果较好，具有较好的开发潜力。
实施例5
——贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205对7种烟草病原菌的抑 制试验
实施例5除以下试验及结果不同外，其余操作步骤与实施例1相同。
1、试验中取烟草青枯病菌(Ralstonia pseudosolanacearum)液稀释至10-4， 取200μL涂布于筛选培养基平板，置于超净台晾干，用无菌牙签挑取待测生防 细菌的单菌落接种于筛选培养基表面距培养皿中心2.50cm的距离处，每皿对称 接种4点，晾干后正置于28℃培养箱培养48h。
2、试验中分别以烟草黑胫病菌、烟草灰霉病菌、烟草菌核病菌、烟草靶斑 病菌、烟草根腐病菌、烟草赤星病菌为指示菌，检测05-1205菌株对上述病原菌 的抑菌能力。
试验结果：从表5可见，贝莱斯芽孢杆菌05-1205对供试的6种重要的烟草 病害病原菌均具有较强的抑菌作用，其中05-1205菌株对烟草青枯病菌(Ralstoniapseudosolanacearum)、烟草靶斑病菌(Thanatephorus cucumeris)、烟草根腐病菌(Fusarium oxysporum)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)均有较强的抑制 能力，即对上述4种烟草病害具有较好的生防潜力；05-1205菌株对烟草灰霉病 菌(Botrytiscinerea)、烟草菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)的抑制能力有限， 05-1205菌株对烟草黑胫病菌(Phylophthora nicotianae)的两个生理小种均无拮 抗作用。
表5贝莱斯芽孢杆菌05-1205对7种烟草病原菌的抑制能力
Figure BDA0002772853980000131
SEQUENCE LISTING
<110> 云南省烟草农业科学研究院
<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌05-1205、获取方法及其应用
<130> 2020-11-05
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1420
<212> DNA
<213> Bacillus velezensis
<400> 1
tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60
acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120
atggttgttt gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180
ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag 240
ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300
ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360
gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc cgttcaaata 420
gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540
tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600
aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660
tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa 720
gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780
agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840
gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900
catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960
tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020
gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg 1080
ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140
tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacagaa 1200
caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc 1260
gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320
cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1380
cccgaagtcg gtgaggtaac cttttaggag ccagccgccg 1420

Claims (10)

1.一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205，已在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC No：M 2020568。
2.一种权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌05-1205的获取方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
第一步，分离，包括：
(1)取经检验表面灭菌彻底的烟株组织0.4～0.6g，与灭菌钢珠一并放入2mL灭菌离心管中，加入400～700μL无菌水，用组织研磨器研磨2.5～3.5min，频率为20～40r/s；
(2)梯度稀释研磨后的组织液至10-4，每梯度各取100～300μL匀浆液涂分离培养基，每处理重复4次；
(3)经暗培养后，后根据菌落形态、颜色等不同挑取单菌落，重新于分离培养基上划线纯化，挑取划线培养的单菌落移入分离培养基试管斜面保存；
第二步，筛选，包括：
(1)采用平板对峙法，用直径0.5～0.8cm的打孔器将烟草霉变病菌米根霉菌丝块贴接于筛选培养基平皿中心，两侧对称划线接种内生细菌，以只接烟草霉变病菌米根霉菌丝块的处理为对照；
(2)恒温培养，待对照长满全皿时，检查对峙培养结果，记录抑菌带的宽度，根据两菌菌落发展速度、菌落之间有无抑制带、菌落边缘的菌丝是否发生稀疏和萎缩的现象等来判断分离的内生细菌对病原菌有无拮抗作用，每个处理3次重复；
第三步，纯化，包括：
将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，即贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205。
3.如权利要求2所述的获取方法，其特征在于，在第一步分离中：
暗培养条件为：25～30℃，时间36～72h；
分离培养基成分以g/L计为：蛋白胨3.0～7.0，牛肉浸膏2～4.0，氯化钠6.0～10.0，琼脂15～18；其pH为6.8～7.5。
4.如权利要求2所述的获取方法，其特征在于，在第二步筛选中：
培养条件为：28℃，时间48～60h；
筛选培养基成分以g/L计为：马铃薯180～220，葡萄糖18～25，琼脂15～18，加蒸馏水至1000mL；其pH为6.8～7.4。
5.如权利要求2所述的获取方法，其特征在于，在第三步纯化中：
培养条件为：25～30℃，时间40～55h；
纯化培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0、琼脂15.0～19.0；其pH为7.0～7.5。
6.如权利要求2至5任意一项所述的获取方法，其特征在于，在第一步分离中：所述的烟株组织为烤烟“红花大金元”的叶片和/或茎。
7.一种如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌05-1205在烘烤期烟草霉变病防治中的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤a，发酵，包括：
(1)将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205接种到斜面培养基上，得到发酵种子；
(2)将发酵种子接种到种子培养液中，接种量为3～5v/v％，摇瓶装液量为25～35v/v％，得到发酵菌剂；
步骤b，接种，包括：
在烟叶编制成杆前或编制后，将发酵菌剂稀释1～4倍，按照每杆烟50～200mL喷施烟叶叶柄伤口处；
步骤c，调制，包括：
烟叶经喷施过发酵菌剂的按正常调制程序烘烤。
8.如权利要求7所述的贝莱斯芽孢杆菌在烟草霉变病防治中的应用，其特征在于，
在步骤a发酵中：
培养条件为：25～30℃，时间48～72h；
斜面培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0、琼脂15.0～19.0，pH 7.0～7.5；
所述的发酵菌剂的有效活菌数为1×1010～1×1012CFU/mL；
在步骤b接种中：
培养条件为：25～30℃，时间48～72h；
种子培养液成分以g/L计为：胰蛋白胨8.0～12.0、酵母浸膏4.0～6.0、氯化钠4.0～6.0，pH 7.0～7.5。
9.如权利要求8所述的贝莱斯芽孢杆菌在烟草霉变病防治中的应用，其特征在于：
步骤b接种中，所述的接种还可以在编制过程中、装烟过程中或烘烤前进行；步骤c调制中，对于在编制过程中的烟叶，无需设定特殊调制条件，对于在装烟过程中或烘烤前接种的烟叶，需控制菌剂喷施量不宜超过150mL/杆，并按正常调制条件烘烤7～11d；
所述的调制指的是由鲜烟叶到干烟叶的过程，包括烤烟的烘烤、晾晒烟的晾晒及烟叶的调制后陈化过程。
10.一种如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌05-1205在防治烟草青枯病(Ralstoniapseudosolanacearum)、烟草灰霉病(Botrytis cinerea)、烟草菌核病(Sclerotiniasclerotiorum)、烟草靶斑病(Thanatephorus cucumeris)、烟草根腐病(Fusariumoxysporum)和/或烟草赤星病(Alternaria alternata)中的应用。
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