CN110117556A - 一种高效产脂肽类物质的生防菌hn-2及发酵工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物领域，特别是一种高效产脂肽类物质的生防菌，为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）HN‑2，于2018年06月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018382。本发明还公开了贝莱斯芽孢杆菌HN‑2的发酵工艺。通过活性测定，发现该菌株发酵液的提取物在烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）侵染烟草时对烟草有保护作用，可诱导烟草防卫反应，提高烟草对TMV的抗性，具有较高的经济效益。

Description

一种高效产脂肽类物质的生防菌HN-2及发酵工艺
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别是一种高效产脂肽类物质的生防菌HN-2及发酵工艺。
背景技术
烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）所引起的花叶病毒病是一种在全世界各烟区普遍发生、局部地区严重流行的烟草病害。烟草发病时出现叶片薄厚不匀，颜色黄绿相间，呈花叶状。后花叶斑驳程度加大，并现大面积深褐色坏死斑，中下部老叶尤甚，发病重的叶片皱缩、畸形、扭曲。当前前防治烟草花叶病毒病的方法主要是通过田间管理和栽培耐病品种。通过适当浓度的甾醇烯ME和宁南霉素AS的处理效果也可达70%以上（陈杰，2018）。目前李成军等人通过室内盆栽和大田试验进行了高温胁迫诱导烟草对烟草花叶病毒的抗性效应研究（李成军、孟颢杰等，2018），使得人工诱导增强烟草对烟草花叶病毒抗性成为可能。
芽孢杆菌能产生丰富的抗菌物质，包括脂肽类、聚酮类、肽类、磷脂类和多烯类等，这些物质在防治植物病害中起着重要作用，是新型农药研究的热点。其中，最典型的是通过非核糖体途径合成的脂肽类抗生素( lipopeptides)，包括表面活性素( Surfactin) 、伊枯草菌素( Iturin) 和泛革素( Fengycin) 3 类。模式菌株枯草芽胞杆菌 B. subtilis168（B168）的全基因组序列已在 1997 年完成。该菌株具有完整的 surfactin 编码基因srfA、srfB、srfC 和 srfD 等，但由于B168的sfp基因的自发突变，导致sfp 基因合成的4′-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶不能合成，进一步使surfactin 的合成酶无法激活，导致B168菌株无法合成脂肽类物质，丧失抑菌能力。
发明内容
本发明提出一种新的贝莱斯芽孢杆菌HN-2，虽然缺失脂肽类合成关键酶基因sfp基因，但是其发酵液中仍含有表面活性素类物质，可以提高烟草对TMV的抗性。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种高效产脂肽类物质的生防菌，其为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）HN-2，于2018年06月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2018382。
所述的高效产脂肽类物质的生防菌的发酵工艺，包括以下步骤：
将所述的贝莱斯芽孢杆菌HN-2加入到液体的LB培养基中，摇床26-30℃，150-200r/min摇菌1-3天，即得到发酵液。
进一步，所述的发酵工艺还包括活化前处理：将以上所述的贝莱斯芽孢杆菌HN-2先接种于LB培养基上25-30℃活化培养1-3天；所述的LB培养基配方为（1L）：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，pH7.0。
一种提取以上所述的贝莱斯芽孢杆菌HN-2发酵液中提取物的提取方法，包括以下步骤：
取以上制得的贝莱斯芽孢杆菌HN-2的发酵液，发酵液离心去除菌体，保留上清液即无菌体发酵液；无菌体发酵液加入正丁醇萃取，取上层正丁醇层，去除正丁醇，干燥，即得。
进一步，发酵液离心条件为：10000转每分钟离心10分钟；无菌体发酵液与加入的正丁醇的体积比为1:1；所述的干燥方法为冷冻干燥。
上述提取方法制得的贝莱斯芽孢杆菌HN-2发酵液提取物在制备诱导烟草提高对烟草花叶病毒抗性的制剂上的应用。
进一步，使用时，将贝莱斯芽孢杆菌HN-2发酵液提取物溶解后，在未烟草感染病毒，喷洒烟草叶片上。
上述提取方法制得的贝莱斯芽孢杆菌HN-2发酵液提取物在制备防治烟草花叶病毒抗性的制剂上的应用。
进一步，在防治烟草花叶病毒时，将贝莱斯芽孢杆菌HN-2发酵液提取物溶解后，在烟草感染病毒之后，喷洒烟草叶片上。
进一步，喷洒时，贝莱斯芽孢杆菌HN-2发酵液提取物的浓度为50 mg/mL。
本发明的有益效果：
本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌HN-2是豇豆中分离筛选得到的，通过形态学和分子生物学鉴定，该菌株为一种新的贝莱斯芽孢杆菌，进一步试验发现目标菌株HN-2缺失脂肽类合成关键酶基因sfp基因，但是具有lpa基因，并通过现代的仪器分析手段在HN-2发酵液中检测到了表面活性素等脂肽类物质。本发明还公开了上述菌株的发酵工艺。通过活性测定，发现该菌株发酵液的提取物在TMV病毒侵染烟草时对烟草有保护作用，可诱导烟草防卫反应，提高烟草对TMV的抗性。经过成本核算用Luria-Bertani培养基发酵制取发酵液提取物，提取物产量高，发酵成本低，具有较高的经济效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为 HN-2菌株形态学鉴定，其中，A:HN-2菌株菌落图；B:HN-2菌株革兰氏染色；C：HN-2菌株鞭毛染色；
图2为16srDNA基因的PCR检测，其中，M：2000bp Marker；A:HN-2菌株；
图3为 HN-2飞行时间质谱图，
图4为HN-2菌株抗生素合成与调节相关基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
其中，m:2000Marker A:HN-2-srfAB基因 B: HN-2-ituA基因 C:HN-2-ituB基因 D:HN-2-ituC基因 E:HN-2-ituD基因 F: HN-2-fenB基因 G:HN-2-fenD基因 H: HN-2-bamC基因 I:HN-2-qk基因 J:HN-2-sboA基因 K:HN-2-yndj基因 L: HN-2-sfp基因 M:HN-2-ituA调节基因 N:HN-2-mycB调节基因 O:HN-2-fenB调节基因 P：HN-2-lpa调节基因；
图5为HN-2菌株lpa基因二级结构，其中，H:α螺旋 S:β折叠 C：无规卷曲；
图6为lpa和sfp基因编码蛋白质的蛋白质B-factor差异（红框为差异部分），其中，A:HN-2菌株中的lpa基因编码的蛋白 B:FZB42菌株中的sfp基因编码的蛋白；
图7为.lpa和sfp基因编码蛋白质的蛋白质立体结构（白框为差异部分），其中，A:HAB-2菌株中的lpa基因编码的蛋白 B:FZB42菌株中的sfp基因编码的蛋白；
图8为HN-2发酵液提取物诱导烟草防卫反应试验，其中，（1）只涂抹无菌水（2）只涂抹HN-2提取物，（3）只接种100μL TMV结果，（4）涂抹HN-2正丁醇提取物30min后接种TMV，（5）涂抹提取物1h再接种TMV，（6）接种TMV后30min涂抹提取物。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、菌种鉴定
（1）形态学鉴定
HN-2菌株在LB固体培养基上单菌落前期呈半透明乳白色，后期表面干燥且中间突起有皱褶且边缘不规则。经革兰氏染色后呈紫色，为革兰氏阳性菌。菌体为杆状，极生单根鞭毛。
（2）16srDNA分析
以HN-2菌株DNA为模板，采用16srDNA通用引物27F/1492R进行PCR扩增。电泳结果显示在靠近2000bp处有一条明亮条带。通过BLAST比对分析，与之同源性极高的为解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。与Bacillus subtilis FZB42的同源性均达到100%。
二、飞行时间质谱
根据飞行时间质谱测试得到分子量的结果进行比对我们可知并可以产生脂肽类物质的有： C14-IturinA, C15-IturinA, C15-IturinB, C14-Mycosubtilin, C15-Mycosubtilin,C14-BacillomycinF, C16-BacillomycinD, C15-SurfactinA, C16-SurfactinB, C15-SurfactinC. 根据测试的结果证明HN-2正丁醇提取物的主要成分除了检测到了表面活性素类脂肽物质SurfactinA、B、C以外，还检测到了伊枯草菌素IturinA、B，杆菌抗霉素BacillomycinD、F以及抗霉枯草菌素Mycosubtilin。
三、HN-2菌株脂肽类关键合成酶基因的序列检测及脂肽类关键合成酶基因的序列分析
如图，实验挑选出16对有代表性的脂肽类合成过程中的关键合成酶基因和调节基因（分别代表伊枯草菌素Iturin，表面活性素Surfactin、丰原素Fengycin）序列进行PCR。实验结果表明：HN-2菌株可以PCR得到脂肽类物质合成相关物质基因：ituA基因、ituB基因、ituC基因、ituD基因、bamC基因、fenD基因和yndj基因。将扩增到的各基因片段测序后在NCBI上进行BLAST同源性分析，结果表明：HN-2菌株ituD基因片段（885bp）与基因编号为CP028439.1的菌株ituD基因同源性达到99%；HN-2菌株ituB基因片段（508bp）与B. velezensis CMT-6菌株的ituB基因（CP025341.1）的同源性达到99%；HN-2菌株ituC基因片段（575bp）与基因编号为CP028439.1的菌株ituC基因同源性达到99%；HN-2菌株ituA基因片段（885bp）与B. methylotrophicus B25菌株的ituA基因（LN999829.1）的同源性达到100%；HN-2菌株fenD基因片段（293bp）与B. velezensis Hx05菌株的fenD基因（CP029473.2）同源性达到100%；HN-2菌株yndj基因片段（212bp）与B. amyloliquefaciens JK6菌株yndj基因（KR149336.1）同源性达到100%。
通过扩增HN-2菌株中抗菌物质合成酶相关基因，并将扩增得到的基因片段进行测序，在NCBI上进行BLAST同源性分析，结果表明：HN-2菌株基因组中含有ituA基因（1150bp）、mycB基因（2024bp）、fenB基因（1400bp）和lpa基因（675bp）。
sfp基因编码4̍-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，是芽孢杆菌表面活性素家族代谢过程关键酶。通过序列检测发现本菌株HN-2没有sfp基因，但具有lpa基因，同时经过现代波谱技术飞行时间质谱测试提取物的成分后，在有效成分中含有表面活性素等脂肽类物质，这就说明本菌株具有其他的产生表面活性素类物质的途径。
Lpa基因是一类与sfp基因家族同源性较近的一个基因家族，本实验室前期在解淀粉芽孢杆菌HAB-2中发现了该基因，并通过分子生物学的方法验证了lpaH2基因在功能上可以起到与sfp基因相同的活性功能，可以编码构型类似的蛋白质，但通过进一步蛋白质预测发现二者还是具有一定的差异，但是本研究发现贝莱斯崖柏杆菌HN-2中也出现了缺失sfp基因但具有lpa基因的情况，十分新颖具有一定的研究潜力。
四、HN-2菌株脂肽类关键合成酶基因lpa基因蛋白质预测
将HN-2的脂肽类物质合成基因lpa基因编码蛋白的结构进行预测，通过与模式菌株FZB42的sfp基因进行比对，发现其与FZB42菌株中含有的sfp基因编码的蛋白有明显的差异。HN-2菌株lpa基因二级结构如图5所示。
（1）HN-2菌株lpa基因与FZB42菌株sfp基因比较
温度因子B-factor的概念起源于晶体研究，主要是用来体现晶体原子构想状态的一种模糊程度，实际上反映了蛋白质分子在晶体结构中的构想状态，B-factor越高，模糊度越大，相应部位的构象就越不稳定或柔性越弱。通过比较lpa基因和sfp基因，可以发现两基因在螺旋结构上存在两处明显差异。可进一步说明lpa基因与sfp基因编码的蛋白质在构象上具有明显差异。
（2）HN-2LPA基因与FZB42编码蛋白的结构预测比较
在I-TASSER模拟产生的大量结构构象中通过使用SPICKER程序根据成对结构相似性聚集所有构象，获得五个型号对应于五个最大的结构集群。根据在这些品质之间观察的相关性，基于C评分和蛋白质长度估计TM评分和RMSD，筛选出有较高C分数的具有较高置信度的模型（如下图）。比较lpa基因和sfp基因编码蛋白质的蛋白质立体结构，可以发现立体结构中同样存在较大差异（如白色框中所示），这说明lpa基因可以编码不同于sfp基因编码的蛋白质，二者存在明显差别。
五、HN-2发酵液提取物的制备
将保存的生防菌菌株HN-2接种于LB培养基上28℃活化培养，培养2天，挑取适量生防菌HN-2加入到液体的LB培养基中，摇床28℃，180转每分钟摇菌48小时，即得到发酵液，利用高速离心机，10000转每分钟离心10分钟去除菌体，保留上清液即得无菌体发酵液。
按无菌体发酵液与正丁醇为1:1的比例加入正丁醇，使两种溶液充分混合后静止过夜（12小时），用分液漏斗萃取得到上层正丁醇，利用旋转蒸发仪，蒸出有机溶剂正丁醇即得到发酵液提取物（即脂肽类粗提物）。制得的发酵液提取物利用冷冻干燥机进行干燥得到干粉末再进行保存。
六、HN-2发酵液提取物诱导烟草防卫反应试验
待三生烟生长至7-8周时，挑选长势良好的植株作为试验对象。用石英砂摩擦的方法接种烟草花叶病毒。实验组分为将提取物(100μL，终浓度50 mg/mL)均匀涂抹在叶片上，30min后接种TMV病毒、涂抹提取物1h后接种 TMV病毒、接种TMV病毒后立即涂抹提取物、接种TMV病毒30min后涂抹提取物和接种TMV病毒后1h涂抹提取物，共五组。对照组为只涂抹无菌水、只涂抹提取物和只接种TMV病毒三组。72h后观察叶片情况。试验结果表明：在叶片上先涂抹HN-2发酵液正丁醇提取物后接种TMV病毒和先接种TMV病毒后涂抹HN-2发酵液正丁醇提取物的试验组其病斑均有不同程度的减少。而且先涂抹HN-2发酵液正丁醇提取物再接种TMV的试验组其病斑较其他试验组减少更为明显，且提取液与TMV时间间隔1h的试验组比时间间隔为30min的试验组病斑明显减少。说明生防菌HN-2发酵液的正丁醇提取物对TMV具有显著的预防和治疗作用，并且在TMV病毒侵染时起到的预防保护作用远远大于其治疗作用，可诱导烟草防卫反应，提高烟草对TMV的抵抗力。若制成药剂，可在烟草幼苗期进行喷洒以起到保护作用(数据见表3和图8)。
表3：发酵液提取物诱导烟草防卫
方式 病斑数
无菌水 0
只涂抹提取物 0
TMV 115
先TMV30min+提取物 23
先提取物30min+TMV 16
先提取物1h+TMV 5
七、Luria-Bertani培养基成本核算
Luria-Bertani（LB）培养基配方（1L）：胰蛋白胨（索莱宝）10g，酵母粉（索莱宝）5g，NaCl（广化）10g，pH7.0。胰蛋白胨（索莱宝，500g）180元，酵母粉（索莱宝，500g）200元，NaCl（广化）15元，1L Luria-Bertani培养基：胰蛋白胨3.6元，酵母粉2元，NaCl0.3元，合计5.9元，可得脂肽类提取物157mg，即0.038元/mg。而常用的Landy培养基由于组分过多需要的药品药剂多，经核算1L需要成本9.8元，提取的脂肽类物质210mg，即0.046元/mg。两者活性无差别。综上所述：Luria-Bertani培养基发酵得到的脂肽类物质最为经济。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高效产脂肽类物质的生防菌，其特征在于：为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）HN-2，于2018年06月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO: M 2018382。
2.如权利要求1所述的高效产脂肽类物质的生防菌的发酵工艺，包括以下步骤：
将权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌HN-2加入到液体的LB培养基中，摇床26-30℃，150-200r/min摇菌1-3天，即得到发酵液。
3.如权利要求1所述的高效产脂肽类物质的生防菌的发酵工艺，其特征在于，还包括活化前处理：将权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌HN-2先接种于LB培养基上25-30℃活化培养1-3天；所述的LB培养基配方为（1L）：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，pH7.0。
4.一种提取如权利要求2-3中任一项中制得的贝莱斯芽孢杆菌HN-2发酵液中提取物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
取权利要求2-3中任一项制得的贝莱斯芽孢杆菌HN-2的发酵液，发酵液离心去除菌体，保留上清液即无菌体发酵液；无菌体发酵液加入正丁醇萃取，取上层正丁醇层，去除正丁醇，干燥，即得。
5.如权利要求4所述的提取方法，其特征在于，发酵液离心条件为：10000转每分钟离心10分钟；无菌体发酵液与加入的正丁醇的体积比为1:1；所述的干燥方法为冷冻干燥。
6.如权利要求4的提取方法制得的贝莱斯芽孢杆菌HN-2发酵液提取物在制备诱导烟草提高对烟草花叶病毒抗性的制剂上的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：使用时，将贝莱斯芽孢杆菌HN-2发酵液提取物溶解后，在未烟草感染病毒，喷洒烟草叶片上。
8.如权利要求4的提取方法制得的贝莱斯芽孢杆菌HN-2发酵液提取物在制备防治烟草花叶病毒抗性的制剂上的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：在防治烟草花叶病毒时，将贝莱斯芽孢杆菌HN-2发酵液提取物溶解后，在烟草感染病毒之后，喷洒烟草叶片上。
10.如权利要求7或9所述的应用，其特征在于：喷洒时，贝莱斯芽孢杆菌HN-2发酵液提取物的浓度为50 mg/mL。
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